Этапы выделения чистой культуры микроорганизмов

Этапы выделения чистых культур микроорганизмов

Выделение чистой культуры аеробних микроорганизмов состоит из ряда этапов.

В первый день (1 этап исследования) в стерильную посуду (пробирка, колба, флакон) забирают патологический материал. Его изучают за внешним видом, консистенцией, цветом, запахом и другим признаками, готовят мазок, красят и исследуют под микроскопом. В некоторых случаях (острая гонорея, чума) на этом этапе можно поставить предыдущий диагноз, а кроме того, подобрать среды, на которые будет засеваться материал. Занял проводят бактериологической петлей (применяется чаще всего), с помощью шпателя за методом Дригальского, ватно-марлевым тампоном. Чашки закрывают, переворачивают вверх дном, подписывают специальным карандашом и ставят в термостат при оптимальной температуре (37 °С) на 18-48 год. Цель этапа – получить изолированные колонии микроорганизмов.

Однако, порой с целью нагромождения материала его засевают на жидкие питательные среды.

На второй день (2 этап исследования) на поверхности плотной питательной среды микроорганизмы образуют сплошной, густой рост или изолированные колонии. Колония – это видимые невооруженным глазом скопления бактерий на поверхности или в толще питательной среды. Как правило, каждая колония формируется из потомков одной микробной клетки (клоны), потому их состав достаточно однороден. Особенности роста бактерий на питательных средах являются проявлением их культуральных свойств.

Чашки тщательным образом рассматривают и изучают изолированные колонии, которые выросли на поверхности агара. Обращают внимание на величину, форму, цвет, характер краев и поверхности колоний, их консистенцию и другие признаки. При потребности исследуют колонии под лупой, малым или большим увеличением микроскопа. Структуру колоний исследуют в проходном свете при малом увеличении микроскопа. Они могут быть гиалинови, зернистые, нитевидные или волокнистые, которые характеризуются наличием переплетенных нитей в толще колоний.

Характеристика колоний – важна составная часть работы бактериолога и лаборанта, ведь микроорганизмам каждого вида присущи свои особенные колонии.

Характеризовать колонии можно за разными признаками. За величиной (диаметром) их разделяют на больших (4-6 мм и больше), средних (2-4 мм), мелких (1-2 мм), карликовых или точечных (меньше 1 мм). Форма колоний может быть самой разнообразной: правильно круглая, неправильная (амебоподибна), ризоидна. Они бывают прозрачными, что пропускают светло, и мутными.

За рельефом и контуром формы в вертикальном разрезе колонии разделяются на плоских, выпуклых, куполообразных, краплеподибни, конусообразные,плоскоопукли, плоские, что стелются по поверхности среды, с вдавленным центром, из припиднятою в виде соска серединой.

Поверхность колоний может быть матовой или блестящей, с глянцем, сухой или влажной, гладкой и блестящей или шершавой. Гладкие и блестящие колонии помечают как S-формы (smooth – гладкий и блестящий), а шершавые – R-формы (rough – шершавый, неравный).

Форма шершавых поверхностей также может быть разнообразной: морщинистой, гирозной, бородавчатой, шагреневой, иметь радиальную исчерченность и тому подобное.

Подавляющее большинство микроорганизмов образуют бесцветные колонии или мутно молочного цвета. Однако некоторые из них формируют цветные колонии. Их цвет определяется пигментом, который синтезируют бактерии: белые, кремовые, желтые, золотистые, синие, красные и тому подобное.

При доторканни к колонии петлей можно определить ее консистенцию: пастообразная, вязкая или слизистая, сухая, хрупкая и тому подобное.

Из подозрительных колоний готовят мазки, окрашивают за методом Грамма для изучения морфологических и тинкториальних свойств возбудителей, исследуют подвижную бактерий в “висячей” или “раздавленой” капле. Эти признаки имеют чрезвычайно большое диагностическое значение при характеристике отдельных видов микроорганизмов.

Остатки исследуемых колоний осторожно, не касаясь других, снимают из поверхности среды и засевают на скошенный агар или на секторы чашки Петри с питательной средой для получения чистой культуры. Пробирки или чашки с  посевами помещают в термостат при оптимальной температуре на 18-24 год.

Сегодня, как правило, бактериологи пытаются пользоваться стандартными сухими питательными средами, которые выпускает микробиологическая промышленность. Такие среды позволяют существенно улучшить результаты микробиологических исследований и стандартизировать их.

На жидких питательных средах бактерии также могут расти по-разному, хотя особенности проявлений роста более бедны, чем на плотных.

Бактерии способны вызывать диффузное помутнение среды, цвет его при этом может не изменяться или приобретает цвет пигмента. Такой характер роста чаще всего наблюдается в большинстве факультативно анаэробных микроорганизмов.

Порой происходит образование осадка на дне пробирки. Он может быть крошкообразным, гомогенным, вязким, слизистым и др. Среда над ним может оставаться прозрачной или становиться мутной. Если микробы пигмента не образуют, осадок имеет сирувато-билий или желтоватый цвет. Подобным чином растут, как правило, анаэробные бактерии.

Пристеночный рост проявляется образованием хлопьев, зерен, прикрепленных к внутренним стенкам пробирки. Среда при этом остается прозрачной.

Аеробные бактерии имеют тенденцию к поверхностному росту. Часто образуется нежная бесцветная или голубоватая пленка в виде едва заметного налета на поверхности, которая исчезает при стряхивании или взбалтывании среды. Пленка может быть влага, толстая, иметь вязанку, слизистую консистенцию и прилипать к петле, тянется за ней. Однако, встречается и плотная, сухая, хрупкая пленка, цвет которой зависит от пигмента, который производится микроорганизмами.

В случае необходимости изготовляется мазок, окрашивается, исследуется под микроскопом, а микроорганизмы засеваются петлей на поверхность плотной питательной среды для получения изолированных колоний.

На третий день (3 этап исследования) изучают характер роста чистой культуры микроорганизмов и проводят ее идентификацию.

Сначала обращают внимание на особенности роста микроорганизмов на среде и делают мазок, крася его за методом Грама, с целью проверки культуры на чистоту. Если под микроскопом наблюдают бактерии однотипной морфологии, размеров и тинкториальних (способность краситься) свойств, делают вывод, что культура чиста. В некоторых случаях уже за внешним видом и особенностями их роста можно сделать вывод о виду выделенных возбудителей. Определение вида бактерий за их морфологическими признаками называется морфологической идентификацией. Определения вида возбудителей за их культуральными признаками называют культуральной идентификацией.

Однако этих исследований недостаточно, чтобы сделать окончательный вывод о виду выделенных микробов. Потому изучают биохимические свойства бактерий. Они достаточно разнообразны.

Чаще всего исследуют сахаролитические, протеолитические, пептолитические, гемолитические свойства, образования ферментов декарбоксилаз, оксидазы,каталазы, плазмокоагулазы, ДНК-азы, фибринолизина, восстановление нитратов в нитриты и тому подобное. Для этого существуют специальные питательные среды, которые засевают микроорганизмами (пестрый ряд Гисса, МПБ, свернутая сыворотка, молоко и др.).

Определение вида возбудителя за его биохимическими свойствами называется биохимической идентификацией.

Для исследования способности бактерий расщеплять белки (протеолитические свойства) используют молоко или среду с желатином. Протеолиз в молоке выражается растворением сгустка казеина, который образован бактериями, которые свертывают молоко.

Среды с желатином готовят на мясной воде, добавляя 1 % пептону, 0,5 % хлориду натрия и 10-20 % желатину. Занял делают уколом. Протеолиз проявляется разжижением столбика среды. Поскольку некоторые виды бактерий отличаются за особенностями разжижения желатина, этот признак можно учитывать при их идентификации.

Пептолитические свойства (способность расщеплять пептоны – продукты неполного гидролиза белка) обнаруживают с помощью МПБ и пептонной воды. Их засевают микроорганизмами, а затем определяют образование конечных продуктов – аммиаку, сероводороду и индолу. Для нахождения аммиака в пробирку вставляют и притискивают пробкой красную лакмусовую бумажку. В атмосфере аммиака он приобретает синюю расцветку. Индикатором на сероводород является раствор ацетата свинца, который при аналогичных условиях определения окрашивает фильтровальную бумагу, смоченную индикатором, в черный цвет за счет образования сульфида свинца.

Индол можно обнаружить с помощью полоски фильтровальной бумаги, смоченной 12 % раствором щавелевои кислоты. За наличием индолу бумажка приобретает розовый цвет. Чувствительнее является метод Ерлиха. Согласно с общепринятым методом пробкой пробирки притискивают бумажку, пропитанную специальным индикатором (спиртной раствор парадиметиламидобензальдегиду). При наличии индолу цвет его изменяется на сиренево розовый или малиновый. В другом варианте определения индолу до 48-часовой бульйоннои культуры бактерий добавляют 1-2 мл серного эфира, а затем – реактив Эриха. В нижней части слоя эфира за 1-2 мин появляется яркое малиновое кольцо.

В микробиологической практике широко используются дифференциально диагностические среды Ендо, Левина, Плоскирева, которые позволяют обнаружить разложение лактозы бактериями. Они позволяют проводить первичную дифференциацию бактерий кишечного тракта, что чрезвычайно важно для быстрого выделения чистых культур с их следующей идентификацией. Эти среды есть елективними для многих представителей семьи кишечных бактерий. Выпускаются они в сухом виде, потому их приготовление в лабораториях не нуждается в затрате времени.

Среда Эндо состоит из сухого питательного агара, 1 % лактозы и индикатора фуксина, обесцвеченного раствором сульфита натрия. Свежая среда имеет слабую розовую расцветку. При росте лактозопозитивних микроорганизмов, тех, которые расщепляют лактозу (E. coli), их колонии окрашиваются в темно-красный цвет с металлическим блеском. Колонии лактозонегативних микробов (сальмонели, шигели) на этой среде бесцветны.

В состав среды Левина также входит МПА, лактоза, одинзамещенный фосфат калия, индикаторы метиленовий синей, эозин. Нативне среда имеет фиолетовый цвет. Колонии лактозопозитивных бактерий имеют темно-синюю расцветку, а лактозонегативные – розовый оттенок.

Сухой бактоагар Плоскирева (Бактоагар Же) содержит в составе агар с солями желчных кислот лактозу, цитрат натрию, гипосульфит, фосфат натрия,брильянтовый зеленый, соду кальцинированную, йод и нейтральный красный. Микроорганизмы, которые расщепляют лактозу, образуют колонии розового цвета, а те, что ее не ферментируют – бесцветные.

В микробиологической практике часто возникает потребность исследовать ферментацию не только одного, а нескольких цукрив сразу. С этой целью используют среды Гисса. Они могут иметь жидкую и полужидкую консистенцию.

Основой жидкой среды является 1 % пептонная вода с 0,5 % натрию хлорида, 1 % углеводов (глюкозы, мальтозы, лактозы, сахарозы, манниту и др.). К нему добавляют индикатор Андреде (кислый фуксин в 1 н растворе NаOH). Устанавливают рН 7,2, при нем среда имеет желтый цвет. Среды с разными углеводами разливают в отдельные пробирки, в которые устанавливают поплавок – запаянную из одного конца стеклянную трубочку длиной 3 см открытым концом книзу. Стерилизуют парой под давлением 0,5 атм 15 мин.

После посева бактерий, если они ферментируют углеводы, наблюдают появление красной расцветки, которая свидетельствует об изменении рН в кислую сторону (образование кислоты), а порой из поплавка вытесняется жидкость. Тогда делают вывод об образовании газа. Следовательно, возможны три варианта при учете результатов посева на середовише Гисса: микроорганизмы не ферментируют  субстрату (негативный ответ) или бактерии раскладывают углеводы (позитивный ответ) с образованием кислоты без газа или кислоты и газа.

Учитывая, что микроорганизмы по-разному действуют на углеводы (разлагают или не разлагают), при конечном учете результатов наблюдают пробирки с измененным или неизмененным цветом жидкости. Это создает впечатление пестрости, а такой ряд называют пестрым рядом Гисса.

В настоящий момент в большинстве случаев пользуются набором сухих сред для определения цукролитичних ферментов, из которых готовят полужидкие пестрые ряды. В отличие от предыдущей группы, в их состав входят индикаторы ВР (смесь водного голубого с розоловою кислотой) или бромтимоловий синей илибромкрезоловий пурпурный. При наличии газа наблюдаются пузырьки или разрывы питательной среды в толще агара. При пидкисленни среды с индикатором ВР оно становится синим, а при пидлужнюванни – красным (бромкрезоловий пурпурный при образовании кислоты дает кое-что фиолетовая и лимонно-желтая расцветка, а бромтимоловий синей – зеленкувате или лимонное). В щелочной среде они имеют соответственно интенсивно фиолетовый и синий цвет с зеленкуватимбликом.

Выпускаются также сухие среды Рессела и сахарный агар с мочевиной Олькеницкого.

Среда Рессела является полужидким агаром с лактозой (1 %) и глюкозой (0,1 %) и индикатором ВР. После разливания его в пробирки их кладут так, чтобы образовался столбик агара и была скошена поверхность. Микроорганизмы засевают петлей сначала уколом в столбик, а затем по скошенной поверхности. Если бактерии ферментируют  лактозу и глюкозу, наблюдают изменение цвета (подкисление) всей среды на синей. Если микробы способны метаболизировать только глюкозу, в этом случае изменяет цвет столбик среды. При условии образования газа наблюдают за появлением его пузырьков или разрывами агара.

Трисахарный агар с мочевиной Олькеницкого – более сложная среда сравнительно с предыдущим. Он позволяет определить ферментацию лактозы, сахарозы, глюкозы, образования сероводорода и наличие у бактерий фермента уреазы. В состав среды соответственно вводят сухой питательный агар, лактозу, сахарозу, глюкозу, комплексную соль аммоний-железо сульфат, тиосульфат натри, мочевину, индикатор феноловый красен. Готовая среда имеет бледно-розовый цвет.

При расщеплении сахаров феноловый красный окрашивает среду в желтый цвет. Поскольку глюкоза, имеющаяся в небольших концентрациях (0,1 %), в аэробныхусловиях (скошенная поверхность) бактерии полностью будут утилизировать ее за первые часы роста. Через 18-24 год они потребляют и пептоны как белковую питательную основу. При этом образуется аммиак, который делает среду щелочной, предоставляя ей красного цвета. Однако в столбике агара желтый цвет остается, потому что там сохраняются кислые конечные продукты, которые обеспечивают низкий уровень рН.

Энтеробактерии, которые разлагают лактозу и глюкозу, подкисляют среду во всей пробирке (желтый цвет столбика и скошенной поверхности). Поскольку лактозы (1 %) в 10 раз больше, чем глюкозы, через 18-24 год инкубации ее запасы еще не исчерпаны, потому сохраняется желтый цвет среды. Однако через 48 год за счет расщепления пептонов можно наблюдать за его покраснением (сдвиг рН в щелочную сторону).

