Схема выделения чистой культуры аэробов

Выделение чистой культуры аэробных бактерий — Студопедия.Нет

Выделение микроорганизмов из различных материалов и получение их культур широко используется в лабораторной практике для микробиологической диагностики инфекционных заболеваний.

Чистой культурой называется популяция бактерий одного вида, полученная в изолированном состоянии (например, на питательной среде).

     Выделение чистой культуры аэробных бактерий достигается механическим разобщением исследуемого материала при посеве на питательные среды в присутствии кислорода.

Луи Пастер предложил для этой цели последовательное разведение исследуемого материала в жидкой питательной среде, однако выделить чистую культуру этим методом очень сложно, т.к. при этом требуется очень большое количество разведений.

Проблему выделения чистых культур решил Роберт Кох. Он предложил исследуемый материал разводить в пробирках с расплавленным и остуженным до температуры 45-50 °С МПА (количество разведений зависит от исходной обсемененности материала.). Затем содержимое каждой пробирки выливают в стерильную чашку Петри, которые помещают в термостат. На следующий день посевы изучают. Отбирают подозрительные колонии, изучают их макроскопически и микроскопически в окрашенных препаратах. Далее производят пересев колонии в пробирку со скошенным МПА. На следующий день проверяют чистоту выделенной культуры визуально и микроскопически. В настоящее время метод Коха применяется, в основном, для подсчета количества микробов в исследуемом материале.

В практических лабораториях обычно для выделения чистых культур используется метод Дригальского – поверхностный последовательный рассев исследуемого материала петлей или шпателем на три чашки (три сектора) с МПА. Процесс выделения чистой культуры можно разделить на несколько этапов.

                                Материал направляют в бактериологическую лабораторию с направлением, в котором указан предполагаемый диагноз.

Первый этап. Из исследуемого материала готовят мазок, окрашивают по Граму или другим методом (в зависимости от предполагаемого диагноза) и микроскопируют.

             Далее  производят посев материала  на три чашки Петри с питательной средой последовательно. Материал забирают бактериальной петлёй и наносят на поверхность питательной среды в первой чашке Петри, затем на поверхность среды во второй чашке,и в третьей.  Только после посева на третью чашку петлю прожигают в пламени спиртовки. Чашки подписывают на донышке и ставят вверх дном в термостат при температуре 37 °С на 18-24 часа.

Второй этап. На следующий день посевы просматривают и отбирают «подозрительные» колонии. «Подозрительными» являются колонии предполагаемого возбудителя. Изучают морфологию бактерий исследуемых колоний путем приготовления мазка, окрашенного по методу Грама. При обнаружении в мазке бактерий, имеющих морфологические и тинкториальные свойства предполагаемого возбудителя,  производят пересев колонии в пробирку со скошенным МПА для выделения и накопления чистой культуры. Пробирки подписывают и помещают в термостат при температуре 37 °С на 18-24 часа.

Третий этап. На следующий день отмечают характер роста выделенной чистой культуры. Проводят макроскопическое (визуальное) исследование посевов. Визуально чистая культура характеризуется однородным ростом (колонии должны быть однотипными). Далее проводят микроскопическое изучение культуры. При обнаружении в мазке морфологически и тинкториально однородных клеток, делают вывод о получении чистой культуры и продолжают исследование. Изучают биохимические, антигенные и патогенные свойства бактерий  для идентификации выделенной культуры, то есть определения вида, а иногда и биовара, серовара, фаговара.

  Кроме упомянутых методов, в бактериологической практике иногда применяют и другие, например, для выделения протея, обладающего «ползучим» ростом, используют метод Шукевича. Исследуемый материал засевают в конденсационную воду скошенного МПА. Бактерии, обладающие ползучим ростом, из конденсационной воды вползают на поверхность агара. На следующий день проверяют чистоту выделенной культуры. Из верхнего края налета делают мазок, окрашивают по Грамму и микроскопируют.

   Для выделения чистой культуры микробов с трудом культивируемых на питательных средах (например, пневмококков), используют биологический метод – заражение наиболее восприимчивых к данному виду возбудителя животных. После гибели или появления признаков заболевания животных забивают и производят посев крови и органов на питательные среды и микроскопическое исследование мазков-отпечатков из органов. Далее исследование проводят как в методе Дригальского.

Чистую культуру аэробных бактерий можно также получить, если на исследуемый материал воздействовать каким-либо физическим или химическим фактором, оказывающим избирательное антибактериальное действие. Например: для выделения чистых культур спорообразующих бактерий, исследуемый материал прогревают при температуре 80 °С в течение 20 минут или кратковременно кипятят для уничтожения вегетативных форм. Споры при этом сохраняются и при посеве материала на питательную среду прорастают. Далее чистую культуру получают обычным путем.

Для выделения чистой культуры возбудителя чумы посевы инкубируют при температуре 25 °С. Данный температурный режим подавляет рост сопутствующей микрофлоры.

  Для получения чистой культуры кислотоустойчивых бактерий (микобактерии туберкулеза) исследуемый материал (мокроту) обрабатывают 2% серной кислотой, уничтожающей сопутствующую флору, нейтрализуют щелочью, после чего производят посев на питательную среду.

Чистая культура бактерий и методы ее выделения

Методы выделения чистых культур микроорганизмов

Культивирование микроорганизмов, помимо состава питательной сре­ды, зависит от физических и химических факторов (температура, кислотность, аэрация, свет и т. д.). При этом количественные показатели каждого из них неодинаковы и определяются особенностями метаболиз­ма каждой группы бактерий. Существуют методы культивирования мик­роорганизмов на твердых и в жидких питательных средах в аэробных, анаэробных и других условиях.

Методы выделения чистых культур аэробных микроорганизмов. Для того, чтобы получить изолированные колонии, при нанесении материал распределяют так, чтобы клетки бактерий были удалены друг от друга. Для получения чистой культуры используют две основные группы методов:

а) мето­ды, основанные на принципе механического разделения микроорганизмов;

б) методы, основанные на биологиче­ских свойствах микроорганизмов.

Методы, основанные на принципе механического разде­ления микроорганизмов

Рассев шпателем по Дригальскому. Берут 3 чашки Петри с питательной средой. На 1-ю чашку петлей или пипеткой наносят кап­лю исследуемого материала и растирают шпателем по всей поверхности питательного агара. Затем шпатель пе­реносят во 2-ю чашку и втирают оставшуюся на шпателе культуру в поверхность питательной среды. Далее шпа­тель переносят в 3-ю чашку и аналогичным образом про­изводят посев. На 1-й чашке вырастает максимальное количество колоний, на 3-й — минимальное. В зависимо­сти от содержания микробных клеток в исследуемом ма­териале на одной из чашек вырастают отдельные коло­нии, пригодные для выделения чистой культуры микро­организма.

Метод Пастера (метод разведений). Из исследуемого материала готовят ряд последовательных, чаще десятикратных серийных разведений в жидкой стерильной среде или физиологическом растворе в пробирках. Далее высевают материал газоном по 0,5 мл из каждой пробирки. Предполагают, что в какой-то из пробирок останется количество микроорганизмов, поддающихся подсчету при высеве на пластинчатые среды. Этот метод дает возможность подсчитать микробное число в исследуемом материале. (Микробное число — количество колоний на последней чашке с ростом микроорганизмов, умноженное на степень разведения материала).

Рассев петлей (посев штрихами). Берут одну чашку Петри с питательным агаром и делят ее на 4 сектора, проводя разграничительные линии на внешней стороне дна чашки. Исследуемый ма­териал петлей вносят в первый сектор и проводят ею па­раллельные линии по всему сектору на расстоянии одна от другой около 5 мм. Этой же петлей, не изменяя ее положения по отношению к агару, проводят такие же линии на других секторах чашки. В том месте, где на агар попало большое количество микробных клеток, рост микроорганизмов будет в виде сплошного штриха. На секторах с небольшим количеством клеток вырастают отдельные колонии. Кроме того, можно наливать разведен­ные растворы смешанной культуры на поверхность твер­дых сред в чашках.