Если бактерии образуют газ (углекислый, водород) при ферментации сахаров, появляются разрывы среды или происходит скопление газа на дне, который поднимает агар в пробирке.

Сероводород микробы образуют из неорганических соединений, благодаря ферменту тиосульфатредуктазе. Взаимодействуют с сероводородом соли железа, которые, вступая с ним в реакцию, образуют сульфид железа в виде нерастворимого преципитата черного цвета в столбике.

Уреаза, которую продуцируют бактерии, разрушает мочевину с выделением большого количества аммиаку, под воздействием которого вся среда алеет. Потому при наличии уреазопозитивних штаммов провести учет ферментации цукрив невозможно. В таких случаях необходимо использовать другие среды.

За последние годы в практике микробиологических лабораторий начали использовать специальные тест-системы для определения разнообразных свойств бактерий: “Roche”, “API”, “Enterotest”, пластины и диски индикаторные биохимические. Они удобны для пользования, надежные, позволяют определять 12-20 и больше разнообразных признаков, значительно облегчить идентификацию микробов.

Гемолитическая активность микроорганизмов является одним из самых существенных признаков их вирулентности, потому ее определение стало рутинной процедурой любой специализированной лаборатории. С этой целью используют кровяной МПА. Его готовят из растопленного и охлажденного до 45-50 °С питательного агара, к которому добавляют 5-10 % дефибринованои или свежей крови животного (барана или кролика). Агар с кровью тщательным образом перемешивают, не допуская образования пены, и разливают в чашки Петри. Если бактерии продуцируют гемолизини, вокруг колоний или штрихов посева образуются зоны просветления на матовом красном фоне . По цвету гемолиза (бесцветный, зеленоватый) можно определить тип гемолизинов (альфа-, бета-, гамма-, дельта- и тому подобное).

Чтобы обнаружить липолитические свойства микробов, в состав питательных сред вводят липиды или жироподобные субстанции – твини. Бактерии при таких условиях образуют радужные венчики вокруг колоний при расщеплении липидов.

Редуцирующие свойства изучают, добавляя в состав сред красители (метиленовий синей, например), которые способны возобновляться. Фиксируя время изменения цвета индикатора, можно судить о степени выражение редуцирующей активности.

Декарбоксилазную активность бактерий оценивают на специальных средах с аминокислотами (лизином, орнитином, глютаминовой кислотой и др.) и соответствующими индикаторами.

С целью установления видовой принадлежности бактерий часто изучают их антигенное строение, то есть проводят идентификацию за антигенными свойствами. Каждый микроорганизм имеет в своем составе разные антигенные субстанции. В частности, представители семьи ентеробактерий (ешерихии, сальмонели, шигели) содержат оболочковый О-антиген, джгутиковий Н-антиген и капсульный К-антиген. Они неоднородны за своим химическим составом, потому существуют во многих вариантах. Их можно определить с помощью специфических аглютинуючих сывороток. Такое определение вида бактерий носит название серологическойидентификации. Ее относят к одному из главных методов установления вида выделенной культуры. Чаще всего используется ориентировочная реакция агглютинации на стекле. С этой целью на предметное скельце наносят разные диагностические сыворотки (против отдельных возбудителей или их антигенов), а затем в каждую каплю вносят стерильной петлей небольшое количество чистой культуры. За несколько минут наблюдают за феноменом агглютинации. Образованиеаглютинату (хлопьев) свидетельствует о гомологичнисть антигенов возбудителя и антител диагностической сыворотки, что позволяет определить вид инфекционного агента. При наличии позитивной ориентировочной реакции агглютинации ее ставят в развернутом варианте (реакция агглютинации Грубера).

При некоторых инфекционных заболеваниях (дифтерия) идентификацию проводят за токсигенными свойствами микробов. Метод основывается на определениитоксигенной активности коринебактерий дифтерии с помощью реакции преципитации. Образование линий преципитации между колониями токсигенних штаммов и бумажкой, пропитанной антитоксинной сывороткой, свидетельствует о позитивной реакции.

Иногда идентификацию бактерий проводят, заражая лабораторных животных чистой культурой и наблюдая за теми изменениями, которые вызывают возбудители в организме (туберкулез, ботулизм, столбняк, сальмонеллез и тому подобное). Такой метод называют идентификацией по биологическими свойствами. Как объекты – чаще всего используют гвинейских свинок, белых мышей и крыс.

Очень важным при выделении микроорганизмов является определение их чувствительности к антибиотикам с целью выбора оптимального препарата для лечения. Чаще всего пользуются методом стандартных дисков (метод диффузии в агар, диско-дифузийний метод). Для этого на поверхность специальной плотной питательной среды в чашках Петри засевают культуру микроорганизмов и налагают бумажные диски, пропитанные разными антибиотиками. Посевы инкубируют при оптимальной температуре 18-24 год и измеряют зоны задержки роста бактерий вокруг дисков с антибиотиками. За размерами этих зон определяют принадлежность бактерий к чувствительным, умеренно резистентным или стойким штаммам.

На основании изучения морфологических, культуральных, биохимических, антигенных, биологических и других свойств микробов делают окончательный вывод об идентификации. Например: “Выделено Escherichia coli” или “Выделенный возбудитель принадлежит к виду Staphylococcus epidermidis”.

Запомните этапы выделения чистых культур аеробних бактерий:

1 - макро- и микроскопическое изучение  исследуемого  материала  и посев на плотные питательные среды для получения изолированных колоний.

2 - макро- и микроскопическое изучение колоний и пересев их на скошенный агар для получения чистой культуры;

3 - проверка культуры на чистоту и ее идентификация;

4 - вывод о выделенной культуре.

Чистая культура бактерий и методы ее выделения

Методы выделения чистых культур микроорганизмов

Культивирование микроорганизмов, помимо состава питательной сре­ды, зависит от физических и химических факторов (температура, кислотность, аэрация, свет и т. д.). При этом количественные показатели каждого из них неодинаковы и определяются особенностями метаболиз­ма каждой группы бактерий. Существуют методы культивирования мик­роорганизмов на твердых и в жидких питательных средах в аэробных, анаэробных и других условиях.

Методы выделения чистых культур аэробных микроорганизмов. Для того, чтобы получить изолированные колонии, при нанесении материал распределяют так, чтобы клетки бактерий были удалены друг от друга. Для получения чистой культуры используют две основные группы методов:

а) мето­ды, основанные на принципе механического разделения микроорганизмов;

б) методы, основанные на биологиче­ских свойствах микроорганизмов.

Методы, основанные на принципе механического разде­ления микроорганизмов

Рассев шпателем по Дригальскому. Берут 3 чашки Петри с питательной средой. На 1-ю чашку петлей или пипеткой наносят кап­лю исследуемого материала и растирают шпателем по всей поверхности питательного агара. Затем шпатель пе­реносят во 2-ю чашку и втирают оставшуюся на шпателе культуру в поверхность питательной среды. Далее шпа­тель переносят в 3-ю чашку и аналогичным образом про­изводят посев. На 1-й чашке вырастает максимальное количество колоний, на 3-й — минимальное. В зависимо­сти от содержания микробных клеток в исследуемом ма­териале на одной из чашек вырастают отдельные коло­нии, пригодные для выделения чистой культуры микро­организма.

Метод Пастера (метод разведений). Из исследуемого материала готовят ряд последовательных, чаще десятикратных серийных разведений в жидкой стерильной среде или физиологическом растворе в пробирках. Далее высевают материал газоном по 0,5 мл из каждой пробирки. Предполагают, что в какой-то из пробирок останется количество микроорганизмов, поддающихся подсчету при высеве на пластинчатые среды. Этот метод дает возможность подсчитать микробное число в исследуемом материале. (Микробное число — количество колоний на последней чашке с ростом микроорганизмов, умноженное на степень разведения материала).

Рассев петлей (посев штрихами). Берут одну чашку Петри с питательным агаром и делят ее на 4 сектора, проводя разграничительные линии на внешней стороне дна чашки. Исследуемый ма­териал петлей вносят в первый сектор и проводят ею па­раллельные линии по всему сектору на расстоянии одна от другой около 5 мм. Этой же петлей, не изменяя ее положения по отношению к агару, проводят такие же линии на других секторах чашки. В том месте, где на агар попало большое количество микробных клеток, рост микроорганизмов будет в виде сплошного штриха. На секторах с небольшим количеством клеток вырастают отдельные колонии. Кроме того, можно наливать разведен­ные растворы смешанной культуры на поверхность твер­дых сред в чашках.

Метод фильтрации. Основан на пропускании исследуемого материала через специальные фильтры с определенным диаметром пор и разделении содержа­щихся микроорганизмов по величине. Этот метод при­меняется главным образом для очистки вирусов от бак­терий, а также при получении фагов и токсинов (в фильтрате — чистый фаг, очищенный токсин).

Методы, основанные на биологических свойствах мик­роорганизмов

Создание оптимальных условий для размножения

• Создание оптимального температурного режима для избирательного подавления размножения сопутствующей микрофлоры при низкой температуре и получения культур психрофильных или термофильных бактерий. Большинство микробов неплохо развиваются при 35-37°С, иерсинии хорошо растут при 22°С, лептоспиры культивируют при 30°С. Термофильные бактерии растут при температурах, лежащих за пределами температурных режимов прочих сопутствующих видов бактерий (так, кампилобактер культивируют при 42°С).
• Создание условий для аэробиоза или анаэробиоза. Большинство микроорганизмов хорошо растут в присутствии атмосферного кислорода. Облигатные анаэробы растут в условиях, исключающих присутствие атмосферного кислорода (возбудители столбняка, ботулизма, бифидумбактерии, бактероиды и др.). Микроаэрофильные микроорганизмы растут только при низком содержании кислорода и повышенном содержании СО2 (кампилобактер, геликобактер).
• Метод обогащения. Исследуемый материал за­севают на элективные питательные среды, способствую­щие росту определенного вида микроорганизмов.

Метод Пастера (метод предельных разведений).Заключается в том, что из исследуемого материала делают ряд последовательных разведений в жидкой питательной среде. Для этого каплю посевного материала вносят в пробирку со стерильной жидкой средой, из нее каплю переносят в следующую пробирку и так засевают до 8…10 пробирок. С каждым разведением количество микробных клеток, попадающих в среду, будет уменьшаться и можно получить такое разведение, в котором во всей пробирке со средой будет находиться только одна микробная клетка, из которой разовьется чистая культура микроорганизма.

Так как в жидких средах микробы растут диффузно, т.е. легко распределяются во всей среде, то изолировать одну микробную клетку от другой трудно. Таким образом, метод Пастера не всегда обеспечивает получение чистой культуры. Поэтому в настоящее время этот метод используется, главным образом, для предварительного уменьшения концентрации микроорганизмов в материале перед посевом его в плотную среду для получения изолированных колоний.

Методы механического разделения микроорганизмов с использованием плотных питательных сред.К таким методам относятся метод Коха и метод Дригальского.

Метод Коха (метод глубинного посева).

Исследуемый материал вносят бактериологической петлей или пастеровской пипеткой в пробирку с расплавленной плотной питательной средой. Равномерно размешивают содержимое пробирки, вращая ее между ладонями. Каплю разведенного материала переносят во вторую пробирку, из второй – в третью и т.д. Содержимое каждой пробирки, начиная с первой, выливают в стерильные чашки Петри. После застывания среды в чашках, их помещают в термостат для культивирования.

Для выделения анаэробных микроорганизмов по методу Коха необходимо ограничить доступ кислорода к культуре.

С этой целью поверхность глубинного посева в чашке Петри заливают стерильной смесью парафина и вазелина (1:1). Можно также оставлять посевной материал, тщательно перемешанный с агаризованной средой, непосредственно в пробирке.

Ватную пробку при этом заменяют резиновой или заливают поверхность агара смесью парафина и вазелинового масла. Чтобы извлечь выросшие колонии анаэробных микроорганизмов, пробирки слегка нагревают, быстро вращая над пламенем горелки. Агар, прилегающий к стенкам, расплавляется, и столбик легко выскальзывает в подготовленную чашку Петри. Далее столбик с агаром разрезают стерильным скальпелем, колонии извлекают стерильной петлей или стерильной капиллярной рубкой и переносят в жидкую среду.

Метод Дригальского основан на механическом разделении микробных клеток на поверхности плотной питательной среды в чашках Петри.

Каждая микробная клетка, фиксируясь в определенном месте, начинает размножаться, образуя колонию.

На поверхность среды вносят каплю исследуемого материала.

Затем с помощью стерильного шпателя эту каплю распределяют по всей питательной среде (посев газоном).

Посев также можно проводить штрихом, используя бактериологическую петлю. Этим же шпателем или петлей осуществляют посев во вторую, третью и т.д. чашки. Как правило, в первой чашке после культивирования посева появляется рост микробов в виде сплошного налета, в последующих чашках содержание микроорганизмов снижается и образуются изолированные колонии, из которых отсевом можно легко выделить чистую культуру.

Таким образом, в первых секторах получается сплошной рост, а вдоль последующих штрихов вырастут обособленные колонии, представляющие собой потомство одной клетки.

В целях экономии сред и посуды можно пользоваться одной чашкой, разделив ее на сектора, и последовательно засевать их штрихом (метод истощающего штриха).

Для этого материал берут петлей и проводят ею ряд параллельных штрихов сначала по поверхности первого сектора, а затем последовательно оставшимися на петле клетками засевают все другие сектора.

При каждом последующем штрихе происходит уменьшение количества засеваемых клеток.

Метод выделения чистых культур с помощью химических веществ используется при изолировании культур микроорганизмов, устойчивых к определенным химическим веществам.

Например, с помощью этого метода можно выделить чистую культуру туберкулезных микобактерий, устойчивых к действию кислот, щелочей и спирта. В этом случае исследуемый материал перед посевом заливают 15 % раствором кислоты или антиформином и выдерживают в термостате в течение 3…4 часов.

После воздействия кислоты или щелочи клетки туберкулезной палочки остаются живыми, а все другие микроорганизмы, содержащиеся в исследуемом материале, погибают. После нейтрализации кислоты или щелочи обработанный материал высевают на плотную среду и получают изолированные колонии возбудителя туберкулеза.

Биологические методы выделения чистых культур патогенных микроорганизмов основаны на заражении исследуемым материалом лабораторных животных, восприимчивых к данному виду возбудителя.

Если патогенный микроорганизм содержится в исследуемом объекте, то лабораторное животное заболевает и погибает. После вскрытия павшего животного из внутренних органов делают посевы на специальные среды, на которых вырастают чистые культуры выделяемых микробов.