Метод фильтрации. Основан на пропускании исследуемого материала через специальные фильтры с определенным диаметром пор и разделении содержа­щихся микроорганизмов по величине. Этот метод при­меняется главным образом для очистки вирусов от бак­терий, а также при получении фагов и токсинов (в фильтрате — чистый фаг, очищенный токсин).

Методы, основанные на биологических свойствах мик­роорганизмов

Создание оптимальных условий для размножения

• Создание оптимального температурного режима для избирательного подавления размножения сопутствующей микрофлоры при низкой температуре и получения культур психрофильных или термофильных бактерий. Большинство микробов неплохо развиваются при 35-37°С, иерсинии хорошо растут при 22°С, лептоспиры культивируют при 30°С. Термофильные бактерии растут при температурах, лежащих за пределами температурных режимов прочих сопутствующих видов бактерий (так, кампилобактер культивируют при 42°С).
• Создание условий для аэробиоза или анаэробиоза. Большинство микроорганизмов хорошо растут в присутствии атмосферного кислорода. Облигатные анаэробы растут в условиях, исключающих присутствие атмосферного кислорода (возбудители столбняка, ботулизма, бифидумбактерии, бактероиды и др.). Микроаэрофильные микроорганизмы растут только при низком содержании кислорода и повышенном содержании СО2 (кампилобактер, геликобактер).
• Метод обогащения. Исследуемый материал за­севают на элективные питательные среды, способствую­щие росту определенного вида микроорганизмов.

Метод Пастера (метод предельных разведений).Заключается в том, что из исследуемого материала делают ряд последовательных разведений в жидкой питательной среде. Для этого каплю посевного материала вносят в пробирку со стерильной жидкой средой, из нее каплю переносят в следующую пробирку и так засевают до 8…10 пробирок. С каждым разведением количество микробных клеток, попадающих в среду, будет уменьшаться и можно получить такое разведение, в котором во всей пробирке со средой будет находиться только одна микробная клетка, из которой разовьется чистая культура микроорганизма.

Так как в жидких средах микробы растут диффузно, т.е. легко распределяются во всей среде, то изолировать одну микробную клетку от другой трудно. Таким образом, метод Пастера не всегда обеспечивает получение чистой культуры. Поэтому в настоящее время этот метод используется, главным образом, для предварительного уменьшения концентрации микроорганизмов в материале перед посевом его в плотную среду для получения изолированных колоний.

Методы механического разделения микроорганизмов с использованием плотных питательных сред.К таким методам относятся метод Коха и метод Дригальского.

Метод Коха (метод глубинного посева).

Исследуемый материал вносят бактериологической петлей или пастеровской пипеткой в пробирку с расплавленной плотной питательной средой. Равномерно размешивают содержимое пробирки, вращая ее между ладонями. Каплю разведенного материала переносят во вторую пробирку, из второй – в третью и т.д. Содержимое каждой пробирки, начиная с первой, выливают в стерильные чашки Петри. После застывания среды в чашках, их помещают в термостат для культивирования.

Для выделения анаэробных микроорганизмов по методу Коха необходимо ограничить доступ кислорода к культуре.

С этой целью поверхность глубинного посева в чашке Петри заливают стерильной смесью парафина и вазелина (1:1). Можно также оставлять посевной материал, тщательно перемешанный с агаризованной средой, непосредственно в пробирке.

Ватную пробку при этом заменяют резиновой или заливают поверхность агара смесью парафина и вазелинового масла. Чтобы извлечь выросшие колонии анаэробных микроорганизмов, пробирки слегка нагревают, быстро вращая над пламенем горелки. Агар, прилегающий к стенкам, расплавляется, и столбик легко выскальзывает в подготовленную чашку Петри. Далее столбик с агаром разрезают стерильным скальпелем, колонии извлекают стерильной петлей или стерильной капиллярной рубкой и переносят в жидкую среду.

Метод Дригальского основан на механическом разделении микробных клеток на поверхности плотной питательной среды в чашках Петри.

Каждая микробная клетка, фиксируясь в определенном месте, начинает размножаться, образуя колонию.

На поверхность среды вносят каплю исследуемого материала.

Затем с помощью стерильного шпателя эту каплю распределяют по всей питательной среде (посев газоном).

Посев также можно проводить штрихом, используя бактериологическую петлю. Этим же шпателем или петлей осуществляют посев во вторую, третью и т.д. чашки. Как правило, в первой чашке после культивирования посева появляется рост микробов в виде сплошного налета, в последующих чашках содержание микроорганизмов снижается и образуются изолированные колонии, из которых отсевом можно легко выделить чистую культуру.

Таким образом, в первых секторах получается сплошной рост, а вдоль последующих штрихов вырастут обособленные колонии, представляющие собой потомство одной клетки.

В целях экономии сред и посуды можно пользоваться одной чашкой, разделив ее на сектора, и последовательно засевать их штрихом (метод истощающего штриха).

Для этого материал берут петлей и проводят ею ряд параллельных штрихов сначала по поверхности первого сектора, а затем последовательно оставшимися на петле клетками засевают все другие сектора.

При каждом последующем штрихе происходит уменьшение количества засеваемых клеток.

Метод выделения чистых культур с помощью химических веществ используется при изолировании культур микроорганизмов, устойчивых к определенным химическим веществам.

Например, с помощью этого метода можно выделить чистую культуру туберкулезных микобактерий, устойчивых к действию кислот, щелочей и спирта. В этом случае исследуемый материал перед посевом заливают 15 % раствором кислоты или антиформином и выдерживают в термостате в течение 3…4 часов.

После воздействия кислоты или щелочи клетки туберкулезной палочки остаются живыми, а все другие микроорганизмы, содержащиеся в исследуемом материале, погибают. После нейтрализации кислоты или щелочи обработанный материал высевают на плотную среду и получают изолированные колонии возбудителя туберкулеза.

Биологические методы выделения чистых культур патогенных микроорганизмов основаны на заражении исследуемым материалом лабораторных животных, восприимчивых к данному виду возбудителя.

Если патогенный микроорганизм содержится в исследуемом объекте, то лабораторное животное заболевает и погибает. После вскрытия павшего животного из внутренних органов делают посевы на специальные среды, на которых вырастают чистые культуры выделяемых микробов.

Выделение чистой культуры бактерий

Чистой называют культуру, содержащую микроорганизмы одного вида и полученную как потомство одной клетки. Чистые культуры можно получить из исходной микробной клетки, изолиро­ванной при помощи микроманипулятора, или из изолированных колоний путем их пересева в отдельные пробирки с питательной средой.

Для выделения чистой культуры используют следующие методы.

1. Метод Дригалъского.При этом методе расплавленную питательную среду разливают в 3 чашки Петри. В первую чашку вносят одну каплю исследуемого материала и сте­рильным шпателем распределяют его по поверхности питательной среды. Затем шпатель переносят во вторую и далее в третью чашки, втирая в поверхность питательных сред оставшийся на нем материал.

При посеве этим методом на второй и на третьей чашках вырастают изолированные колонии. Полученные отдельные колонии пересевают в пробирки с питательной средой для получения чистой культуры микроорганизма.

2. Метод параллельных штрихов.При этом способе материал с помощью бактериологической петли распределяют по поверхности агара параллельными штрихами в одном направлении.

Затем, повернув чашку на 90°, проводят штрихи в направлении, перпендикулярном первым штрихам. При таком способе посева материал, находящийся в петле, расходу­ется постепенно, и по линиям штрихов, нанесенных в конце посева, вырастают изолированные колонии микробов.

3. Метод Коха (метод рассева в глубине среды).При этом методе в пробирку с агаром, расплавленным и остуженным до 43-45°С, вносят одну бактериологическую петлю исследуемого материала и тщательно перемешивают.

После этого из этой пробирки одну петлю материала переносят во вторую пробирку, а затем из нее – в третью пробирку. Приготовленные разведения бактерий выливают из пробирок в стериль­ные чашки Петри. После застывания среды чашки помещают в термостат. Количество колоний в чашках с питательной средой уменьшается по мере разведения материала.

Контрольные вопросы по теме занятия:

1. Характер роста бактерий в жидких, на полужидких и плотных питательных средах.

2. Характеристика колоний микроорганизмов.

3. Пигменты бактерий и их роль для микроорганизмов.

4. методы выделения чистых культур бактерий.

Литература для подготовки к занятию:

Основная литература:

1. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. Под ред. А.А.Воробьева. М., 2004.

Дополнительная литература:

1. Л.Б. Борисов. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. М., 2002.

2. О.К. Поздеев. Медицинская микробиология.М., ГЭОТАР-МЕДИА, 2005.

3. Медицинская микробиология. Справочник. Под ред. В.И. Покровского и О.К. Поздеева. М., ГЭОТАР-МЕД, 1998.

ЗАНЯТИЕ 5

ТЕМА ЗАНЯТИЯ: Ферменты бактерий. Изучение ферментативной активности микроорганизмов. Дыхание бактерий. Методы культивирования и выделения чистой культуры анаэробов.

УЧЕБНАЯ ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ: Ознакомиться с ферментами бактерий.

Изучить методы определения ферментативной активности микроорганизмов. Ознакомиться с процессами дыхания бактерий. Изучить методы культивирования и выделения чистой культуры анаэробов.

ЗАДАЧИ ЗАНЯТИЯ:

1. Ознакомиться с ферментами бактерий.

2. Изучить методы определения ферментативной активности микроорганизмов.

3. Ознакомиться с процессами дыхания бактерий.

4. Изучить методы культивирования и выделения чистой культуры анаэробов.

Ферменты бактерий

Все биохимические процессы в клетке микро­организмов, связанные с метаболизмом, ростом и размножением, совершаются при участии ферментов (энзимов).

Ферменты синтезируются самой микробной клеткой, и имеют сложное строение. Они представляют собой либо только белок с высокой молекулярной массой (трипсин, пепсин и др.), либо состоят из белка (апофермента), связанного с кофактором (коферментом). Кофермент может быть низкомолекулярным неорганическим (металл) или органическим ве­ществом.

Классификация ферментов основана на типах реакций, которые они катализируют.

Все ферменты делятся на шесть классов:

1). Оксидоредуктазы — ферменты переноса электронов. Эти ферменты катализируют окис­лительно-восстановительные реакции. К ним отно­сятся дегидрогеназы (НАД, НАДФ, ФАД), каталаза, цитохромы.

2).Трансферазы — ферменты переноса групп между молекулами от одних соединений к другим. К ним относятся ацетилтрансфераза, фосфотрансфераза, аминотрансфераза.

3). Гидролазы — ферменты переноса функциональных групп с участием воды. К этому классу ферментов относятся пептидгидролазы, глюкозидаза, амилазы, эстеразы, липаза, фосфатаза.

4). Лиазы — ферменты, отщепляющие или присоединяющие без участия воды различные соединения с двойной связью.

К этим ферментам относятся пируватдекарбоксилаза, альдолаза.

5). Изомеразы — ферменты, переносящие группы внутри молекул с образованием изомерных форм. К этим ферментам относятся триизофосфатизомераза, глюкозофосфатизомераза.

6). Лигазы (синтетазы) — ферменты, объединяющие две молекулы с одновременным разрывом фосфатных связей с использованием энергии АТФ. К лигазам относятся ферменты, катализирующие синтез сложных органических веществ из простых соединений (аспарагинсинтетаза, кокарбоксилазы).

Активность ферментов измеряют в международных еди­ницах (ME). 1 ME соответствует количеству ферментов, пре­вращающему один микромоль субстрата в 1 минуту в стандарт­ных условиях.

У бактерий различают эндоферменты и экзоферменты.

Эндоферменты находятся внутри бактериальной клетки, катализиру­ют внутриклеточные процессы обмена веществ. Экзоферменты выделяются во вне­шнюю среду и выполняют функцию расщепления сложных питательных веществ.

Ферменты агрессии. У патогенных бактерий имеется особая группа экзоферментов, которые называются ферментами агрессии. Они выполняют функции облегчения проникновения и распространения бактерий в тканях организма хозяина и ослабления его защитных свойств.

К ферментам агрессии относятся: гиалуронидаза, нейраминидаза, коллагеназа, протеазы, фибринолизин, гемолизин, лейкоцидин.

Конститутивные и индуцибельные ферменты. Ферменты, которые синтезируются клеткой с постоянной скоростью, независимо от наличия субстрата в среде называются конститутивными. Индуцибельные (адаптивные) ферменты образуются только в присутствии соответствующего субстрата в сре­де.

Например, фермент бета-галактозидазаначинает синтезироваться только при добавлении в питательную среду углевода лактозы, которую этот фермент расщепляет с образованием глюкозы и галактозы.

Методы определения ферментативной активности микробов

Обязательным условием идентификации выделенной чистой культуры бактерий является определение ферментативной активности в отношении углеводов и белков (биохимический «паспорт» вида).

Для выявления ферментов, расщепляющих углеводы (сахаролитические ферменты) используют дифференциально-диагностические среды Гисса.

В состав сред Гисса входит пептонная вода, индикатор рН, поплавок для улавливания газа и один из углеводов (глюкоза, лактоза, мальтоза, маннит, сахароза, крахмал и т.д.). Если бактерии расщепляют углевод, то образуется кислота и при этом меняется цвет среды за счет находящегося в ней индикатора рН. Большинство патогенных бактерий расщепляют углеводы с образованием только кислоты; некоторые виды ферментируют углеводы с образование кислоты и газа (СО2).

При этом меняется цвет среды и в поплавке появляется пузырек газа.

Протеолитическая активность бактерий. Показателями глубокого расщепления белка является образование индола, аммиака, сероводорода. Для выявления этих газообразных веществ делают посевы чистой культуры бактерий на мясо-пептонный бульон или пептонную воду в пробирки со специальными бумажными индикаторами.

При наличии продуктов расщепления меняется цвет соответствующего индикатора.

Протеолитическую активность бактерий определяют также путем посева чистой культуры уколом в столбик желатина по наличию и характеру разжижения среды, например, в виде перевернутой елочки, гвоздя, воронки и т.д.

Энергетический метаболизм

Это совокупность биохимических реакций, результатом которых является образование (накопление энергии) и расщепление (расход энергии) макроэргических связей в молекулах АТФ.

У бактерий АТФ может синтезироваться в результате процессов брожения и дыхания.

Брожение. Более древний, низкоэффективный способ получения энергии, при котором в результате расщепления молекулы глюкозы образуется 2 молекулы АТФ. Конечными продуктами брожения являются СО2, вода, спирты и органические кислоты.

Процесс происходит без участия кислорода.

Дыханием называют процесс окислительного фосфорилирования углеводов с образованием молекул АТФ, СО2 и воды. При распаде одной молекулы глюкозы высвобождаются 12 электронов, которые проходят через цепь дыхательных ферментов, отдавая энергию для синтеза 36 молекул АТФ. Освобождение дыхательной цепи от электронов осуществляют вещества, называемые акцепторами электронов.

К таким веществам относится кислород, сульфаты, нитраты, карбонаты. Если конечным акцептором электронов служит мо­лекулярный кислород, дыхание называют аэробным. В случае конечной акцепции электронов другими соединениями дыхание называют анаэробным.

По типу дыхания бактерии классифицируют на че­тыре основные группы:

1. Облигатные (строгие) аэробырастут при свободном доступе кислорода (возбудитель ту­беркулеза).

Микроаэрофилы растут при низкой (до 1%) концентрации кислорода и повышенной концентрации углекислого газа (гемофильная палочка).

Факультативные анаэробы могут расти как в присутствии кислорода, так и в анаэробных условиях (кишечная палочка).

4. Облигатные (строгие) анаэробы могут расти только при пол­ном отсутствии кислорода в окружающей среде (возбудители столбняка, ботулизма, газовой гангрены).

Выделение чистых культур микроорганизмов

Чистой культурой называют такую культуру, которая содержит микроорганизмы одного вида. Выделение чистых культур бактерий – обязательный этап бактериологического исследования в лабораторной диагностике инфекционных болезней, в изучении микробной загрязненности различных объектов окружающей среды, и, в целом, при любой работе с микроорганизмами.