Выделение чистой культуры бактерий

Чистой называют культуру, содержащую микроорганизмы одного вида и полученную как потомство одной клетки. Чистые культуры можно получить из исходной микробной клетки, изолиро­ванной при помощи микроманипулятора, или из изолированных колоний путем их пересева в отдельные пробирки с питательной средой.

Для выделения чистой культуры используют следующие методы.

1. Метод Дригалъского.При этом методе расплавленную питательную среду разливают в 3 чашки Петри. В первую чашку вносят одну каплю исследуемого материала и сте­рильным шпателем распределяют его по поверхности питательной среды. Затем шпатель переносят во вторую и далее в третью чашки, втирая в поверхность питательных сред оставшийся на нем материал.

При посеве этим методом на второй и на третьей чашках вырастают изолированные колонии. Полученные отдельные колонии пересевают в пробирки с питательной средой для получения чистой культуры микроорганизма.

2. Метод параллельных штрихов.При этом способе материал с помощью бактериологической петли распределяют по поверхности агара параллельными штрихами в одном направлении.

Затем, повернув чашку на 90°, проводят штрихи в направлении, перпендикулярном первым штрихам. При таком способе посева материал, находящийся в петле, расходу­ется постепенно, и по линиям штрихов, нанесенных в конце посева, вырастают изолированные колонии микробов.

3. Метод Коха (метод рассева в глубине среды).При этом методе в пробирку с агаром, расплавленным и остуженным до 43-45°С, вносят одну бактериологическую петлю исследуемого материала и тщательно перемешивают.

После этого из этой пробирки одну петлю материала переносят во вторую пробирку, а затем из нее – в третью пробирку. Приготовленные разведения бактерий выливают из пробирок в стериль­ные чашки Петри. После застывания среды чашки помещают в термостат. Количество колоний в чашках с питательной средой уменьшается по мере разведения материала.

Контрольные вопросы по теме занятия:

1. Характер роста бактерий в жидких, на полужидких и плотных питательных средах.

2. Характеристика колоний микроорганизмов.

3. Пигменты бактерий и их роль для микроорганизмов.

4. методы выделения чистых культур бактерий.

Литература для подготовки к занятию:

Основная литература:

1. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. Под ред. А.А.Воробьева. М., 2004.

Дополнительная литература:

1. Л.Б. Борисов. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. М., 2002.

2. О.К. Поздеев. Медицинская микробиология.М., ГЭОТАР-МЕДИА, 2005.

3. Медицинская микробиология. Справочник. Под ред. В.И. Покровского и О.К. Поздеева. М., ГЭОТАР-МЕД, 1998.

ЗАНЯТИЕ 5

ТЕМА ЗАНЯТИЯ: Ферменты бактерий. Изучение ферментативной активности микроорганизмов. Дыхание бактерий. Методы культивирования и выделения чистой культуры анаэробов.

УЧЕБНАЯ ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ: Ознакомиться с ферментами бактерий.

Изучить методы определения ферментативной активности микроорганизмов. Ознакомиться с процессами дыхания бактерий. Изучить методы культивирования и выделения чистой культуры анаэробов.

ЗАДАЧИ ЗАНЯТИЯ:

1. Ознакомиться с ферментами бактерий.

2. Изучить методы определения ферментативной активности микроорганизмов.

3. Ознакомиться с процессами дыхания бактерий.

4. Изучить методы культивирования и выделения чистой культуры анаэробов.

Ферменты бактерий

Все биохимические процессы в клетке микро­организмов, связанные с метаболизмом, ростом и размножением, совершаются при участии ферментов (энзимов).

Ферменты синтезируются самой микробной клеткой, и имеют сложное строение. Они представляют собой либо только белок с высокой молекулярной массой (трипсин, пепсин и др.), либо состоят из белка (апофермента), связанного с кофактором (коферментом). Кофермент может быть низкомолекулярным неорганическим (металл) или органическим ве­ществом.

Классификация ферментов основана на типах реакций, которые они катализируют.

Все ферменты делятся на шесть классов:

1). Оксидоредуктазы — ферменты переноса электронов. Эти ферменты катализируют окис­лительно-восстановительные реакции. К ним отно­сятся дегидрогеназы (НАД, НАДФ, ФАД), каталаза, цитохромы.

2).Трансферазы — ферменты переноса групп между молекулами от одних соединений к другим. К ним относятся ацетилтрансфераза, фосфотрансфераза, аминотрансфераза.

3). Гидролазы — ферменты переноса функциональных групп с участием воды. К этому классу ферментов относятся пептидгидролазы, глюкозидаза, амилазы, эстеразы, липаза, фосфатаза.

4). Лиазы — ферменты, отщепляющие или присоединяющие без участия воды различные соединения с двойной связью.

К этим ферментам относятся пируватдекарбоксилаза, альдолаза.

5). Изомеразы — ферменты, переносящие группы внутри молекул с образованием изомерных форм. К этим ферментам относятся триизофосфатизомераза, глюкозофосфатизомераза.

6). Лигазы (синтетазы) — ферменты, объединяющие две молекулы с одновременным разрывом фосфатных связей с использованием энергии АТФ. К лигазам относятся ферменты, катализирующие синтез сложных органических веществ из простых соединений (аспарагинсинтетаза, кокарбоксилазы).

Активность ферментов измеряют в международных еди­ницах (ME). 1 ME соответствует количеству ферментов, пре­вращающему один микромоль субстрата в 1 минуту в стандарт­ных условиях.

У бактерий различают эндоферменты и экзоферменты.

Эндоферменты находятся внутри бактериальной клетки, катализиру­ют внутриклеточные процессы обмена веществ. Экзоферменты выделяются во вне­шнюю среду и выполняют функцию расщепления сложных питательных веществ.

Ферменты агрессии. У патогенных бактерий имеется особая группа экзоферментов, которые называются ферментами агрессии. Они выполняют функции облегчения проникновения и распространения бактерий в тканях организма хозяина и ослабления его защитных свойств.

К ферментам агрессии относятся: гиалуронидаза, нейраминидаза, коллагеназа, протеазы, фибринолизин, гемолизин, лейкоцидин.

Конститутивные и индуцибельные ферменты. Ферменты, которые синтезируются клеткой с постоянной скоростью, независимо от наличия субстрата в среде называются конститутивными. Индуцибельные (адаптивные) ферменты образуются только в присутствии соответствующего субстрата в сре­де.

Например, фермент бета-галактозидазаначинает синтезироваться только при добавлении в питательную среду углевода лактозы, которую этот фермент расщепляет с образованием глюкозы и галактозы.

Методы определения ферментативной активности микробов

Обязательным условием идентификации выделенной чистой культуры бактерий является определение ферментативной активности в отношении углеводов и белков (биохимический «паспорт» вида).

Для выявления ферментов, расщепляющих углеводы (сахаролитические ферменты) используют дифференциально-диагностические среды Гисса.

В состав сред Гисса входит пептонная вода, индикатор рН, поплавок для улавливания газа и один из углеводов (глюкоза, лактоза, мальтоза, маннит, сахароза, крахмал и т.д.). Если бактерии расщепляют углевод, то образуется кислота и при этом меняется цвет среды за счет находящегося в ней индикатора рН. Большинство патогенных бактерий расщепляют углеводы с образованием только кислоты; некоторые виды ферментируют углеводы с образование кислоты и газа (СО2).

При этом меняется цвет среды и в поплавке появляется пузырек газа.

Протеолитическая активность бактерий. Показателями глубокого расщепления белка является образование индола, аммиака, сероводорода. Для выявления этих газообразных веществ делают посевы чистой культуры бактерий на мясо-пептонный бульон или пептонную воду в пробирки со специальными бумажными индикаторами.

При наличии продуктов расщепления меняется цвет соответствующего индикатора.

Протеолитическую активность бактерий определяют также путем посева чистой культуры уколом в столбик желатина по наличию и характеру разжижения среды, например, в виде перевернутой елочки, гвоздя, воронки и т.д.

Энергетический метаболизм

Это совокупность биохимических реакций, результатом которых является образование (накопление энергии) и расщепление (расход энергии) макроэргических связей в молекулах АТФ.

У бактерий АТФ может синтезироваться в результате процессов брожения и дыхания.

Брожение. Более древний, низкоэффективный способ получения энергии, при котором в результате расщепления молекулы глюкозы образуется 2 молекулы АТФ. Конечными продуктами брожения являются СО2, вода, спирты и органические кислоты.

Процесс происходит без участия кислорода.

Дыханием называют процесс окислительного фосфорилирования углеводов с образованием молекул АТФ, СО2 и воды. При распаде одной молекулы глюкозы высвобождаются 12 электронов, которые проходят через цепь дыхательных ферментов, отдавая энергию для синтеза 36 молекул АТФ. Освобождение дыхательной цепи от электронов осуществляют вещества, называемые акцепторами электронов.

К таким веществам относится кислород, сульфаты, нитраты, карбонаты. Если конечным акцептором электронов служит мо­лекулярный кислород, дыхание называют аэробным. В случае конечной акцепции электронов другими соединениями дыхание называют анаэробным.

По типу дыхания бактерии классифицируют на че­тыре основные группы:

1. Облигатные (строгие) аэробырастут при свободном доступе кислорода (возбудитель ту­беркулеза).

Микроаэрофилы растут при низкой (до 1%) концентрации кислорода и повышенной концентрации углекислого газа (гемофильная палочка).

Факультативные анаэробы могут расти как в присутствии кислорода, так и в анаэробных условиях (кишечная палочка).

4. Облигатные (строгие) анаэробы могут расти только при пол­ном отсутствии кислорода в окружающей среде (возбудители столбняка, ботулизма, газовой гангрены).

Выделение чистых культур микроорганизмов

Чистой культурой называют такую культуру, которая содержит микроорганизмы одного вида. Выделение чистых культур бактерий – обязательный этап бактериологического исследования в лабораторной диагностике инфекционных болезней, в изучении микробной загрязненности различных объектов окружающей среды, и, в целом, при любой работе с микроорганизмами.

Исследуемый материал (гной, мокрота, фекалии, кровь и другой материал от больных; вода, почва, воздух, пищевые продукты, трупы животных и человека, переносчики) обычно содержит ассоциации микробов.

Выделение чистой культуры позволяет изучить морфологические, культуральные, биохимические, антигенные и другие признаки, по совокупности которых определяется видовая и типовая принадлежность возбудителя, то есть производится его идентификация.

Для выделения чистых культур микроорганизмов используют методы, которые можно разделить на несколько групп.

Метод Пастера – последовательное разведение исследуемого материала в жидкой питательной среде до концентрации одной клетки в объеме (имеет историческое значение).

2. Метод Коха («пластинчатые разводки») – последовательное разведение исследуемого материала в расплавленном агаре (температура 48-500С), с последующим разливом в чашки Петри, где агар застывает.

Высевы делают, как правило, из трех-четырех последних разведений, где бактерий становится мало и, в дальнейшем, при росте на чашках Петри появляются изолированные колонии, образующиеся из одной исходной материнской клетки. Из изолированных колоний в глубине агара получают чистую культуру бактерий пересевом на свежие среды.

Метод Шукевича – применяется для получения чистой культуры протея и других микроорганизмов обладающих «ползущим» ростом. Посев исследуемого материала производят в конденсационную воду у основания скошенного агара. Подвижные микробы (протей) способны подниматься вверх по скошенному агару, неподвижные формы остаются расти внизу на месте посева.

Пересевая верхние края культуры можно получить чистую культуру.

4. Метод Дригальского – широко применяется в бактериологической практике, при этом исследуемый материал разводят в пробирке стерильным физиологическим раствором или бульоном.

Одну каплю материала вносят в первую чашку и стерильным стеклянным шпателем распределяют по поверхности среды. Затем этим же шпателем (не прожигая его в пламени горелки) делают такой же посев во второй и третьей чашках. С каждым посевом бактерий на шпателе остается все меньше и меньше и, при посеве на третью чашку, бактерии будут распределяться по поверхности питательной среды отдельно друг от друга.

Через 1-7 сут выдерживания чашек в термостате (в зависимости от скорости роста микроорганизмов) на третьей чашке каждая бактерия дает клон клеток, образуя изолированную колонию, которую пересевают на скошенный агар с целью накопления чистой культуры.

5. Метод Вейнберга. Особые трудности возникают при выделении чистых культур облигатных анаэробов.

Если контакт с молекулярным кислородом не вызывает сразу же гибели клеток, то посев производят по методу Дригальского, но после этого чашки сразу помещают в анаэростат. Однако чаще пользуются методом разведения. Сущность его заключается в том, что разведения исследуемого материала проводят в расплавленной и охлажденной до 45-500С агаризированной питательной среде. Делают 6-10 последовательных разведений, затем среду в пробирках быстро охлаждают и заливают поверхность слоем смеси парафина и вазелинового масла, чтобы помешать проникновению воздуха в толщу питательной среды.

Иногда питательную среду после посева и перемешивания переносят в стерильные трубки Бурри или капиллярные пипетки Пастера, концы которых запаивают. При удачном разведении в пробирках, трубках Бурри, пипетках Пастера вырастают изолированные колонии анаэробов.

Чтобы изолированные колонии хорошо были видны, используют осветленные питательные среды. Для извлечения изолированных колоний анаэробов, пробирку слегка нагревают, вращая ее над пламенем, при этом агар, прилегающий к стенкам, плавится и содержимое пробирки в виде агарового столбика выскальзывает в стерильную чашку Петри.

Столбик агара разрезают стерильным пинцетом и извлекают колонии петлей. Извлеченные колонии помещают в жидкую среду, благоприятную для развития выделяемых микроорганизмов (например, среду Китта-Тароцци). Агаризированную среду из трубки Бурри выдувают, пропуская газ через ватную пробку.

6. Метод Хангейта – когда хотят получить изолированные колонии бактерий с особенно высокой чувствительностью к кислороду (строгие аэробы) используют метод вращающихся пробирок Хангейта.

Для этого расплавленную агаризированную среду засевают бактериями при постоянном токе через пробирку инертного газа, освобожденного от примеси кислорода. Затем пробирку закрывают резиновой пробкой и помещают горизонтально в зажим, вращающий пробирку, среда при этом равномерно распределяется по стенкам пробирки и застывает тонким слоем. Применение тонкого слоя в пробирке, заполненной газовой смесью, позволяет получить изолированные колонии, хорошо видимые невооруженным глазом.

Выделение отдельных клеток с помощью микроманипулятора. Микроманипулятор – прибор, позволяющий с помощью специальной микропипетки или микропетли извлекать одну клетку из суспензии. Эту операцию контролируют под микроскопом. На предметном столике микроскопа устанавливают влажную камеру, в которую помещают препарат «висячая капля».

В держателях операционных штативов закрепляют микропипетки (микропетли), перемещение которых в поле зрения микроскопа осуществляется с микронной точностью благодаря системе винтов и рычагов.