Исследуемый материал (гной, мокрота, фекалии, кровь и другой материал от больных; вода, почва, воздух, пищевые продукты, трупы животных и человека, переносчики) обычно содержит ассоциации микробов.

Выделение чистой культуры позволяет изучить морфологические, культуральные, биохимические, антигенные и другие признаки, по совокупности которых определяется видовая и типовая принадлежность возбудителя, то есть производится его идентификация.

Для выделения чистых культур микроорганизмов используют методы, которые можно разделить на несколько групп.

Метод Пастера – последовательное разведение исследуемого материала в жидкой питательной среде до концентрации одной клетки в объеме (имеет историческое значение).

2. Метод Коха («пластинчатые разводки») – последовательное разведение исследуемого материала в расплавленном агаре (температура 48-500С), с последующим разливом в чашки Петри, где агар застывает.

Высевы делают, как правило, из трех-четырех последних разведений, где бактерий становится мало и, в дальнейшем, при росте на чашках Петри появляются изолированные колонии, образующиеся из одной исходной материнской клетки. Из изолированных колоний в глубине агара получают чистую культуру бактерий пересевом на свежие среды.

Метод Шукевича – применяется для получения чистой культуры протея и других микроорганизмов обладающих «ползущим» ростом. Посев исследуемого материала производят в конденсационную воду у основания скошенного агара. Подвижные микробы (протей) способны подниматься вверх по скошенному агару, неподвижные формы остаются расти внизу на месте посева.

Пересевая верхние края культуры можно получить чистую культуру.

4. Метод Дригальского – широко применяется в бактериологической практике, при этом исследуемый материал разводят в пробирке стерильным физиологическим раствором или бульоном.

Одну каплю материала вносят в первую чашку и стерильным стеклянным шпателем распределяют по поверхности среды. Затем этим же шпателем (не прожигая его в пламени горелки) делают такой же посев во второй и третьей чашках. С каждым посевом бактерий на шпателе остается все меньше и меньше и, при посеве на третью чашку, бактерии будут распределяться по поверхности питательной среды отдельно друг от друга.

Через 1-7 сут выдерживания чашек в термостате (в зависимости от скорости роста микроорганизмов) на третьей чашке каждая бактерия дает клон клеток, образуя изолированную колонию, которую пересевают на скошенный агар с целью накопления чистой культуры.

5. Метод Вейнберга. Особые трудности возникают при выделении чистых культур облигатных анаэробов.

Если контакт с молекулярным кислородом не вызывает сразу же гибели клеток, то посев производят по методу Дригальского, но после этого чашки сразу помещают в анаэростат. Однако чаще пользуются методом разведения. Сущность его заключается в том, что разведения исследуемого материала проводят в расплавленной и охлажденной до 45-500С агаризированной питательной среде. Делают 6-10 последовательных разведений, затем среду в пробирках быстро охлаждают и заливают поверхность слоем смеси парафина и вазелинового масла, чтобы помешать проникновению воздуха в толщу питательной среды.

Иногда питательную среду после посева и перемешивания переносят в стерильные трубки Бурри или капиллярные пипетки Пастера, концы которых запаивают. При удачном разведении в пробирках, трубках Бурри, пипетках Пастера вырастают изолированные колонии анаэробов.

Чтобы изолированные колонии хорошо были видны, используют осветленные питательные среды. Для извлечения изолированных колоний анаэробов, пробирку слегка нагревают, вращая ее над пламенем, при этом агар, прилегающий к стенкам, плавится и содержимое пробирки в виде агарового столбика выскальзывает в стерильную чашку Петри.

Столбик агара разрезают стерильным пинцетом и извлекают колонии петлей. Извлеченные колонии помещают в жидкую среду, благоприятную для развития выделяемых микроорганизмов (например, среду Китта-Тароцци). Агаризированную среду из трубки Бурри выдувают, пропуская газ через ватную пробку.

6. Метод Хангейта – когда хотят получить изолированные колонии бактерий с особенно высокой чувствительностью к кислороду (строгие аэробы) используют метод вращающихся пробирок Хангейта.

Для этого расплавленную агаризированную среду засевают бактериями при постоянном токе через пробирку инертного газа, освобожденного от примеси кислорода. Затем пробирку закрывают резиновой пробкой и помещают горизонтально в зажим, вращающий пробирку, среда при этом равномерно распределяется по стенкам пробирки и застывает тонким слоем. Применение тонкого слоя в пробирке, заполненной газовой смесью, позволяет получить изолированные колонии, хорошо видимые невооруженным глазом.

Выделение отдельных клеток с помощью микроманипулятора. Микроманипулятор – прибор, позволяющий с помощью специальной микропипетки или микропетли извлекать одну клетку из суспензии. Эту операцию контролируют под микроскопом. На предметном столике микроскопа устанавливают влажную камеру, в которую помещают препарат «висячая капля».

В держателях операционных штативов закрепляют микропипетки (микропетли), перемещение которых в поле зрения микроскопа осуществляется с микронной точностью благодаря системе винтов и рычагов.

Исследователь, глядя в микроскоп, извлекает отдельные клетки микропипетками и переносит их в пробирки со стерильной жидкой средой для получения клона клеток.

Методы выделения чистых культур аэробных бактерий

Механического разобщения Биологические

Метод Пастера Метод Коха Биологический Физический

значение) разводок) Химический Метод Щукевича

Посев петлей Посев шпателем

(Метод Дригальского)

Методы выделения чистых культур (схема 11):

Методы механического разобщения основаны на разъединении микробов путем последовательного растирания исследуемого материа­ла по поверхности агара.

а) Метод Пастера – имеет историческое значение, предусматривает последовательное разведение исследуемого материала в жидкой питательной среде методом переката

б) Метод Коха – метод пластинчатых разводок – основан на последовательном разведении исследуемого материала мясо-пептонным агаром с последующей разливкой пробирок с разведенным материалом в чашки Петри

в) Метод Дригальского – при посеве материала, обильно обсемененного микрофлорой, используют 2–3 чашки для последовательного посева шпателем.

г) Посев петлей параллельными штрихами.

Биологические методы основаны на биологических свойствах возбудителей.

а) Биологический – заражение высокочувствительных животных, где микробы быстро размножаются и накапливаются.

В одних случаях, этот метод является единственным, позволяющим вы­делить культуру возбудителя от больного человека (например, при туляремии),в других случаях – он более чувствителен (например, выделение пневмококка на белых мышах или воз­будителя туберкулеза на морских свинках).

б) Химический – основан на кислотоустойчивости микобактерий. Для освобождения материала от сопутствующей флоры, его
обрабатывают раствором кислоты.

Вырастут только туберкулезные палочки, так как кислотоподатливые микробы погибли под действием кислоты.

в) Физический метод основан на устойчивости спор к нагреванию. Для выделения культуры спорообразующих бактерий из
смеси материал прогревают при 80°С и засевают на питательную среду. Вырастут только споровые бактерии, так как споры их остались живыми и дали рост.

г) Метод Щукевича – основан на высокой подвижности вуль­гарного протея, способного давать ползучий рост.

Методика пересева из колоний на скошенный агар и МПБ:

а) Пересев из колоний на скошенный агар

Приоткрывают крышку чашки, прокаленной остуженной петлей снимают часть отдельной колонии, открывают пробирку со стерильным скошенным агаром, держа ее в левой руке в наклонном положении, так, чтобы можно было наблюдать поверхность среды.

Переносят петлю с культурой в пробирку, не прикасаясь к стенкам, растирают по питательной среде, скользя по поверхности от одного края пробирки к другому, поднимая штрихи до верхушки среды – посев штрихом. Пробирку закрывают и, не выпуская из рук, подписывают название посеянного микроба и дату посева.

б) Пересев из колонии на мясо-пептонный бульон

Техника пересева на МПБ в основном такая же, как и при посеве на плотную среду.