Исследователь, глядя в микроскоп, извлекает отдельные клетки микропипетками и переносит их в пробирки со стерильной жидкой средой для получения клона клеток.

Методы выделения чистых культур аэробных бактерий

Механического разобщения Биологические

Метод Пастера Метод Коха Биологический Физический

значение) разводок) Химический Метод Щукевича

Посев петлей Посев шпателем

(Метод Дригальского)

Методы выделения чистых культур (схема 11):

Методы механического разобщения основаны на разъединении микробов путем последовательного растирания исследуемого материа­ла по поверхности агара.

а) Метод Пастера – имеет историческое значение, предусматривает последовательное разведение исследуемого материала в жидкой питательной среде методом переката

б) Метод Коха – метод пластинчатых разводок – основан на последовательном разведении исследуемого материала мясо-пептонным агаром с последующей разливкой пробирок с разведенным материалом в чашки Петри

в) Метод Дригальского – при посеве материала, обильно обсемененного микрофлорой, используют 2–3 чашки для последовательного посева шпателем.

г) Посев петлей параллельными штрихами.

Биологические методы основаны на биологических свойствах возбудителей.

а) Биологический – заражение высокочувствительных животных, где микробы быстро размножаются и накапливаются.

В одних случаях, этот метод является единственным, позволяющим вы­делить культуру возбудителя от больного человека (например, при туляремии),в других случаях – он более чувствителен (например, выделение пневмококка на белых мышах или воз­будителя туберкулеза на морских свинках).

б) Химический – основан на кислотоустойчивости микобактерий. Для освобождения материала от сопутствующей флоры, его
обрабатывают раствором кислоты.

Вырастут только туберкулезные палочки, так как кислотоподатливые микробы погибли под действием кислоты.

в) Физический метод основан на устойчивости спор к нагреванию. Для выделения культуры спорообразующих бактерий из
смеси материал прогревают при 80°С и засевают на питательную среду. Вырастут только споровые бактерии, так как споры их остались живыми и дали рост.

г) Метод Щукевича – основан на высокой подвижности вуль­гарного протея, способного давать ползучий рост.

Методика пересева из колоний на скошенный агар и МПБ:

а) Пересев из колоний на скошенный агар

Приоткрывают крышку чашки, прокаленной остуженной петлей снимают часть отдельной колонии, открывают пробирку со стерильным скошенным агаром, держа ее в левой руке в наклонном положении, так, чтобы можно было наблюдать поверхность среды.

Переносят петлю с культурой в пробирку, не прикасаясь к стенкам, растирают по питательной среде, скользя по поверхности от одного края пробирки к другому, поднимая штрихи до верхушки среды – посев штрихом. Пробирку закрывают и, не выпуская из рук, подписывают название посеянного микроба и дату посева.

б) Пересев из колонии на мясо-пептонный бульон

Техника пересева на МПБ в основном такая же, как и при посеве на плотную среду.

При посеве на МПБ петлю с находящимся на ней материалом погружают в среду. Если материал вязкий и с петли не снимается, его растирают на стенке сосуда, а затем смывают жидкой средой. Жидкий материал, набираемый стерильной пастеровской или градуированной пипеткой, вливают в питательную среду.

В результате самостоятельной работы студент должен знать:

1.Методы выделения чистой культуры микроорганизмов

2. Методы культивирования микроорганизмов

Уметь:

1. Навыки соблюдения правил противоэпидемического режима и техники безопасности

2. Обеззараживать материал, проводить обработку рук

3. Приготовить препараты из колоний бактерий

4. Микроскопировать колоний

5. Окрашивать по Граму микроорганизмы

ТЕХНИКА ПОСЕВА, МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР И КУЛЬТУРАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА МИКРООРГАНИЗМОВ. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА БАКТЕРИЙ

Цель занятия. Освоить технику посева микроорганизмов на плотные и жидкие питательные среды и методы выделения чис­тых бактериальных культур. Ознакомить студентов с основными культуральными характеристиками микроорганизмов и методами определения количества бактерий.

Оборудование и материалы. Бульонные и агаровые культуры В. cereus, Е. coli и S. aureus в пробирках и в чашках Петри, сме­шанная бульонная культура Е. соli и S. aureus, стерильные МПА и МПБ в пробирках, чашках Петри, солевой МПА (8 % хлорида натрия) в чашках Петри, стеклянные шпатели, стерильные пи­петки Пастера, бактериологические петли.

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

Культура микроорганизмов — это популяция (расплодка) кле­ток на питательной среде. Посев и пересев культур микроорга­низмов на питательные среды — наиболее частый методический прием, который используют для первичного выделения микро­организма из какого-либо объекта, а также для поддержания культур в жизнеспособном состоянии в лабораторных условиях.

Чистая культура — это популяция бактерий одного вида или биологического варианта (биовара), выращенная на питательной среде.

Штаммы — чистые культуры микроорганизмов одного вида, выделенные из разных объектов или из одного и того же объекта, но в разное время.

Колония — макроскопически видимое скопление клеток мик­роорганизма на поверхности или внутри плотной питательной среды, образовавшихся в результате размножения одной жизне­способной клетки. По этой причине колонию обычно рассматри­вают как чистую культуру микроорганизма.

Техника посева микроорганизмов. Посевы из нативного мате­риала чаще проводят пастеровской пипеткой, из культур микро­организмов—бактериологической петлей в зоне стерильного воздуха над пламенем горелки. На культуральных сосудах (про­бирки, чашки Петри, колбы и т.д.) пишут номер экспертизы, под которым зарегистрирован материал, дату посева.

Посев на жидкую питательную среду. Пробирку с исследуемым материалом и пробирку с питательной средой держат в левой руке, в правую руку берут бактериологическую петлю или пипет­ку и'пробки от пробирок (рис. 37). Над пламенем горелки обжи­гают края пробирок, бактериологическую петлю (пипетку) вводят в пробирку с материалом, переносят материал в пробирку со сте­рильной питательной средой и стряхивают с петли в среду, не смачивая при этом петледержатель. Края пробирок вновь прово­дят над пламенем горелки, закрывают пробирки пробками, сте­рилизуют петлю и ставят ее в штатив. Использованную пипетку опускают концом вниз в банку с дезинфицирующим раствором.

Посев на плотную питательную среду. Выполняют разными способами.

При посеве в пробирку: 1) пробирки с засеваемой мик­робной культурой и питательной средой (МПА) берут в левую руку, пробирку с МПА держат скошенной поверхностью среды вверх. В открытую у пламени пробирку с микробной культурой (или другим материалом) вводят простерилизованную бактерио­логическую петлю, слегка прикасаясь петлей к поверхности сре­ды (материала), берут материал, переносят его в пробирку со сте­рильной питательной средой. Петлю опускают до дна пробирки, погружают в конденсационную жидкость и зигзагообразным движением проводят снизу вверх по поверхности среды (посев «штрихом») (рис. 38). Пробирки закрывают пробками, петлю прожигают. Пробирки с посевами ставят в термостат; 2) при по­севе уколом в столбик среды пробирку с плотной (нескошенной) средой берут в левую руку, над пламенем горелки извлекают из пробирки пробку, петлей с материалом прокалывают вертикаль­но по центру пробирки питательную среду, петлю вынимают, прожигают, пробирку с засеянной средой закрывают пробкой (рис. 39).

При посеве на чашку Петри: чашку берут в левую руку, большим пальцем левой руки слегка приподнимают крышку, об­жигают на пламени горелки края чашки в зоне щели, вносят по­севной материал на поверхность питательной среды, затем рас­тирают его при помощи стеклянного шпателя или бактериологи­ческой петли (рис. 40).

Посев на полужидкую питательную среду. Выполняют методом укола в столбик питательной среды.

Выделение чистых культур микроорганизмов. При бактериоло­гическом исследовании искомый микроорганизм обнаруживают в материале, как правило, в смеси с бактериями других видов. Классическими методами бактериологии возможно идентифици­ровать микроорганизм только при условии, что он находится в виде чистой культуры.

Методы, основанные на механическом разобщении клеток. Эти методы наиболее часто применяют при выделении чистых куль­тур микроорганизмов.

Метод Пастера (метод разведений): из исследуемого материала готовят ряд последовательных, чаще десятикратных разведений на стерильной жидкой питательной среде в пробир­ках или колбах (10^-1…10^-10). Предполагают, что количество мик­робных клеток в каждом последующем разведении будет меньше, чем в предыдущем, и в какой-то из пробирок останется только одна микробная клетка, которая и даст/начало чистой культуре Микроорганизма. Однако для успешного применения этого мето­да необходимо, чтобы искомый микроорганизм в материале ко­личественно преобладал над сопутствующими видами.

Метод Коха (метод заливок): исследуемый материал в небольшом количестве вносят в пробирку с расплавленным и ох­лажденным до 45...50 "С МПА, перемешивают, затем каплю пи­тательной среды переносят во вторую пробирку с расплавленным МПА и т. д. Количество разведений зависит от предполагаемой численности микроорганизмов в исследуемом материале. Затем содержимое каждой пробирки выливают в стерильные чашки Петри, после затвердения среды посевы помещают в термостат. Фиксированные в плотной среде микробные клетки при размно­жении формируют колонии, из которых можно отвить (пересе­ять) чистую культуру микроорганизма.

Метод Дригальского: берут три—пять чашек Петри с плотной питательной средой. В одну из чашек вносят посевной материал и распределяют его шпателем по поверхности пита­тельной среды. Не обжигая шпатель, оставшийся на нем матери­ал последовательно растирают на поверхности среды во второй, третьей и остальных чашках. В последних чашках Петри после инкубирования в термостате обычно наблюдают формирование изолированных колоний бактерий.

Более экономичен следующий способ получения изолированных колоний. Бактериологичес­кой петлей с посевным матери­алом несколько раз делают па­раллельные штрихи в одном секторе чашки Петри с пита­тельным агаром (рис. 41). Пет- о лю прожигают в пламени горел­ки, дают остыть и часть матери­ала из первого сектора {А) ана­логичным образом распре­деляют во втором секторе (В), затем в третьем (С) и четвертом (Д) секторах. Даже при рассеве бактериальной массы из коло­ний в секторе Д при таком спо­собе получают рост изолирован­ных колоний.

Методы, основанные на био­логических особенностях микроорганизмов.Направлены на подав­ление роста сопутствующей микрофлоры.

Прогревание: при выделении чистой культуры споро-образующего вида бактерий исследуемый материал прогревают при 80 °С 20 мин или кратковременно кипятят. Вегетативные клетки сопутствующей микрофлоры в этих условиях погибают, а споры искомого микроорганизма сохраняют жизнеспособность и прорастают после посева на питательные среды.

Использование селективных питатель­ных сред, которые содержат вещества, подавляющие рост сопутствующей микрофлоры (антибиотики, красители и т. д.), — частый прием при исследовании контаминированного материа­ла. Однако необходимо учитывать, что селективные факторы ча­сто находятся не в бактерицидных, а в бактериостатических кон­центрациях, поэтому клетки сопутствующих микроорганизмов не растут, но остаются жизнеспособными на поверхности пита­тельной среды и при отвивке колоний исследуемой культуры на обычные среды могут быть причиной получения смешанной культуры.

Биопроба — заражение чувствительных лабораторных животных — метод, с помощью которого не только выделяют возбудитель из патологического материала, но также изучают вирулентность чистой культуры. Организм животного с его за­щитными факторами служит биологическим «фильтром», кото­рый уничтожает сопутствующую непатогенную микрофлору, но не способен подавить размножение вирулентных бактерий, что позволяет достаточно легко выделить возбудитель в чистой культуре из тканей погибшего или убитого с диагностической целью животного.

При выделении чистых культур некоторых видов бактерий ис­пользуют их другие биологические особенности. Например, спо­собность микроорганизма расти при низких (листерии) или высо­ких (термофильные бактерии) температурах, которые лежат за пределами температурных диапазонов сопутствующих видов бак­терий. Для выделения культуры P. vulgaris используют способность данного вида давать ползучий рост (роение) на поверхности плот­ной питательной среды. С этой целью материал, содержащий P. vulgaris, засевают в конденсационную воду на дне пробирки со скошенным МПА, не касаясь поверхности среды. Сопутствующая микрофлора растет в нижней части питательной среды, а протей в виде прозрачной пленки распространяется вверХ.

Для выделения С. tetani материал засевают точечно на плот­ную питательную среду в чашках Петри и после выращивания отвивают культуру с периферии ползучего роста.

Культуральные свойства микроорганизмов. В процессе иденти­фикации наряду с другими свойствами у микроорганизмов изу­чают культуральные признаки — особенности роста на плотных, жидких и полужидких питательных средах при определенных ус­ловиях.

На плотных средах изучают колонии микроорганизмов. Бакте­рии каждого вида формируют колонии с определенными призна­ками, которые обычно учитывают при идентификации. Раз­мер колоний: крупные — диаметром 4...6 мм и более, сред­ние—2...4 мм, мелкие — 1...2мм и точечные колонии диаметром менее 1 мм. Форма колоний может быть правильной круг­лой, неправильной (амебовидной, розеткообразной), корневид­ной (рис. 42). Цвет зависит от способности микроорганизма образовывать пигмент: белый, желтый, красный, сине-зеленый и т. д. Бактерии, не синтезирующие пигмент, формируют бесцвет­ные колонии. Учитывают характер поверхности, ко­торая может быть шероховатой, блестящей, матовой, сухой, влажной, гладкой, радиально или концентрически исчерченной. Края колонии могут быть ровными, волнистыми, зазубренны­ми, бахромчатыми, их исследуют невооруженным глазом и под малым увеличением микроскопа (рис. 43). Рельеф (про­филь) определяют, рассматривая колонию сбоку; различают плоские, конусообразные, куполообразные, плоские с конусо­видным центром или углублением в центре колонии, с утолщен­ными (валикообразными) краями (рис. 44). Учитывают про­зрачность колонии: непрозрачная, полупрозрачная, про­зрачная. Структура может быть однородной, зернистой, волокнистой и т.д. (рис. 45). Ее выявляют при слабом увеличе­нии микроскопа. Консистенция может быть пастообраз­ной, слизистой, плотной (сухой) и т.д.; ее определяют, дотраги­ваясь до колонии бактериологической петлей. Колонии некото­рых видов врастают в толщу питательной среды, что также определяют при помощи бактериологической петли. Запах: многие виды бактерий в процессе роста на питательных средах выделяют специфические ароматические вещества.