При посеве на МПБ петлю с находящимся на ней материалом погружают в среду. Если материал вязкий и с петли не снимается, его растирают на стенке сосуда, а затем смывают жидкой средой. Жидкий материал, набираемый стерильной пастеровской или градуированной пипеткой, вливают в питательную среду.

В результате самостоятельной работы студент должен знать:

1.Методы выделения чистой культуры микроорганизмов

2. Методы культивирования микроорганизмов

Уметь:

1. Навыки соблюдения правил противоэпидемического режима и техники безопасности

2. Обеззараживать материал, проводить обработку рук

3. Приготовить препараты из колоний бактерий

4. Микроскопировать колоний

5. Окрашивать по Граму микроорганизмы

Этапы выделения чистых культур аэробов — Студопедия

Первый день: 1. Бактериоскопия по Граму или ориентировочным методом исследуемого материала, проводят не всегда.

2. Посев исследуемого материала на плотные среды.

Второй день: 1. Изучают характер роста и отмечают «типичные колонии».

2. Проводят бактериоскопию «типичных колоний».

3. Посев «типичных колоний» на жидкие и плотные среды в пробирках.

Третий день: 1. Просматривают агаровые культуры, если рост однородный – культуры чистые.

2. Проводят бактериоскопию бульонных культур, если в мазках одинаковые микроорганизмы – культуры чистые, приступают к идентификации.

Вопросы для обсуждения 

1. Программированный контроль по разделу «Морфология и структура микроорганизмов».

ТЕМА 4 Культуральные свойства микроорганизмов. Фазы роста микроорганизмов. Работа второго дня по выделению чистых культур аэробов. Методы идентификации. Выделение чистых культур анаэробов

Цель занятия. Программированный контроль по разделу «Морфология и структура микробов». Познакомиться с методикой изучения культуральных свойств микроорганизмов. Разобрать фазы роста микроорганизмов, методы идентификации, методы выделения чистых культур анаэробов.

Оборудование и материалы. Рабочие места бактериологов, посевы исследуемого материала, посевы разных микроорганизмов на плотных и жидких питательных средах, посевы микроорганизмов на дифференциально – диагностических питательных средах. Анаэростат, среды для выращивания анаэробов. Электронный ресурс, таблицы «Культуральные, протеолитические, биохимические свойства микроорганизмов»

Задание для самостоятельной работы студентов. 1. Выполнить работу второго дня по выделению чистых культур аэробов, результат бактериоскопии зарисовать. 2. Представить характеристику выросших колоний и биологических свойств микробов. 

Рис. 8

Культуральные свойства микроорганизмов

Культуральными свойствами называют особенности роста микроорганизмов на питательных средах. На плотных питательных средах микроорганизмы образуют колонии – видимые скопления микроорганизмов. Культуры, выращенные на плотных средах, называют агаровыми. Неподвижные и малоподвижные микроорганизмы образуют изолированные колонии.

Колонии изучают, просматривая невооруженным глазом и с помощью лупы, характеризуют по признакам, представленным в таблице 3. 

Методы выделения чистых культур аэробных бактерий — Студопедия

Механического разобщения Биологические

Метод Пастера Метод Коха Биологический Физический

(имеет историческое (пластинчатых

значение) разводок) Химический Метод Щукевича

Современные

Посев петлей Посев шпателем

(Метод Дригальского)

Методы выделения чистых культур (схема 11):

1. Методы механического разобщения основаны на разъединении микробов путем последовательного растирания исследуемого материа­ла по поверхности агара.

а) Метод Пастера – имеет историческое значение, предусматривает последовательное разведение исследуемого материала в жидкой питательной среде методом переката

б) Метод Коха – метод пластинчатых разводок – основан на последовательном разведении исследуемого материала мясо-пептонным агаром с последующей разливкой пробирок с разведенным материалом в чашки Петри

в) Метод Дригальского – при посеве материала, обильно обсемененного микрофлорой, используют 2–3 чашки для последовательного посева шпателем.

г) Посев петлей параллельными штрихами.

2. Биологические методы основаны на биологических свойствах возбудителей.

а) Биологический – заражение высокочувствительных животных, где микробы быстро размножаются и накапливаются. В одних случаях, этот метод является единственным, позволяющим вы­делить культуру возбудителя от больного человека (например, при туляремии),в других случаях – он более чувствителен (например, выделение пневмококка на белых мышах или воз­будителя туберкулеза на морских свинках).

б) Химический – основан на кислотоустойчивости микобактерий. Для освобождения материала от сопутствующей флоры, его
обрабатывают раствором кислоты. Вырастут только туберкулезные палочки, так как кислотоподатливые микробы погибли под действием кислоты.

в) Физический метод основан на устойчивости спор к нагреванию. Для выделения культуры спорообразующих бактерий из
смеси материал прогревают при 80°С и засевают на питательную среду. Вырастут только споровые бактерии, так как споры их остались живыми и дали рост.

г) Метод Щукевича – основан на высокой подвижности вуль­гарного протея, способного давать ползучий рост.

Методика пересева из колоний на скошенный агар и МПБ:

а) Пересев из колоний на скошенный агар

Приоткрывают крышку чашки, прокаленной остуженной петлей снимают часть отдельной колонии, открывают пробирку со стерильным скошенным агаром, держа ее в левой руке в наклонном положении, так, чтобы можно было наблюдать поверхность среды. Переносят петлю с культурой в пробирку, не прикасаясь к стенкам, растирают по питательной среде, скользя по поверхности от одного края пробирки к другому, поднимая штрихи до верхушки среды – посев штрихом. Пробирку закрывают и, не выпуская из рук, подписывают название посеянного микроба и дату посева.

б) Пересев из колонии на мясо-пептонный бульон

Техника пересева на МПБ в основном такая же, как и при посеве на плотную среду. При посеве на МПБ петлю с находящимся на ней материалом погружают в среду. Если материал вязкий и с петли не снимается, его растирают на стенке сосуда, а затем смывают жидкой средой. Жидкий материал, набираемый стерильной пастеровской или градуированной пипеткой, вливают в питательную среду.

В результате самостоятельной работы студент должен знать:

1. Методы выделения чистой культуры микроорганизмов

2. Методы культивирования микроорганизмов

Уметь:

1. Навыки соблюдения правил противоэпидемического режима и техники безопасности

2. Обеззараживать материал, проводить обработку рук

3. Приготовить препараты из колоний бактерий

4. Микроскопировать колоний

5. Окрашивать по Граму микроорганизмы

Урок на тему "Аэробы и анаэробы"

КОНСПЕКТ

Методы выделение чистых культур микроорганизмов аэробов и анаэробов.

План:

1.Методы выделения аэробов. Бактериологический метод: назначение, цель, этапы

2. Методы выделения анаэробов

1.Бактериологический (культуральный) метод — комплекс методов для выявления патогенных микроорганизмов у больного, у носителя или на объектах внешней среды. Это метод выделения, выращивания и определения свойств чистой культуры микроорганизмов с целью установления принадлежности к той или иной систематической группе (виду, роду) и называется их идентификация. Выделение чистой культуры основа бактериологического метода.

Чистая культура — микроорганизмы одного вида, полученные из одной или нескольких клеток в результате размножения на искусственной питательной среде. Бактериологическое исследование может быть использовано для диагностики, профилактики инфекционных заболеваний, для санитарно-гигиенической характеристики среды, окружающей человека, для научного исследования. Материал и метод бактериологического исследования зависят от цели анализа, условий среды, патогенеза и течения заболевания. В целом бактериологический метод исследования представляет собой многоэтапное бактериологическое исследование.

Выделение чистых культур аэробов занимает, как правило, три дня и производится по следующей схеме:

1-й день (I этап). - Основная цель этого дня – произвести посев исследуемого материала таким способом и методом, чтобы получить рост изолированных колоний.

1. Макроскопическая оценка исследуемого материала (объём, цвет, характер, консистенция). От этой оценки зависит подготовка материала к посеву и выбор сред. Механический метод выделения чистой культуры используют если: Материала много и он жидкий (моча, СМЖ), то материал центрифугируют и для посева используют осадок, предварительно слив надосадочную жидкость, таким образом, посевной материал содержит все микроорганизмы исследуемого материала. Если материал вязкий ( гной, мокрота, фекалии), то небольшую порцию материала растирают со стерильным физ. раствором и полученную эмульсию используют для посева. Если материал плотный (кусочки ткани или кости), то с них делают смыв стерильным физ. раствором и засевают на среды смывы.

Физический метод используют, если исследуемый материал по направлению предполагает наличие споровых культур, в таком случае часть или весь материал прогревают до + 800С, при этом сопутствующая вегетативная флора погибает, а сохранившиеся споры после посева прорастают и дают чистую культуру возбудителя.

Химический метод используют, если материал может предполагать наличие кислотоустойчивых бактерий, то в этом случае порцию материала обрабатывают 2-4 % раствором h3SO4, а затем нейтрализуют щёлочью под контролем индикатора и используют для посева. При такой обработке погибает вся сопутствующая флора, сохраняются только кислотоустойчивые бактерии. Соответственно поступают и при наличии щёлоче- и спиртоустойчивых бактерий.

Биологический метод. К этому методу относят добавление в питательную среду антибиотика, к которому устойчив предполагаемый возбудитель, этом случае гибнет под воздействием данного антибиотика вся сопутствующая флора в исследуемом материале. Также к биологическому методу относят заражение исследуемым материалом лабораторных животных, чувствительных к данному возбудителю, после чего у животного берут материал и высевают на питательные среды.

Метод элективных сред позволяет выделить определённого возбудителя, за счет нахождения в питательной среде элективного фактора к которому чувствительна сопутствующая флора.

2. В некоторых случаях проводят микроскопию мазка из исследуемого материала, окрашенного (обычно по Граму) - для предварительного ознакомления с микрофлорой и ориентировочного ответа, что может быть полезным в выборе питательной среды для посева.

3. Если в исследуемом материале заведомо мало выделяемого возбудителя, то такой материал засевают на среды обогащения, в этом случае бактериологическое исследование длиться дольше на один или несколько дней.

4.Затем посев материала на питательные среды для получения изолированных колоний. Среды подбирают также исходя из особенностей предполагаемого возбудителя и характера материала.

Способ посева может быть открытым или закрытым, что зависит от возможности предполагаемого возбудителя находиться в воздухе. Для того чтобы получить рост изолированных колоний можно использовать методы посева, выполненные с помощью бак. петли, шпателя, стеклянной палочки и ватного тампона:

А.Рассев можно произвести по методу Дригальского на три чашки Петри с питательной средой. Каплю материала наносят на первую чашку и распределяют шпателем по всей чашке. Затем этим же шпателем распределяют оставшуюся на нем культуру на второй чашке и таким же образом - на третьей. Наибольшее количество колоний вырастет на первой чашке, наименьшее - на третьей. В зависимости от того, сколько было микробных клеток в исследуемом материале, на одной из чашек вырастут изолированные колонии.

Б.Такого же результата можно достигнуть, произведя рассев на одной чашке. Для этого делят чашку на четыре сектора - метод посева по секторам. Исследуемый материал засевают бактериологической петлей штрихами на первом секторе, делая посевную площадку, затем, прокалив и остудив петлю, распределяют посев из первого сектора во 27 второй и таким же образом последовательно в третий и четвертый сектор. Из отдельных микробных клеток после суточного инкубирования в термостате образуются изолированные колонии.

Посев по секторам с посевной площадкой. Посев по секторам можно произвести и без посевной площадки. Начав с первого сектора без прокаливания петли произвести посев последовательно во втором, третьем и четвёртом секторах

В. Можно использовать и другие техники посева. Например, посев бактериологической петлёй штрихами или зигзагообразно по всей поверхности чашки Петри. Для этого исследуемый материал набирают стерильной петлей и втирают в поверхность среды возле края чашки.

После этого петлю стерилизуют в пламени, чтобы уничтожить избыток материала, охлаждают. Следующий этап посева начинают с места, где закончился предыдущий. Петлю кладут горизонтально на поверхность агара, где было сделана посевная площадка, проводят один-два раза по поверхности и делают штрихи по остальной среде. Необходимо пытаться, чтобы штрихи посева длились от края к краю чашки, не повреждали поверхности агара и располагались близко друг к другу. Этим искусственно продлевается линия посева и создаются возможности для получения изолированных колоний

Посев шпателем и тампоном в чашки Петри. Материал предварительно наносят на поверхность питательной среды возле края чашки петлей или пипеткой. Стерильный шпатель проносят через пламя, охлаждают, касаясь стенки чашки. Осторожными круговыми движениями распределяют материал равномерно по поверхности среды.

2-й день (II этап). Начинают данный этап с изучения культуральных свойств полученных колоний. На основании изучения этих характеристик, выросшие колонии разделяются на группы. Затем из исследуемой группы отбирают изолированную колонию, готовят мазок для микроскопического исследования с целью изучения морфологических и тинкториальных свойств и проверки однородности микробов в колонии (приготовление мазка, окраска по Граму). Из этой же колонии производят посев в пробирку со скошенным питательным агаром с целью накопления чистой культуры. Пробирку инкубируют в термостате 24 часа при температуре 37° С.

Техника посева в пробирки со скошенной средой: На скошенные среды переносят культуру из другой пробирки или с колоний на чашках. Прокалённой петлёй берут часть необходимой колонии с чашки Петри, чашку закрывают и отставляют. Пробирку держат в левой руке наклонном положении между большим и указательным пальцами так, чтобы поверхность среды можно было наблюдать. Петля - в правой руке. Пробку пробирки вынимают, зажимая их между мизинцем и ладонью. В таком положении она остаётся до конца посева. Край пробирки обжигают, переносят петлю, не прикасаясь к стенкам, в 29 пробирку и делают сплошной штриховой посев. Петлю прокаливают, ставят в штатив, край пробирки прокаливают и закрывают пробкой. Техника посева в конденсационную воду: выбирают свежескошенную среду, содержащую на дне каплю конденсационной жидкости. Исследуемую культуру забирают петлей, открывают пробку, обжигают края пробирки, осторожно, не касаясь среды и стенок, вносят в конденсационную воду петлю с культурой. У выраженных подвижных культур рост с конденсационной воды распространяется на влажную поверхность косяка.

3-й день (III этап).

1.Описывают культуральные свойства накопленной чистой культуры.

2.Проверка чистоты культуры, выросшей на скошенном агаре путем микроскопии мазка ( мазок окрашивают по Граму, в мазке должны быть однородные по морфологическим признакам и тинкториальным свойствам клетки). При однородности исследуемых бактерий выделение чистой культуры можно считать законченным.

3. Идентификация выделенной культуры проводится по: - биохимическим свойствам. Среды Гисса дифференциально-диагностические питательные среды для выявления ферментативной активности бактерий. Содержат 1% пептонную воду, 0,5% раствор определенного углевода (глюкоза, лактоза, мальтоза, манит, сахароза и др.) и индикатор Андреде (кислый фуксин в растворе NaOH). Среда при рН 7,2-7,4 – бесцветна, при ферментации углеводов приобретает красный цвет. В пробирки со средой помещают поплавок (небольшая трубочка, один конец которой запаян) для улавливания газообразных продуктов, образующихся при расщеплении углеводов.

чувсвительности к антибиотикам.

- антигенным свойствам - фагочувствительности - токсигенности и другим признакам. Фаготипирование по методу Фишера. Испытуемую культуру засевают на МПА, затем условно делят чашку на квадраты. В каждый квадрат наносят по одной капле различных фагов. После суточной инкубации в термостате отмечают квадраты, в которых отмечается лизис бактерий. Фаготип бактериальной культуры определяется типом лизирующего ее фага

Фагоидентификация по методу Отто. На чашку с МПА шпателем или петлёй выполняется посев выделенной культуры бактерий. Затем наносят каплю известного бактериофага и, наклонив чашку, дают капле несколько растечься по поверхности питательной среды. Через сутки наблюдают полную задержку роста в месте внесения диагностического фага.