Ценную дополнительную информацию об особенностях стро­ения колоний дает их изучение в косопадающем пучке света (рис. 46). Культуры на прозрачной агаровой среде в чашках Пет­ри помещают на предметный столик бинокулярной лупы. Между бинокулярной лупой и источником света помещают зеркало от микроскопа вогнутой стороной вверх таким образом, чтобы лучи, отраженные от него, попадали в плоскость изучаемого объекта под углом 40...45°. Зеркало устанавливают на равном уда

В жидких средах учитывают следующие признаки: степень помутнения среды (интенсивное, среднее, слабое), на­личие или отсутствие пристеночного кольца на гра­нице мениска и внутренней поверхности пробирки, харак­тер поверхностной пленки (толщина, цвет, поверхность), характер осадка (обильный, скудный, ком­пактный, хлопьевидный, слизистый). При характеристике осадка пробирку слегка встряхивают и учитывают результат: осадок раз­бивается в гомогенную равномерную суспензию; образуются мелкие или крупные хлопья, глыбки; слизистый осадок при встряхивании обычно поднимается в виде косички. Пигментообразующие микроорганизмы вызывают окрашивание питательной среды и осадка (желтое, зеленоватое, красное и т. д.).

Определение количества бактерий. При характеристике разви­тия микробной популяции, санитарной оценке кормов, продук­тов питания, при вычислении показателя вирулентности микро­организма необходимо устанавливать количество микробных клеток в единице объема того или иного материала.

Определение общего количества микроорганизмов. Можно при­менять метод прямого счета и метод измерения светорассеяния.

Метод прямого счета: бактерии подсчитывают в камерах Горяева, Тома или в окрашенных мазках. В последнем случае 0,01 мл бактериальной суспензии микропипеткой нано­сят на предметное стекло и равномерно распределяют на 1 см2. Мазок фиксируют, окрашивают и подсчитывают клетки в 10... 15 полях зрения по диагонали квадрата. Определяют сред­нее число клеток в одном поле зрения. Делят 1 см² на площадь поля зрения, которую измеряют методом микрометрии (см. тему 1), затем частное умножают на среднее число микробных клеток в поле зрения, получают их количество в 0,01 мл взвеси бактерий.

Метод измерения светорассеяния считают более точным. Количество света, рассеиваемого суспензией бак­терий, пропорционально их концентрации. Этот показатель дос­таточно точно можно измерить при помощи фотоэлектроколориметра. Зависимость между оптической плотностью и концентра­цией клеток различна для бактерий разных видов. Поэтому при работе с таким прибором для каждого вида бактерий необходимо строить свою калибровочную кривую зависимости.

На практике широко используют простой субъективный ме­тод, основанный на визуальном сравнении мутности исследуе­мой бактериальной суспензии с так называемым «стандартом мутности», выпускаемым Государственным научно-исследова­тельским институтом стандартизации и контроля биологических препаратов им. Л. А. Тарасевича. Стандарт представляет собой взвешенные в воде частицы стекла «Пирекс» и состоит из трех запаянных пробирок-эталонов (5, 10 и 20 международных еди­ниц). Мутность стандарта на 10 ед. соответствует следующим кон­центрациям: для бактерий кишечной группы — 0,93*10⁹ кл/мл; коклюшной группы — 11 • 10⁹ кл/мл; для бруцеллезных бакте­рий — 1,7 • 10⁹ кл/мл; туляремийных микробов — 5 • 10⁹ кл/мл.

Мерной пипеткой вносят 0,1...0,5 мл исследуемой бактериаль­ной суспензии в пустую пробирку, соответствующую по диамет­ру и толщине стенок пробирке «стандарта мутности». К суспен­зии добавляют физиологический раствор до оптической плотнос­ти стандарта на 10 ед. Физиологический раствор вносят неболь­шими мерными порциями, записывая его количество и сравнивая мутность опытной и стандартной пробирок невоору­женным глазом на фоне специальной шрифтовой таблицы. Зная, во сколько раз развели исследуемую бактериальную суспензию, чтобы уравнять ее оптическую плотность со стандартом, можно рассчитать содержание микробных клеток в 1 мл исходной сус­пензии.

Например, в пробирку поместили 0,1 мл суспензии бактерий, содержащей неизвестное количество клеток. Для уравнивания оптической плотности исследуемой суспензии со стандартом мутности 10 ед. в пробирку добавили 0,9 мл физиологического раствора, т. е. исходную суспензию развели в 10 раз. Известно, что суспензия данного вида бактерий при оптической плотности 10 ед. содержит 1,3*10⁹ кл/мл. Следовательно, концентрация ис­следуемой суспензии составляет 1,3*10¹⁰ кл/мл.

При работе с бактериями, для которых нет данных о содержа­нии микробных клеток в 1 мл относительно «стандарта мутнос­ти», необходимо предварительно методом прямого счета опреде­лить их количество в суспензии, например, оптической плотнос­тью 10 ед.

Определение количества живых микроорганизмов. Метод осно­ван на выводе, что бактериальная колония — это результат деле­ния единичной клетки на плотной питательной среде (исключе­ние составляют бактерии, образующие цепочки из клеток).

Мерной пипеткой объемом 1 мл добавляют 1 мл культуры Е. coli в бактериологическую пробирку с 9 мл стерильного физио­логического раствора, подогретого до 37...38 °С (разведение 10-1). Далее аналогичным способом готовят разведения культуры от 10^-2 до 10^-8. Для каждого разведения используют новую пипетку того же объема и класса. Из пяти последних пробирок суспензию бактерий по 0,1 мл наносят на поверхность подсушенного МПА в две чашки Петри. Внесенный материал стерильным шпателем распределяют по поверхности питательной среды. Посевы инку­бируют при 37...38 ºС 24 ч.

Учет результатов: в чашках Петри, где выросло более 150...300 и менее 10 колоний, результаты не учитывают. Выбирают чашки Петри с параллельными посевами (из одного разведения), содер­жащими 10... 150 колоний. Подсчитывают колонии на чашках из одного разведения, суммируют, определяют среднее число коло­ний и с учетом степени разведения рассчитывают содержание жизнеспособных клеток (колониеобразующих единиц) в 1 мл исходной суспензии бактерий.

ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ

1. Провести пересев бульонной и агаровой культур бактерий на скошенный МПА и в МПБ в пробирках.

2. Провести посев смешанной бульонной культуры на МПА в чашках Петри по методу Дригальского.

3. Описать характер роста Е. coli, S. aureus, В. cereus на МПА (колонии) и в МПБ.

4. Определить количество микробных клеток в 1 мл бульонной культуры Е. coli методом прямого счета и при помощи стандарта мутности.

5. Провести посев бульонной культуры Е. coli на МПА в чаш­ках Петри с целью определения количества жизнеспособных клеток.

Контрольные вопросы

1.Что такое культура, смешанная культура, чистая культура, штамм и колония бактерий?

2.Какие методы применяют для получения чистых культур микроорганизмов?

3.Какие культуральные признаки учитывают при идентификации бактерий?

4.Какими методами определяют общее число микроорганизмов и количество жизнеспособных клеток?

Тема 9

Методы выделения чистых культур микроорганизмов — МегаЛекции

Чистой культурой называют скопление микробов одного вида на плотной или в жидкой питательной среде.

Существует ряд методов выделения чистой культуры в зависимости от свойств изучаемого материала и цели исследования. Обычно чистые культуры получают из изолированных колоний - обособленных скоплений микробов на плотной среде. Считают, что чаще всего колония развивается из одной микробной клетки, т. е. является чистой культурой этого микроорганизма.

Этапы выделения чистой культуры:

1-й день - получение изолированных колоний. Каплю исследуемого материала петлей, пипеткой или стеклянной палочной наносят на поверхность агара в чашке Петри. Шпателем втирают материал в поверхность среды; не прожигая и не перевертывая шпателя, производят посев на 2-й, а затем на 3-й чашке. При таком посеве на 1-ю чашку приходится много материала и соответственно много микробов, на 2-ю меньше и на 3-ю еще меньше.

Можно получить изолированные колонии при посеве петлей. Для этого исследуемый материал эмульгируют в бульоне или изотоническом растворе натрия хлорида.

2-й день - изучают рост микробов на чашках. В 1-й чашке обычно бывает сплошной рост - выделить изолированную колонию не удается. На поверхности агара во 2-й и 3-й чашке вырастают изолированные колонии. Их изучают невооруженным глазом, с помощью лупы, при малом увеличении микроскопа и иногда в стереоскопическом микроскопе (см. главу 31). Нужную колонию отмечают со стороны дна чашки и пересевают на скошенный агар. Посевы ставят в термостат.

Внимание! Пересевать можно только изолированные колонии.

3-й день - изучают характер роста на скошенном агаре. Делают мазок, окрашивают его и, убедившись в том, что культура чистая, приступают к ее изучению. На этом выделение чистой культуры заканчивается. Выделенная из определенного источника и изученная культура, называется штаммом.

При выделении чистой культуры из крови (гемокультуры) ее предварительно "подращивают" в жидкой среде: 10-15 мл стерильно взятой крови засевают в 100-150 мл жидкой среды. Так поступают потому, что в крови обычно мало микробов. Соотношение засеваемой крови и питательной среды 1:10 не случайно - так достигается разведение крови (неразведенная кровь губительно действует на микроорганизмы). Колбы с посевом ставят в термостат. Через сутки (иногда через большее время в зависимости от выделяемой культуры) из содержимого колб делают высевы на чашки для получения изолированных колоний. При необходимости повторяют высевы с интервалами 2-3 дня.

При выделении чистой культуры из мочи, промывных вод желудка и других жидкостей их предварительно центрифугируют в асептических условиях и засевают осадок. Дальнейшее выделение чистой культуры производят обычным способом.

Для выделения чистой культуры широко применяют элективные среды.

В ряде методов для получения чистых культур используют биологические особенности выделяемого микроба. Например, при выделении спорообразующих бактерий посевы прогревают при 80° С 10 мин, убивая этим вегетативные формы; при выделении возбудителя туберкулеза, устойчивого к кислотам и щелочам, с помощью этих веществ посевной материал освобождают от сопутствующей флоры; для выделения пневмококка и палочки чумы исследуемый материал вводят белым мышам - в их организме, высокочувствительном к данным возбудителям, эти микробы размножаются быстрее других.

В научно-исследовательской работе, особенно при генетических исследованиях, необходимо получать культуры заведомо из одной клетки. Такая культура называется клон. Для ее получения чаще всего пользуются микроманипулятором - прибором, снабженным инструментами (иглами, пипетками) микроскопических размеров. С помощью держателя под контролем микроскопа их вводят в препарат "висячая капля", извлекают нужную клетку (одну) и переносят ее в питательную среду.

Изучение выделенных культур

Изучение морфологии, подвижности, тинкториальных свойств (см. главу 3), характера роста на средах (культуральные свойства), ферментативной активности и ряда других особенностей выделенного микроба позволяет установить его таксономическое положение, т. е. классифицировать микроорганизм: определить его род, вид, тип, подтип, разновидность. Это называется идентификацией. Идентификация микроорганизмов очень важна при диагностике инфекций, установлении источников и путей ее передачи и в ряде других научно-практических исследований.

Культуральные свойства

Разные виды микроорганизмов по-разному растут на средах. Эти различия служат для их дифференциации. Одни хорошо растут на простых средах, другие - требовательны и растут только на специальных. Микроорганизмы могут давать обильный (пышный) рост, умеренный или скудный. Культуры могут быть бесцветными, сероватыми, серо-голубыми. Культуры микроорганизмов, образующих пигмент, имеют разнообразную окраску: белую, желтую или золотистую у стафилококка, красную - у чудесной палочки, сине-зеленую - у сине-зеленой палочки, пигмент которой, растворимый в воде, окрашивает не только колонии, но и среду.

На плотных средах микроорганизмы в зависимости от количества посевного материала образуют или сплошной налет ("газон"), или изолированные колонии. Культуры бывают грубые и нежные, прозрачные и непрозрачные, с поверхностью матовой, блестящей, гладкой, шероховатой, сухой, бугристой.

Колонии могут быть крупные (4-5 мм в диаметре и больше), средние (2-4 мм), мелкие (1-2 мм) и карликовые (меньше 1 мм). Они различаются по форме, расположению на поверхности среды (выпуклые, плоские, куполообразные, вдавленные, круглые, розеткообразные), форме краев (ровные, волнистые, изрезанные).

В жидких средах микроорганизмы могут образовывать равномерную муть, давать осадок (зернистый, пылевидный, хлопьевидный) или пленку (нежную, грубую, морщинистую).

На полужидких средах при посеве уколом подвижные микробы вызывают помутнение толщи среды, неподвижные - растут только по "уколу", оставляя остальную среду прозрачной.

Культуральные свойства определяют, изучая характер роста культуры простым глазом, с помощью лупы, под малым увеличением микроскопа или пользуясь стереоскопическим микроскопом. Величину и форму колоний, форму краев и прозрачность изучают в проходящем свете, рассматривая чашки со стороны дна. В отраженном свете (со стороны крышки) определяют характер поверхности, окраску. Консистенцию определяют прикосновением петли.

Морфологические свойства

Изучение морфологии микробов тоже служит для их дифференциации. Морфологию изучают в окрашенных препаратах. Устанавливают форму и величину клеток, их расположение в препарате, наличие спор, капсул, жгутиков. В окрашенных препаратах определяют отношение микробов к краскам (тинкториальные свойства) - хорошо или плохо воспринимают краски, как относится к дифференциальным окраскам (в какой цвет окрашивается по Граму, Цилю - Нильсену и др.). Витальная (прижизненная) окраска позволяет установить подвижность, отдифференцировать живые и мертвые клетки, следить за их делением. Деление и подвижность можно изучать в нативных (неокрашенных) препаратах (см. главу 3).

Ферментативная активность

Ферментативная активность микроорганизмов богата и разнообразна. По ней можно установить не только видовую и типовую принадлежность микроба, но и определить его варианты (так называемые биовары). Рассмотрим основные ферментативные свойства и их качественное определение.

Расщепление углеводов (сахаролитическая активность), т. е. способность расщеплять сахара и многоатомные спирты с образованием кислоты или кислоты и газа, изучают на средах Гисса, которые содержат тот или иной углевод и индикатор. Под действием образующейся при расщеплении углевода кислоты индикатор изменяет окраску среды. Поэтому эти среды названы "пестрый ряд". Микробы, не ферментирующие данный углевод, растут на среде, не изменяя ее. Наличие газа устанавливают по образованию пузырьков в средах с агаром или по скоплению его в "поплавке" на жидких средах. "Поплавок" - узкая стеклянная трубочка с запаянным концом, обращенным вверх, которую до стерилизации помещают в пробирку со средой (рис. 18).

Рис. 18. Изучение сахаролитической активности микроорганизмов. I - 'пестрый ряд': а - жидкая среда с углеводами и индикатором Андреде; б - полужидкая среда с индикатором ВР: 1 - микроорганизмы не ферментируют углевод; 2 - микроорганизмы ферментируют углевод с образованием кислоты; 3 - микроорганизмы ферментируют углевод с образованием кислоты и газа; II - колонии микроорганизмов, не разлагающих (бесцветные) и разлагающих лактозу (фиолетовые на среде ЭМС - слева, красные на среде Эндо - справа)

Кроме того, сахаролитическую активность изучают на средах Эндо, ЭМС, Плоскирева. Микроорганизмы, сбраживая до кислоты находящийся в этих средах молочный сахар (лактозу), образуют окрашенные колонии - кислота изменяет цвет имеющегося в среде индикатора. Колонии микробов, не ферментирующих лактозу, бесцветны (см. рис. 18).

Молоко при росте микробов, сбраживающих лактозу, свертывается.

При росте микроорганизмов, образующих амилазу, на средах с растворимым крахмалом происходит его расщепление. Об этом узнают, прибавив к культуре несколько капель раствора Люголя - цвет среды не изменяется. Нерасщепленный крахмал дает с этим раствором синее окрашивание.

Протеолитические свойства (т. е. способность расщеплять белки, полипептиды и т. п.) изучают на средах с желатином, молоком, сывороткой, пептоном. При росте на желатиновой среде микробов, ферментирующих желатин, среда разжижается. Характер разжижения, вызываемый разными микробами, различен (рис. 19). Микробы, расщепляющие казеин (молочный белок), вызывают пептонизацию молока - оно приобретает вид молочной сыворотки. При расщеплении пептонов могут выделяться индол, сероводород, аммиак. Их образование устанавливают с помощью индикаторных бумажек. Фильтровальную бумагу заранее пропитывают определенными растворами, высушивают, нарезают узенькими полосками длиной 5-6 см и после посева культуры на МПБ помещают под пробку между нею и стенкой пробирки. После инкубации в термостате учитывают результат. Аммиак вызывает посинение лакмусовой бумажки; при выделении сероводорода на бумажке, пропитанной 20% раствором свинца ацетата и натрия гидрокарбоната, происходит образование свинца сульфата - бумажка чернеет; индол вызывает покраснение бумажки, пропитанной раствором щавелевой кислоты (см. рис. 19).

Рис. 19. Протеолитические свойства микроорганизмов. 1 - формы разжижения желатина; II - определение сероводорода; III - определение индола: 1 - отрицательный результат; 2 - положительный результат

Помимо указанных сред, способность микроорганизмов расщеплять различные питательные субстраты определяют с помощью бумажных дисков, пропитанных определенными реактивами (системы индикаторные бумажные "СИБ"). Эти диски опускают в пробирки с исследуемой культурой и уже через 3 ч инкубации в термостате при 37° С по изменению цвета дисков судят о разложении углеводов, аминокислот, белков и т. д.

Гемолитические свойства (способность разрушать эритроциты) изучают на средах с кровью. Жидкие среды при этом становятся прозрачными, а на плотных средах вокруг колонии появляется прозрачная зона (рис. 20). При образовании метгемоглобина среда зеленеет.

Рис. 20. Гемолиз вокруг колоний, растущих на агаре с кровью

Сохранение культур

Выделенные и изученные культуры (штаммы), представляющие ценность для науки или производства, хранят в музеях живых культур. Общесоюзный музей находится в Государственном НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л. А. Тарасевича (ГИСК).

Задача хранения - поддержать жизнеспособность микроорганизмов и предупредить их изменчивость. Для этого надо ослабить или прекратить обмен в микробной клетке.

Один из самых совершенных методов длительного сохранения культур - лиофилизация - высушивание в вакууме из замороженного состояния позволяет создать состояние анабиоза. Высушивание проводят в специальных аппаратах. Хранят культуры в запаянных ампулах при температуре 4° С, лучше при -30-70° С.

Восстановление высушенных культур. Сильно нагревают кончик ампулы в пламени горелки и прикасаются к нему ватным тампоном, слегка^* смоченным холодной водой, чтобы на стекле образовались микротрещины, через которые воздух медленно просочится внутрь ампулы. При этом, проходя через разогретые края трещин, воздух стерилизуется.

^* (При избытке воды на тампоне она может попасть в ампулу и нарушить стерильность культуры: ее засосет через образовавшиеся микротрещины, так как в ампуле вакуум.)

Внимание! Не забывайте, что в запаянной ампуле вакуум. Если воздух в нее попадает сразу через большое отверстие, может распылиться находящаяся в ампуле культура и произойти ее выброс.

Дав войти воздуху, быстро пинцетом надламывают и удаляют верхушку ампулы. Слегка обжигают отверстие и стерильной пастеровской пипеткой или шприцем вносят в ампулу растворитель (бульон или изотонический раствор). Перемешивают содержимое ампулы и засевают на среды. Рост восстановленных культур в первых посевах может быть замедлен.

Длительно сохранять культуры можно также в жидком азоте (-196° С) в специальных приборах.

Методы непродолжительного сохранения культур следующие: 1) субкультивирование (периодические пересевы на свежие среды) с интервалами, зависящими от свойств микроорганизма, среды и условий культивирования. Между пересевами культуры хранят при 4° С; 2) сохранение под слоем масла. Культуру выращивают в агаре столбиком высотой 5-6 см, заливают стерильным вазелиновым маслом (слой масла примерно 2 см) и хранят вертикально в холодильнике. Сроки хранения у разных микроорганизмов разные, поэтому из пробирок периодически высевают культуру, чтобы проверить ее жизнеспособность; 3) хранение при -20-70° С; 4) хранение в запаянных пробирках. По мере надобности сохраняемый материал высевают на свежую среду.

Контрольные вопросы

1. Что входит в понятие "бактериологическое исследование"?

2. Какой должна быть культура для такого исследования?

3. Что такое колония микробов, культура, штамм, клон?

4. Что входит в понятие "культуральные свойства микробов"?

Задание

1. Изучите и опишите несколько колоний. Пересейте их на скошенный агар и на сектор.

2. Изучите и опишите характер роста - культуры на скошенном агаре. Определите чистоту и морфологию культуры в окрашенном препарате.

3. Пересейте культуру со скошенного агара на бульон и на дифференциально-диагностические среды. Изучите и запишите в протокол характер роста культуры на этих средах и ее ферментативные свойства.

Глава 8. Фаги - Г. И. Кац

Фаги - вирусы бактерий и ряда других микроорганизмов. В определенных условиях они вызывают лизис (растворение) своих хозяев. Действие фагов проявляется в природе и используется в практике.

История открытия и изучения фага. В 1898 г. Н. Ф. Гамалея показал, что фильтрат сибиреязвенных бацилл вызывает лизис свежих культур этих микроорганизмов. В 1915 г. Ф. Ту орт обнаружил, что белые непрозрачные колонии стафилококков становились прозрачными и исчезали и что агент, лизирующий стафилококки, проходит через бактериальные фильтры, сохраняя способность растворять свежие культуры этих микроорганизмов. Явление лизиса микроорганизмов было описано, но природа его не изучена. Вот почему честь открытия бактериофага принадлежит канадскому ученому д'Эреллю.

Д'Эрелль (1917) изучал фильтраты испражнений, которые брал ежедневно у больного дизентерией и вносил в пробирки со свежезасеянной культурой возбудителя этой болезни. После инкубации в термостате культура вырастала. Но однажды она не выросла, а растворилась. Это совпало с началом выздоровления больного.

Д'Эрелль показал, что лизирующая способность фильтратов испражнений усиливалась при последовательных пассажах на свежих культурах бактерий. Из этого ученый сделал вывод, что растворяет их живой агент, проходящий через бактериальные фильтры, т. е. вирус. В настоящее время его точка зрения принята большинством ученых.

Открытый вирус д'Эрелль назвал бактериофагом^* - пожирателем бактерий (от греч. фагос - пожирающий), а явление - бактериофагией.

^* (В настоящее время чаще употребляют термин "фаг", так как подобные "пожиратели" встречаются также у грибов и водорослей.)

С открытием электронного микроскопа была подтверждена корпускулярная природа фага и изучена его морфология.

Открытие д'Эрелля привлекло внимание врачей, применивших фаг для лечения и профилактики ряда инфекционных болезней. В настоящее время фаги широко используют в медицинской практике и при различных биологических исследованиях. Фагами занимаются бактериологи, вирусологи, биохимики, генетики, биофизики, молекулярные биологи, экспериментальные онкологи, специалисты по генной инженерии и биотехнологии и т. д. Изучение фага продолжается, как одна из интереснейших глав биологии.

Свойства фагов

Природа фагов. Фаги, как считает большинство исследователей, - это организмы, которые подобно всем живым организмам способны размножаться, передавать потомству свои свойства и изменяться под воздействием различных факторов. Они могут инфицировать и разрушать только молодые развивающиеся клетки, являясь их паразитами.

Морфология фагов. Большинство фагов состоит из головки и хвостового отростка, поэтому их сравнивают с головастиками или сперматозоидами. Наиболее изучены Т-фаги кишечной палочки (рис. 21). Их отросток представляет собой полый цилиндр (стержень), покрытый чехлом и заканчивающийся базальной пластинкой с шипами и фибриллами. Размеры фагов, форма и величина головки, длина и строение отростка различны у разных фагов. Например, встречаются фаги с длинным отростком, чехол которого не сокращается, фаги с коротким отростком, без отростка и нитевидные (рис. 22).

Рис. 21. Строение фага Т-2. 1 - головка; 2 - ДНК; 3 - стержень; 4 - чехол; 5 - базальная пластинка; 6 - шипы; 7 - хвостовые фибриллы

Рис. 22. Морфология фагов. 1 - фаги с головкой, отростком и сокращающимся чехлом; 2 - головка и отросток, без сократительной способности; 3 - головка и короткий отросток; 4 - бесхвостые фаги; 5 - нитевидные фаги

Химический состав фагов. Как и все вирусы, фаги состоят из нуклеиновой кислоты одного типа (чаще встречаются ДНК-фаги) и белка. Молекула нуклеиновой кислоты, скрученная в спираль, находится в головке фага. Оболочка фага (капсид) и отросток имеют белковую природу. На свободном конце отростка содержится литический фермент, обычно лизоцим или гиалуронидаза.

Специфичность фагов. Фаги обладают строгой специфичностью. Различают видовую специфичность, т. е. способность паразитировать только в определенном виде микроорганизмов. Именуют фаги обычно по названию микроба-хозяина (стрептококковый, стафилококковый, холерный, дизентерийный и т. д.). Фаги с более строгой специфичностью паразитируют только на определенных представителях данного вида - это типовые фаги. Фаги, лизирующие микроорганизмы близких видов, например видов, входящих в род возбудителей дизентерии (шигелл), называются поливалентными.

Взаимодействие фага с чувствительной клеткой проходит через последовательные стадии. Весь цикл занимает в разных системах фаг - бактерия от нескольких минут до 1-2 ч, Разберем последовательность этого процесса на примере Т-четного фага кишечной палочки.

Стадия I - адсорбция частиц фага на поверхностных рецепторах клетки осуществляется с помощью нитей хвостового отростка. На одной клетке могут адсорбироваться сотни фагов для лизиса клетки достаточно одного). Адсорбция фагов специфична.

Стадия II - проникновение (инъекция) нуклеиновой кислоты фага в клетки у разных фагов происходит по-разному. У Т-фагов кишечной палочки шипы базальной пластинки соприкасаются с клеточной стенкой. Стержень "прокалывает" клеточную стенку. Фермент, находящийся в отростке, чаще всего лизоцим, разрушает цитоплазматическую мембрану. При этом чехол отростка сокращается, и через канал стержня нуклеиновая кислота фага "впрыскивается" в клетку. Пустая белковая оболочка фага ("тень") остается снаружи.

Стадия III - репродукция белка и нуклеиновой кислоты фага внутри клетки.

Стадия IV - сборка и формирование зрелых частиц фага.

Стадия V - лизис клетки и выход зрелых частиц фага из нее. Обычно происходит разрыв клеточной стенки и в окружающую среду выходит несколько сот новых фагов, способных поражать свежие клетки. Такой лизис называется лизисом изнутри (рис. 23).

Рис. 23. Схема основных этапов взаимодействия фага с бактериальной клеткой. 1 - внедрение нуклеиновой кислоты фага в клетку; 2 - молодые, размножающиеся фаги; 3 - зрелые фаги; 4 - выделение фагов

В отличие от лизиса изнутри лизис извне происходит тогда, когда на клетке адсорбируется сразу очень большое количество фагов. Они проделывают в клеточной стенке многочисленные отверстия, через которые вытекает содержимое клетки. Таким образом при лизисе извне фаг не размножается, и количество его частиц не увеличивается.

По характеру действия на микроорганизмы различают вирулентные и умеренные фаги.

Вирулентные фаги вызывают лизис зараженной клетки с выходом в окружающую среду большого количества фаговых частиц, способных поражать новые клетки. При этом культура микроорганизмов лизируется. Жидкая среда становится прозрачной - происходит образование фаголизата^* - среды, в которой находится большое количество фагов. При развитии вирулентного фага в бактериях, растущих на плотной среде, образуются или прозрачные участки сплошного лизиса, или вырастают отдельные прозрачные образования - колонии фага. Их называют негативными колониями (бляшками). Колонии разных фагов отличаются по величине и структуре (рис. 24).

^* (При дальнейшей инкубации фаголизата в термостате может наступить вторичное помутнение среды - размножаются оставшиеся живыми, устойчивые к фагу клетки Популяций.)

Рис. 24. Колонии фагов кишечной палочки. 1 - крупные; 2 - мелкие

Умеренные фаги лизируют не все клетки в популяции. С частью из них фаги вступают в симбиоз: нуклеиновая кислота фага (его геном) встраивается в хромосому клетки и получает название про фаг. Происходит образование единой хромосомы. Бактериальная клетка при этом не погибает. Профагу ставший частью генома клетки, при ее размножений может передаваться неограниченному числу потомков, т. е. новым клеткам. Явление симбиоза микробной клетки с умеренным фагом (профагом) носит название лизогения, а культура, в которой имеется профаг, называется лизогенной. Это название отражает способность профага спонтанно покидать хромосому клетки и, переходя в цитоплазму, превращаться в вирулентный фаг. Те клетки культуры, в которых образовался вирулентный фаг, погибают (лизируются), остальные сохраняют лизогенность.

Лизогенные культуры по своим основным свойствам не отличаются от исходных, но они устойчивы к повторному заражению одноименным фагом. При действии на лизогенную культуру проникающего излучения (определенных доз и экспозиции рентгеновских, космических лучей), некоторых химических веществ и ряда других факторов продукция вирулентного фага и лизис им клеток культуры значительно увеличиваются.

Умеренные фаги могут принести вред микробиологическому производству. Например, если штаммы-продуценты вакцин, антибиотиков и других биологических веществ оказываются лизогенными, существует опасность перехода умеренного фага в вирулентный, что повлечет за собой лизис производственного штамма.