4. Посевы инкубируют в термостате 24 часа при температуре 37° С. 4-й день (IV этап). Учет результатов и выдача ответа

2.Методы выделения анаэробов

Анаэробы растут и размножаются в условиях, исключающих доступ кислорода воздуха. Молекулярный кислород оказывает на них токсическое действие. Необходимую для существования энергию анаэробы получают путем расщепления органических и неорганических соединений, входящих в состав питательной среды. Для выращивания анаэробов необходимо создать определенные условия, сущность которых заключается в удалении молекулярного кислорода из питательной среды и пространства, окружающего эти культуры. Другим обязательным условием, обеспечивающим выделение анаэробов из исследуемого материала, является внесение большого количества посевного материала в питательную среду. А также условием может быть и режим инкубации – посевы со многими анаэробными культурами выдерживают в термостате при 420С 2-3 суток. Удаление кислорода из питательной среды.

Единственным отличием питательных сред, применяемых для выращивания анаэробов, служит пониженное содержание в них свободного кислорода. Самым простым способом удаления растворенного кислорода является кипячение. Непосредственно перед посевом материала пробирки с питательными средами кипятят в водяной бане в течение 10—20 мин. При кипячении из среды вытесняется воздух и, следовательно, удаляется кислород. Свежепрокипяченную питательную среду быстро охлаждают, погружая в лед или подставляя под струю холодной воды, чтобы не дать ей насытиться кислородом воздуха, и используют для посева. Для уменьшения диффузии кислорода из воздуха питательные среды заливают сверху стерильным вазелиновым или парафиновым маслом (толщина слоя 1—1,5 см). Засев среды производят пипеткой сквозь масло в наклонном положении пробирки. Можно использовать вещества, связывающие кислород. В качестве редуцирующих веществ используют глюкозу, аскорбиновую кислоту, цистеин, глютатион. Активно связываются с кислородом животные ткани паренхиматозных органов. На этом свойстве животных клеток основано приготовление питательной среды Китта—Тароцци, широко применяемой для выращивания анаэробов. В жидкие питательные среды помещают иногда пористые вещества: вату, пемзу, которые адсорбируют на своей поверхности пузырьки воздуха.

Удаление кислорода из окружающего пространства. Для создания бескислородных условий используют физические, химические и биологические факторы.

Физические способы культивирования анаэробов.

1.Способ Виньяля - Вейона. Берут 4-5 пробирок с 0,5% расплавленным и охлажденным до температуры 40-45 °С сахарным агаром. В содержимое одной из них вносят пипеткой небольшое количество исследуемого материала (1 мл.) и тщательно размешивают. Для уменьшения концентрации материала с целью получения изолированных колоний засеянную среду в количестве, соответствующем объему внесенного материала, переносят из 1-й пробирки во 2-ю, из 2-й в 3-ю. Затем содержимым каждой пробирки заполняют капилляры трех пастеровских пипеток. Чтобы предупредить застывание питательной среды в момент насасывания ее в пипетки, кончик их, пока он не обломан, погружают на 3-5 минут в стерильную воду температуры 45-50°С. После заполнения вытянутый конец трубки запаивают на спиртовке, а широкий заливают парафином и помещают в стеклянный цилиндр с ватой на дне. Через 2-3 суток в столбике агара вырастают ясно видимые колонии микробов-анаэробов. Выросшие колонии легко изолировать. Для этого капилляр надрезают напильником выше уровня намеченной колонии, надламывают, а колонию микроба, находящуюся в агаре, извлекают петлей и пересевают в свежую питательную среду.

2. Метод Перетца —

3. Выращивание анаэробов в условиях вакуума. Вакуумные условия для выращивания анаэробов создают в анаэростате или эксикаторе. Исследуемый материал или культуру микробов засевают в пробирки с жидкой средой или в чашки Петри с плотной питательной средой. Посевы помещают в анаэростат, который представляет собой толстостенный металлический (пластиковый, стеклянный) цилиндр с герметически привинчивающейся крышкой, на которой имеются вакуумметр и два крана, затем присоединяют его к насосу и выкачивают воздух. Степень разреженности воздуха определяют по показаниям вакуумметра. Колонии анаэробов в вакуумных условиях растут на поверхности плотной питательной среды. Можно создать бескислородные условия при помощи эксикатора, если эксикатор с краном, то по тому же принципу откачивается воздух, как и в анаэростате. Если эксикатор без крана, то в этом случае чашки с посевами кладут внутрь, ставят свечу и её зажигают, затем плотно притирают крышку. Пламя свечи выжгет весь кислород в эксикаторе и погаснет, таким образом, внутри эксикатора создадутся бескислородные условия.

Химические способы культивирования анаэробов.

Способ Аристовского. Материал, исследуемый на наличие анаэробов, засевают на среду в чашки Петри и помещают их в эксикатор, на дно которого кладут химический поглотитель кислорода: гидросульфит натрия или пирогаллол. В расширенную часть сосуда устанавливают на подставке чашки с посевами. Прибор помещают в термостат при температуре 37 °С на 24 - 48 ч.

Биологический метод выращивания анаэробов.

Способ Фортнера. В чашку Петри наливают толстым слоем сахарный агар. Посередине чашки в питательной среде вырезают стерильным скальпелем канавку шириной 1—1,5 см, которая делит питательную среду на две половины. Одну из них засевают культурой анаэробов или исследуемым на их наличие материалом, другую половину - культурой аэробов: чудесной палочкой (Serratia marcescens) или кишечной палочкой (Е. coli). Перед посевом чашки подсушивают в термостате, чтобы аэробы вместе с капельками влаги - не могли попасть на другую сторону чашки. Чашка закрывается, ее края запаиваются парафином (с целью не допустить попадания воздуха внутрь чашки). . В термостате чашки устанавливают вверх дном. Сначала вырастают в присутствии кислорода аэробы, создают тем самым благоприятные условия для роста анаэробов.

Питательные среды для выращивания анаэробов.

1. Среда Китта-Тароцци. обеспечивает рост многих спорообразующих и строгих аспорогенных анаэробов. Состоит из питательного бульона, 2% глюкозы и кусочков печени или мясного фарша для адсорбции кислорода. Перед посевом среду прогревают на кипящей водяной бане в течение 10-15 минут для удаления воздуха. После посева среду заливают небольшим слоем вазелинового масла. Выросшие анаэробы вызывают помутнение питательной среды.

2. Среда Вильсона-Блера (железо-сульфитный агар) используется для выделения анаэробных бактерий. Готовится из питательного агара, к которому добавляют 1% глюкозу, хлорид железа и сульфит натрия. Анаэробы образуют на среде колонии черного цвета за счет образования соединений железа с серой. Посев можно делать на поверхность среды, налитой в чашку Петри, а также в расплавленную среду в пробирке (рост в виде черных прожилок).

3.Среда Цейсслера - сахарный агар с кровью для выращивания и дифференциации анаэробов. Готовится следующим образом: к обычному мясопептонному агару добавляют 1- 2% глюкозу (рН среды =7,2—7,4) и стерилизуют в автоклаве при температуре 112° 20 минут. К 100 мл расплавленного, охлажденного до 45° агара добавляют 10 - 15 мл стерильно взятой дефебрилированной человеческой, лошадиной или бараньей крови, тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри. Перед использованием чашки следует выдерживать сутки при комнатной температуре. В основу определения вида анаэробов положена форма роста их на среде Цейсслера в анаэробных условиях.

4. Молоко по Тукаеву. К 1% пептонной воде прибавляют 5-6% обезжиренного молока, среду стерилизуют дробно при 1000C 3 дня подряд по 30 мин. Анаэробы дают рост в виде белого сгустка и просветления над ним среды. 5. 1% сахарный агар. Мясо-пептонный агар с добавлением 1% раствора глюкозы, стерилизуют в автоклаве при температуре 112° 20 минут, разливают в пробирки и в чашки Петри. Посев делают чаще в расплавленную среду, где анаэробы в толще среды дают колонии разнообразной формы .