Умеренные фаги являются мощным фактором изменчивости микроорганизмов. Профаг может изменить некоторые свойства микробной культуры, например сделать ее способной к токсинообразованию, что наблюдается среди дифтерийных палочек, возбудителя скарлатины и др. Кроме того, переходя в вирулентную форму и лизируя клетку, фаг может захватить часть хромосомы клетки-хозяина и перенести эту часть хромосомы в другую клетку, где фаг снова перейдет в профаг, а клетка получит новые свойства (см. главу 10).

Распространение фагов в природе повсеместное. Фаги встречаются там, где находятся чувствительные к ним микроорганизмы: в воде, почве, сточных водах, выделениях человека и животных и т. д. Почти все известные бактерии являются хозяевами специфических для них фагов.

Устойчивость фагов к физическим и химическим факторам выше, чем у вегетативных форм их хозяев. Фаги выдерживают нагревание до 75° С, длительное высушивание, рН от 2,0 до 8,5. Они не чувствительны к антибиотикам, тимолу, хлороформу и ряду других веществ, уничтожающих сопутствующую микрофлору. Поэтому эти вещества используют при выделении и сохранении фагов. Кислоты и дезинфицирующие вещества губительны для фагов.

Контрольные вопросы

1. Дайте определение понятию фаг.

2. Кто впервые наблюдал действие фага? Кто открыл фаг и изучил его природу?

3. Какова природа, химический состав и строение фагов?

4. В чем выражается специфичность действия фага?

5. Чем отличается действие вирулентного и умеренного фагов?

Рекомендуемые страницы:

Воспользуйтесь поиском по сайту:

Этапы выделения чистых культур аэробов — Студопедия

Первый день: 1. Бактериоскопия по Граму или ориентировочным методом исследуемого материала, проводят не всегда.

2. Посев исследуемого материала на плотные среды.

Второй день: 1. Изучают характер роста и отмечают «типичные колонии».

2. Проводят бактериоскопию «типичных колоний».

3. Посев «типичных колоний» на жидкие и плотные среды в пробирках.

Третий день: 1. Просматривают агаровые культуры, если рост однородный – культуры чистые.

2. Проводят бактериоскопию бульонных культур, если в мазках одинаковые микроорганизмы – культуры чистые, приступают к идентификации.

Вопросы для обсуждения 

1. Программированный контроль по разделу «Морфология и структура микроорганизмов».

ТЕМА 4 Культуральные свойства микроорганизмов. Фазы роста микроорганизмов. Работа второго дня по выделению чистых культур аэробов. Методы идентификации. Выделение чистых культур анаэробов

Цель занятия. Программированный контроль по разделу «Морфология и структура микробов». Познакомиться с методикой изучения культуральных свойств микроорганизмов. Разобрать фазы роста микроорганизмов, методы идентификации, методы выделения чистых культур анаэробов.

Оборудование и материалы. Рабочие места бактериологов, посевы исследуемого материала, посевы разных микроорганизмов на плотных и жидких питательных средах, посевы микроорганизмов на дифференциально – диагностических питательных средах. Анаэростат, среды для выращивания анаэробов. Электронный ресурс, таблицы «Культуральные, протеолитические, биохимические свойства микроорганизмов»

Задание для самостоятельной работы студентов. 1. Выполнить работу второго дня по выделению чистых культур аэробов, результат бактериоскопии зарисовать. 2. Представить характеристику выросших колоний и биологических свойств микробов. 

Рис. 8

Культуральные свойства микроорганизмов

Культуральными свойствами называют особенности роста микроорганизмов на питательных средах. На плотных питательных средах микроорганизмы образуют колонии – видимые скопления микроорганизмов. Культуры, выращенные на плотных средах, называют агаровыми. Неподвижные и малоподвижные микроорганизмы образуют изолированные колонии.

Колонии изучают, просматривая невооруженным глазом и с помощью лупы, характеризуют по признакам, представленным в таблице 3. 

Этапы выделения чистых культур бактерий, и идентификация. — Студопедия

Чистой культурой называется популяция бактерий од­ного вида или одной разновидности, выращенная на питательной среде. Многие виды бактерий подразделяют по одному признаку на биологические варианты — биовары. Биовары, различающие­ся по биохимическим свойствам, называют хемоварами, по анти­генным свойствам — сероварами, по чувствительности к фагу — фаговарами. Культуры микроорганизмов одного и того же вида, или биовара, выделенные из различных источников или в разное время из одного и того же источника, называют штаммами, которые обычно обозначаются номерами или какими-либо сим­волами. Чистые культуры бактерий в диагностических бактерио­логических лабораториях получают из изолированных колоний, пересевая их петлей в пробирки с твердыми или, реже, жидкими питательными средами.

Колония представляет собой видимое изолированное скоп­ление особей одного вида микроорганизмов, образующееся в результате размножения одной бактериальной клетки на плотной питательной среде (на поверхности или в глубине ее). Колонии бактерий разных видов отличаются друг от друга по своей мор­фологии, цвету и другим признакам.

Чистую культуру бактерий получают для проведения диагно­стических исследований — идентификации,которая достигается путем определения морфологических, культуральных, биохимиче­ских и других признаков микроорганизма.

Морфологические и тинкториальные признаки бактерий изучают при микроскопическом исследовании мазков, окрашенных разными методами, и нативных препаратов.

Культуральные свойства характеризуются питатель­ными потребностями, условиями и типом роста бактерий на плот­ных и жидких питательных средах. Они устанавливаются по мор­фологии колоний и особенностям роста культуры.

Биохимические признаки бактерий определяются на­бором конститутивных и индуцибельных ферментов, присущих определенному роду, виду, варианту. В бактериологической прак­тике таксономическое значение имеют чаще всего сахаролитические и протеолитические ферменты бактерий, которые определя­ют на дифференциально-диагностических средах.

При идентификации бактерий до рода и вида обращают вни­мание на пигменты, окрашивающие колонии и культуральную среду в разнообразные цвета. Например, красный пигмент обра­зуют Serratia marcescens, золотистый пигмент — Staphylococcus aureus (золотистый стафилококк), сине-зеленый пигмент — Pseu-domonas aeruginosa.

Для установления биовара (хемовара, серовара, фаготипа) проводят дополнительные исследования по выялвениб соответствующего маркера – определению фермента, антигена, чувствительности к Фанам.

Метод распределительных тарелок для изоляции микроорганизмов

Разнообразные методы были разработаны для изоляции микроорганизмов, в основном бактерий, из образца или из образцов культур, а метод культивирования на чашках является одним из наиболее широко используемых методов культивирования для изоляции бактерий.

Методы культивирования обычно используются в лаборатории для различных целей, для которых они предназначены. Показания к культуре организма в основном выполнены -

• Для демонстрации культурных характеристик бактерий (например,г. цвет, текстура, размер, высота и т. д.).
• Для выделения бактерий отдельными колониями из образца, содержащего более 1 бактерии.
• Для определения чувствительности и / или устойчивости бактерий к определенным лекарствам / антибиотикам или исследуемым веществам.
• Для получения достаточного роста бактерии для различных биохимических и других тестов.
• Для оценки количества жизнеспособных бактерий в образце.
• Для ведения поголовья.
• Для транспортировки или кратковременного хранения образца (например, посев на укол).

Для выделения микроорганизмов из образца обычно используются три типа методов:

• Техника разливочной плиты
• Техника распределительной пластины
• Техника полосовой пластины

В этой статье мы обсудим метод Spread Plate для выделения микроорганизмов в микробиологической лаборатории.

Ознакомьтесь с техникой культивирования в чашке для выделения микроорганизмов

Ознакомьтесь с техникой культивирования на планшетах для выделения микроорганизмов

ПРИНЦИП ТЕХНИКИ КУЛЬТУРЫ РАСПРЕДЕЛИТЕЛЬНОЙ ПЛАСТИНЫ

Метод культивирования в чашках - один из широко используемых методов культивирования для изоляции микроорганизмов, особенно бактерий, в лаборатории. В этом методе используется серийно разведенный образец, содержащий 2 или более бактерий или микробов (смешанная культура), который тонким слоем наносят на чашки с затвердевшей агаровой средой с помощью стерильной L-образной стеклянной палочки (Spreader), в то время как Медиа пластина вращается на поворотном столе.

Принцип, лежащий в основе этого метода, заключается в том, что при вращении чашки со средой на определенном этапе отдельные клетки осаждаются с помощью изогнутого стеклянного стержня (разбрасывателя) на поверхность среды с агаром. Некоторые клетки, присутствующие в образце / разбавленном образце, будут отделены друг от друга расстоянием, достаточным для того, чтобы развивающиеся колонии были свободны друг от друга.

ТРЕБОВАНИЯ К ТЕХНИКЕ РАЗМЕЩЕНИЯ ПЛАСТИН

• 24-часовая питательная бульонная культура двух или более бактерий (смешанная культура) или образец / образец.
• Питательная агаровая среда или любая другая среда
• Шесть пробирок для стерильной воды по 9 мл
• Стерильные чашки Петри
• Градуированная пипетка (1 мл или 1000 мл)
• Градуированная пипетка (0,1 мл или 100 мл)
• Г-образный разбрасыватель стекла
• 95% этанол или изопропиловый спирт
• Горелка Бунзена или лампа Spirit
• Стакан
• Маркер

ПРОЦЕДУРА КУЛЬТУРЫ РАСПРЕДЕЛИТЕЛЬНОЙ ПЛАСТИНЫ

⇒ Приготовьте питательную агаровую среду (NAM) и промаркируйте стерильные чашки Петри цифрами от 1 до 6.Поместите промаркированные пробирки в штатив для пробирок.

УЗНАТЬ: Как приготовить питательную агаровую среду в лаборатории?

⇒ Теперь вылейте подготовленную питательную агаровую среду в стерильные чашки Петри в строгих асептических условиях. Дайте пластинам для печати затвердеть.

Серийные разведения образца / образца

⇒ Пометьте 6 бланков стерильной воды (9 мл стерильной воды в каждой пробирке) цифрами от 1 до 6 с помощью маркера.

⇒ Хорошо перемешайте бульонную культуру 24-часовой давности или образец для равномерного распределения бактериальных клеток в пробирке.

⇒ После перемешивания снимите ватный тампон и асептически перенесите 1 мл микробной суспензии из пробирки с культурой в бланк стерильной воды №. 1 с помощью градуированной пипетки.

⇒ Встряхните трубку № 1, чтобы хорошо перемешать содержимое и равномерно распределить бактериальные клетки. Перенесите 1 мл этого раствора в пустую пробирку для воды № 2 с помощью градуированной пипетки.

Примечание: Каждый раз используйте отдельную стерильную пипетку для переноса содержимого из одной пробирки в другую.

⇒ Таким образом, сделайте последовательные разбавления до шести водных бланков (№ 1 - № 6).

Посев образца / образца на пластины со средой

⇒ Возьмите 95% спирт в стакан и окуните в него L-образный стеклянный разбрасыватель.

⇒ Теперь перенесите по 0,1 или 100 мл бактериальной суспензии из пробирки №. 1–6 на чашки с затвердевшей агаровой средой, помеченные цифрами 1–6, каждый раз используя отдельную стерильную пипетку.

⇒ Удалите стеклянный стержень из спирта и простерилизуйте изогнутую часть в горелке Бунзена или в пламени спиртовой лампы. Охладите 15–20 секунд.

⇒ Поместите пластины для материала с образцом на поворотный столик для чашек Петри, снимите крышку / крышку или пластину для материала и поверните поворотный стол.

⇒ Слегка прикоснитесь стерильным распределителем к поверхности агаровой среды и двигайте им вперед и назад, пока вращается вращающийся столик, чтобы равномерно распределить образец по поверхности агаровой среды.

⇒ Замените крышку / крышку планшета с инокулированной средой, когда поворотный столик для чашек Петри перестает вращаться.

⇒ Погрузите L-образный стеклянный разбрасыватель в стакан со спиртом и подожгите его для стерилизации.

⇒ Повторите этот шаг со всеми пластинами со средой и стерилизуйте разбрасыватель стекла каждый раз после использования.

⇒ Инкубируйте чашки в перевернутом положении при оптимальной температуре (обычно 37 ° C) в течение 24–48 часов.

Проверьте чашки на появление отдельных колоний, растущих в агаризованной среде.

РЕЗУЛЬТАТЫ ТЕХНИКИ РАЗМЕЩЕНИЯ ПЛИТ

Колонии в чашках со средой для культур, засеянные серийными разведениями образца, будут иметь все меньшее и меньшее количество. колоний с увеличением фактора разведения, что означает максимальное количество. колоний разовьется на планшете № 1 и минимум нет. колоний в чашке №6, который будет более или менее равномерно распределен по всей тарелке.

Выберите отдельную и хорошо развитую колонию и запишите такие характеристики, как цвет, форма, размер, внешний вид, высота, пигментация и т. Д.

Эти колонии могут быть перенесены, т.е. субкультивированы в чашки со свежей средой путем нанесения штрихов для получения чистой культуры бактериальных клеток для дальнейшего изучения.

МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ… ..

⇒ Протокол должен соблюдаться во всех асептических условиях, предпочтительно в ламинарном воздушном потоке (шкаф безопасности), чтобы избежать любого загрязнения.

⇒ Точно измерьте количество при приготовлении серийных разведений образца.

⇒ Дайте покрытому материалу равномерно застыть. Не засевайте образец на чашках с частично затвердевшей средой.

⇒ Точно измерьте количество разбавленного образца во время посева на чашки с затвердевшей средой.

⇒ Равномерно распределите образец на планшете со средой, чтобы получить дискретные и хорошо развитые колонии.

⇒ Стерилизуйте L-образный разбрасыватель стекла каждый раз после его использования, чтобы избежать ошибок и загрязнения.

Привет, я основатель и разработчик Paramedics World, блога, посвященного фельдшерам. Я техник в медицинской лаборатории, веб-разработчик и библиофил. Мое самое большое хобби - обучать и мотивировать других людей делать то, что они хотят делать в жизни.

Техника разливной пластинки для изоляции микроорганизмов

Разнообразные методы были разработаны для изоляции микроорганизмов, в основном бактерий, из образца или из образцов культур, и метод заливки в чашку является одним из самых простых методов изоляции бактерий.

Методы культивирования обычно используются в лаборатории для различных целей, для которых они предназначены. Показания к культуре организма в основном выполнены -

• Для демонстрации культурных характеристик бактерий (например,г. цвет, текстура, размер, высота и т. д.).
• Для выделения бактерий отдельными колониями из образца, содержащего более 1 бактерии.
• Для определения чувствительности и / или устойчивости бактерий к определенным лекарствам / антибиотикам или исследуемым веществам.
• Для получения достаточного роста бактерии для различных биохимических и других тестов.
• Для оценки количества жизнеспособных бактерий в образце.
• Для ведения поголовья.
• Для транспортировки или кратковременного хранения образца (например, посев на укол).

Для выделения микроорганизмов из образца обычно используются три типа методов:

• Техника разливочной плиты
• Техника распределительной пластины
• Техника полосовой пластины

В этой статье мы обсудим метод Pour Plate для выделения микроорганизмов в микробиологической лаборатории.

Ознакомьтесь с техникой культивирования на чашках для выделения микроорганизмов

СПОСОБ КУЛЬТУРЫ ДЛЯ ИЗОЛЯЦИИ МИКРООРГАНИЗМА / БАКТЕРИЙ В ЧИСТОЙ КУЛЬТУРЕ

ПРИНЦИП ТЕХНИКИ ПЛИТКИ

⇒ Современный метод культивирования в чашках был первоначально разработан в лаборатории известного бактериолога и отца бактериологии доктора Роберта Коха.

⇒ В методике Pour Plate последовательные разведения инокулята (серийное разведение исходного образца старой бульонной культуры) добавляют в стерильные чашки Петри, содержащие расплавленную и охлажденную (40-45 ° C) агаровую среду, и тщательно перемешивают вращая пластины, которым дают затвердеть.После инкубации планшеты проверяют на наличие отдельных колоний, растущих в среде.

⇒ Чистые колонии различного размера, формы и цвета могут быть выделены или перенесены в пробирки, содержащие жидкую культуральную среду (бульон), или непосредственно инокулированы на твердые агаризованные среды методом штриховой пластинки для получения чистых культур.

⇒ Методика культивирования Pour Plate также используется как средство определения количества жизнеспособных организмов в жидкости, такой как вода, молоко, моча или бульон, а также для определения гемолитической активности глубоких колоний некоторых бактерий. таких как стрептококки, используя агаровую среду, содержащую кровь.

Методика полосовой пластины для изоляции микроорганизмов

Разнообразные методы были разработаны для изоляции микроорганизмов, в основном бактерий, из образца или культур, и метод «Стрэйк-планшеты» является одним из наиболее широко используемых методов для получения дискретных и хорошо развитых колоний микробов.

Методы культивирования обычно используются в лаборатории для различных целей, для которых они предназначены. Показания к культуре организма в основном выполнены -

• Для демонстрации культурных характеристик бактерий (например,г. цвет, текстура, размер, высота и т. д.).
• Для выделения бактерий отдельными колониями из образца, содержащего более 1 бактерии.
• Для определения чувствительности и / или устойчивости бактерий к определенным лекарствам / антибиотикам или исследуемым веществам.
• Для получения достаточного роста бактерии для различных биохимических и других тестов.
• Для оценки количества жизнеспособных бактерий в образце.
• Для ведения поголовья.
• Для транспортировки или кратковременного хранения образца (например, посев на укол).

Для выделения микроорганизмов из образца обычно используются три типа методов:

• Техника разливочной плиты
• Техника распределительной пластины
• Техника полосовой пластины

В этой статье мы обсудим метод Streak Plate для выделения микроорганизмов в микробиологической лаборатории.

Ознакомьтесь с техникой культивирования в чашке для выделения микроорганизмов

ТЕХНИКА КУЛЬТУРЫ НА ПЛАСТИНАХ ДЛЯ ИЗОЛЯЦИИ МИКРООРГАНИЗМА / БАКТЕРИЙ В ЧИСТОЙ КУЛЬТУРЕ

ПРИНЦИП ТЕХНИКИ РАБОЧЕЙ ПЛАСТИНЫ

Метод Streak Plate для выделения микроорганизмов является наиболее практичным методом получения дискретных и хорошо развитых колоний микробов в чистых культурах.

Первоначально он был разработан двумя бактериологами, Леффлером и Гаффки, в лаборатории Роберта Коха (отца бактериологии).

В методике планшетов с полосами стерилизованную петлю или иглу для переноса погружают в смешанную культуру образца или подходящую разбавленную суспензию организмов или бульонных культур, которые затем наносят штрихами на поверхность планшетов со стерильной средой, чтобы сделать параллельные, неперекрывающиеся. полоски, которые затем инкубируют при оптимальных температурах в течение 24-48 часов обычно (для бактерий) или в течение нескольких недель в случае грибов.

Целью этого метода является получение отдельных, хорошо развитых колоний микроорганизмов, которые являются чистыми, т.е.е. рост происходит из одной клетки / споры бактерий.

Ознакомьтесь с техникой культивирования на чашках для выделения микроорганизмов

СПОСОБ КУЛЬТУРЫ ДЛЯ ИЗОЛЯЦИИ МИКРООРГАНИЗМА / БАКТЕРИЙ В ЧИСТОЙ КУЛЬТУРЕ

ТРЕБОВАНИЯ К ТЕХНИКЕ ПЛИТЫ

• 24-часовая питательная бульонная культура двух или более бактерий (смешанная культура) или образец / образец.
• Питательный агар, среда
• Шесть пробирок для стерильной воды по 9 мл
• Стерильные чашки Петри
• Градуированная пипетка (1 мл или 1000 мл)
• Горелка Бунзена или лампа Spirit
• Маркер

ПРОЦЕДУРА РАЗМЕЩЕНИЯ ПЛАСТИНЫ

⇒ Приготовьте питательную агаровую среду (NAM) и промаркируйте стерильную чашку Петри идентификационным номером пациента.& Свидание.

УЗНАТЬ: Как приготовить питательную агаровую среду в лаборатории?

⇒ Теперь вылейте подготовленную питательную агаровую среду в стерильные чашки Петри в строгих асептических условиях. Дайте пластинам для печати затвердеть.

Обычно метод «Streak plate» выполняется путем нанесения штрихов из образца непосредственно на чашки со средой с агаром, но в некоторых случаях, когда в образце присутствует более плотная популяция микроорганизмов, есть подозрение, что проводится серийное разведение образца, а затем Разбавленный образец наносят штрихами на чашки с затвердевшим агаром.

Следуйте этапу разбавления, если требуется, в противном случае следуйте непосредственно протоколу штриховки (метод T-штрихов или метод квадранта)

Серийные разведения образца / образца

⇒ Пометьте 6 бланков стерильной воды (9 мл стерильной воды в каждой пробирке) цифрами от 1 до 6 с помощью маркера. Кроме того, промаркируйте стерильные чашки Петри цифрами от 1 до 6. Вылейте агаровую среду в чашки и отложите для застывания.

⇒ Поместите промаркированные пробирки в штатив для пробирок.Хорошо перемешайте бульонную культуру 24-часовой давности для равномерного распределения бактериальных клеток в пробирке.

⇒ После перемешивания снимите ватный тампон и асептически перенесите 1 мл бактериальной суспензии из пробирки с культурой в бланк стерильной воды №. 1 с помощью градуированной пипетки.

⇒ Встряхните трубку № 1, чтобы хорошо перемешать содержимое и равномерно распределить бактериальные клетки. Перенесите 1 мл этого раствора в пустую пробирку для воды № 2 с помощью градуированной пипетки.

Примечание: Каждый раз используйте отдельную стерильную пипетку для переноса содержимого из одной пробирки в другую.

⇒ Таким образом, сделайте последовательные разбавления до шести водных бланков (№ 1 - № 6).

Посев / штриховка образца на пластинах со средой

Существуют различные методы или образцы штрихов, разработанные для посева образца на чашки со средой для изоляции микроорганизмов.

Но в большинстве микробиологических лабораторий обычно используются три метода выделения микроорганизмов в чистых культурах, а именно:

• Метод параллельных штрихов (квадрант)
• Метод зигзагообразной штриховки (квадрант)
• Метод T-полосы (три сектора)

Метод параллельных квадрантов полос и метод квадрантов зигзагообразных полос - это методы квадрантов, тогда как метод Т-полосок - это метод трех секторов.

Метод параллельных полос квадранта обычно используется в лабораториях для изоляции микроорганизмов. Тем не менее, использование методов нанесения полос и характер полос варьируется от лаборатории к лаборатории.

Метод параллельных полос в квадранте

⇒ Держите пробирку с образцом или бульон для культивирования смешанной культуры или пробирку с разбавленным образцом в левой руке.

⇒ Теперь простерилизуйте петлю для посева в пламени горелки Бунзена или лампы Spirit, удерживая ее в правой руке. Удалите ватный тампон из трубки и немедленно зажгите горловину трубки.

⇒ Вставьте стерилизованную петлю для посева в пробирку с питательной средой и выньте одну петлю с культурой.

⇒ Незамедлительно обожгите горлышко пробирки, замените ватную пробку и поместите пробирку в штатив для пробирок.

⇒ Теперь возьмите чашку с застывшей стерильной средой в левой руке под углом 60 ° и поместите посевной материал (петлю, содержащую каплю образца) на поверхность агара в области 1 (на самом дальнем от вас крае. ).

⇒ Подожгите инокуляционную петлю и охладите в течение 5-10 секунд или сразу же прикоснувшись к неиспользованной области затвердевшей агаровой среды в чашке с питательной средой. Нанесите штрихи на посевной материал из стороны в сторону параллельными линиями на площади 1.

⇒ Снимите петлю и закройте тарелку с посевной средой. Повторно разожгите и охладите петлю, поверните пластину со средой на 90 ° против часовой стрелки, прикоснитесь стерилизованной петлей для посева к углу культуры в области 1 и проведите ею несколько раз по агару в области 2, несколько раз ударяя по исходной полосе.Помните, что петля никогда не должна снова входить в область 1.

⇒ Снимите петлю и закройте тарелку с посевной средой. Повторно разожгите и охладите петлю и поверните пластину для материала на 90 ° против часовой стрелки. Теперь нанесите полосу по области 3 так же, как и по области 2, несколько раз поразив последнюю область.

⇒ Повторно разожгите и охладите петлю и поверните пластину материала на 90 °. Прикоснитесь петлей к углу посевной полосы в области 3 и нанесите посевной материал на агар.

⇒ Наконец, последняя полоса делается зигзагообразно, касаясь угла культуральной полоски в области 4 и зигзагообразно проводя ее, образуя хвост в культуре.Помните, что нельзя перекрывать этот замыкающий хвост какой-либо из областей квадранта.

⇒ Установите на место крышку чашки с засеянной средой и простерилизуйте посевную петлю в пламени горелки Бунзена или спиртовой лампы.

⇒ Инкубируйте все чашки при оптимальной температуре, обычно при 37 ° C, в перевернутом положении в течение 24–48 часов.

Ознакомьтесь с методом Т-образных штрихов по методике «Штрих-пластинки» для выделения микроорганизмов

Ознакомьтесь с методом зигзагообразного квадранта метода полосовой пластинки для изоляции микроорганизмов

Осмотрите чашки на предмет появления отдельных колоний, растущих в квадрантах в агаризованной среде.Колонии за пределами квадранта считаются заражением.

РЕЗУЛЬТАТЫ ТЕХНИКИ КУЛЬТУРЫ ПОЛОСНОЙ ПЛАСТИНЫ

Как правило, сплошной рост будет наблюдаться там, где была сделана начальная полоса, рост менее плотный вдали от полоски, и отдельные колонии будут присутствовать в последней зоне и хвостовой полоске.

Если разбавленный образец использовался для инокуляции планшетов со средой, колонии в планшетах со средой будут иметь все меньшее и меньшее количество.колоний с увеличением фактора разведения, что означает максимальное количество. колоний разовьется на планшете № 1 и минимум нет. колоний в чашке № 6, который будет более или менее равномерно распределен по штриховым линиям.

Выделение микроорганизмов - онлайн-видео на ppt скачать

Презентация на тему: «Выделение микроорганизмов» - стенограмма презентации:

1 Выделение микроорганизмов
Lab 8 Abeer Saati

2 Выделение микроорганизмов
Бактерии повсюду.В воде, почве и пище, на коже и кишечнике нормальная флора. В человеческом теле есть миллиарды бактерий, которые создают нормальную флору, борющуюся с вторжением патогенов.

3 Серийное разведение (изоляция от почвы)
Сделайте разведение от 10-1 до 10-4, используя стерильную дистиллированную воду. Только один мл каждого разведения переносится в чашки Петри с картофельным агаром с декстрозой (PDA) для грибков и N.А. для бактерий. Распределите почву прямо поверх нескольких чашек Петри, содержащих одну и ту же среду, чтобы учесть любые недостающие виды грибов. Все образцы инкубируют в течение 7 дней при 28 ° C для грибов и 24 часа при 37 ° C для бактерий.

4

5 Очистка микроорганизмов
- Подготовьте подходящую среду (питательный агар для бактерий) картофельный агар с декстрозой для грибов.- Сделайте диски из каждого восстановленного грибка и перенесите на свежие чашки КПК, по одному виду в каждой чашке, и инкубируйте его в течение 7 дней при 28˚C. - С помощью стерильной иглы соберите бактерии из одной колонии, прикоснувшись к ростку бактерий, и перенесите на свежие чашки N.A, по одному виду в каждой чашке, используя метод штриховых планшетов, и инкубируйте в течение 24 часов при 37 ° C.

6 Очистка от микроорганизмов
Важность штриховки Штрих - это метод, используемый для выделения чистого штамма от одного вида микроорганизмов, часто бактерий.Затем из полученных колоний могут быть взяты образцы, и микробиологическая культура может быть выращена на новой чашке, чтобы можно было идентифицировать, изучить или протестировать организм. Типы штриховых пластин (квадрантная и простая)

7 Процедура 1. Стерилизуйте посевную петлю в горелке Бунзена, пока она не станет докрасна. Дайте остыть. 2. Выберите изолированную колонию из культуры чашки с агаром и распределите ее по первому квадранту (примерно 1/4 чашки).3. Обожгите петлю. 4. Поверните пластину на 90, затем нанесите полосу на следующий квадрант, не перекрывая предыдущие полосы. 5. Обожгите петлю. 6. Поверните пластину на 90 ° и нанесите полосу в следующий квадрант, как в шаге 4. 7. Подожгите петлю. 8. Повторите нанесение штрихов на оставшуюся часть пластины. 9. Переверните планшет и инкубируйте при 37 ° C в течение 24 часов.

8 Характеристика микроорганизмов
Культура грибов Микроскоп для грибов Изображение грибов Aspergillus

Смотрите также

• 
  После родов выделения зеленоватые
• 
  После месячных серые выделения
• 
  Слабые коричневые выделения на ранних сроках беременности
• 
  Коричневые выделения при беременности на ранних сроках 5 недель без боли
• 
  Выделения соплевидные прозрачные
• 
  При ретрохориальной гематоме нет выделений
• 
  Зуд и жжение в интимной зоне у женщин без выделений как лечить
• 
  Выделение долей детям при использовании материнского
• 
  Выделения из заднего
• 
  Светлые выделения на раннем сроке беременности
• 
  Коричневые выделения а по узи все хорошо