Методы выделения чистых культур микроорганизмов

Культивирование микроорганизмов, помимо состава питательной сре­ды, зависит от физических и химических факторов (температура, кислотность, аэрация, свет и т. д.). При этом количественные показатели каждого из них неодинаковы и определяются особенностями метаболиз­ма каждой группы бактерий. Существуют методы культивирования мик­роорганизмов на твердых и в жидких питательных средах в аэробных, анаэробных и других условиях.

Методы выделения чистых культур аэробных микроорганизмов. Для того, чтобы получить изолированные колонии, при нанесении материал распределяют так, чтобы клетки бактерий были удалены друг от друга. Для получения чистой культуры используют две основные группы методов:

а) мето­ды, основанные на принципе механического разделения микроорганизмов;

б) методы, основанные на биологиче­ских свойствах микроорганизмов.

Методы, основанные на принципе механического разде­ления микроорганизмов

Рассев шпателем по Дригальскому. Берут 3 чашки Петри с питательной средой. На 1-ю чашку петлей или пипеткой наносят кап­лю исследуемого материала и растирают шпателем по всей поверхности питательного агара. Затем шпатель пе­реносят во 2-ю чашку и втирают оставшуюся на шпателе культуру в поверхность питательной среды. Далее шпа­тель переносят в 3-ю чашку и аналогичным образом про­изводят посев. На 1-й чашке вырастает максимальное количество колоний, на 3-й — минимальное. В зависимо­сти от содержания микробных клеток в исследуемом ма­териале на одной из чашек вырастают отдельные коло­нии, пригодные для выделения чистой культуры микро­организма.

Метод Пастера (метод разведений). Из исследуемого материала готовят ряд последовательных, чаще десятикратных серийных разведений в жидкой стерильной среде или физиологическом растворе в пробирках. Далее высевают материал газоном по 0,5 мл из каждой пробирки. Предполагают, что в какой-то из пробирок останется количество микроорганизмов, поддающихся подсчету при высеве на пластинчатые среды. Этот метод дает возможность подсчитать микробное число в исследуемом материале. (Микробное число - количество колоний на последней чашке с ростом микроорганизмов, умноженное на степень разведения материала).

Рассев петлей (посев штрихами). Берут одну чашку Петри с питательным агаром и делят ее на 4 сектора, проводя разграничительные линии на внешней стороне дна чашки. Исследуемый ма­териал петлей вносят в первый сектор и проводят ею па­раллельные линии по всему сектору на расстоянии одна от другой около 5 мм. Этой же петлей, не изменяя ее положения по отношению к агару, проводят такие же линии на других секторах чашки. В том месте, где на агар попало большое количество микробных клеток, рост микроорганизмов будет в виде сплошного штриха. На секторах с небольшим количеством клеток вырастают отдельные колонии. Кроме того, можно наливать разведен­ные растворы смешанной культуры на поверхность твер­дых сред в чашках.

Метод фильтрации. Основан на пропускании исследуемого материала через специальные фильтры с определенным диаметром пор и разделении содержа­щихся микроорганизмов по величине. Этот метод при­меняется главным образом для очистки вирусов от бак­терий, а также при получении фагов и токсинов (в фильтрате - чистый фаг, очищенный токсин).

Методы, основанные на биологических свойствах мик­роорганизмов

Создание оптимальных условий для размножения

· Создание оптимального температурного режима для избирательного подавления размножения сопутствующей микрофлоры при низкой температуре и получения культур психрофильных или термофильных бактерий. Большинство микробов неплохо развиваются при 35-37°С, иерсинии хорошо растут при 22°С, лептоспиры культивируют при 30°С. Термофильные бактерии растут при температурах, лежащих за пределами температурных режимов прочих сопутствующих видов бактерий (так, кампилобактер культивируют при 42°С).

· Создание условий для аэробиоза или анаэробиоза. Большинство микроорганизмов хорошо растут в присутствии атмосферного кислорода. Облигатные анаэробы растут в условиях, исключающих присутствие атмосферного кислорода (возбудители столбняка, ботулизма, бифидумбактерии, бактероиды и др.). Микроаэрофильные микроорганизмы растут только при низком содержании кислорода и повышенном содержании СО₂ (кампилобактер, геликобактер).

· Метод обогащения. Исследуемый материал за­севают на элективные питательные среды, способствую­щие росту определенного вида микроорганизмов.

Читайте также:

Урок 7 Обязательные бактерии-анаэробы. Выделение чистых культур

• Ресурс исследования
• Исследовать
  • Искусство и гуманитарные науки
  • Бизнес
  • Инженерная технология
  • Иностранный язык
  • История
  • Математика
  • Наука
  • Социальная наука

  Лучшие подкатегории

  • Продвинутая математика
  • Алгебра
  • Базовая математика
  • Исчисление
  • Геометрия
  • Линейная алгебра
  • Предалгебра
  • Предварительный расчет
  • Статистика и вероятность
  • Тригонометрия
  • другое →

  Лучшие подкатегории

  • Астрономия
  • Астрофизика
  • Биология
  • Химия
  • Науки о Земле
  • Наука об окружающей среде
  • Науки о здоровье
  • Физика
  • другое →

  Лучшие подкатегории

  • Антропология
  • Закон
  • Политология
  • Психология
  • Социология
  • другое →

  Лучшие подкатегории

  • Бухгалтерский учет
  • Экономика
  • Финансы
  • Менеджмент
  • другое →

  Лучшие подкатегории

  • Аэрокосмическая техника
  • Биоинженерия
  • Химическая инженерия
  • Гражданское строительство
  • Компьютерные науки
  • Электротехника
  • Промышленное проектирование
  • Машиностроение
  • Веб-дизайн
  • другое →

  Лучшие подкатегории

  • Архитектура
  • Связь
  • Английский
  • Гендерные исследования
  • Музыка
  • Исполнительское искусство
  • Философия
  • Религиоведение
  • Письмо
  • другое →

  Лучшие подкатегории

  .

  Сравнительная оценка различных типов сред для культивирования крови для выделения аэробов.

   @article {Gross1977ComparativeEO, title = {Сравнительная оценка различных типов сред для культивирования крови для выделения аэробов.}, автор = {P. Гросс, Р. Фрида и К. Рейли}, journal = {Журнал клинической микробиологии}, год = {1977}, объем = {6 4}, pages = { 362-6 } } 

  Было изучено возможное преимущество гипертонической сахарозной среды перед изотонической для выделения аэробных организмов из крови.Приблизительно 50 мл среды и 5 мл инокулята крови присутствовали в каждом флаконе с культурой. На первом этапе исследования бульон с добавками пептона (SPB) сравнивали с бульоном бруцелл, содержащим 10% сахарозы (BB-10S). По крайней мере, в одном из двух флаконов в каждом наборе в течение 7-месячного периода находилось 194 значимых клинических изолята; 160 (82%) изолятов… ПРОДОЛЖИТЬ ЧТЕНИЕ

  Сохранить в библиотеку

  Создать оповещение

  Цитировать

  Запустить Research Feed

  .

  чистых культур и нанесение штрихов: выделение отдельных бактериальных колоний из смешанного образца

  На чашке Петри, если одна бактерия подвергается нескольким циклам бесполого размножения, это приведет к образованию клональной колонии. Однако получение одной бактерии из смешанного образца, такого как почвенная суспензия, может быть трудным. Если взять одну петлю этой гетерогенной культуры, она может содержать до триллиона отдельных бактерий. Чтобы распространить такое количество бактерий на поверхность чашки с агаром и получить одну колонию, даже используя зигзагообразный узор, петлю нужно было бы непрерывно протягивать по поверхности достаточного количества чашек, установленных бок о бок, чтобы охватить целостность Острова Свободы.Очевидно, что ученые не используют столько пластин. Вместо этого они используют технику, называемую нанесением штрихов.

  Методика планшетов основана на постепенном разбавлении бактериального образца и выполняется на твердой поверхности одной чашки Петри. Для начала поверхность носителя визуально разделена на пять участков: четыре фрагмента окружности обозначены первыми четырьмя участками, а центр пластины - пятым. В результате из одной чашки Петри будет создано пять чашек с питанием.Затем, используя полную петлю желаемого посевного материала, на первом участке наносится зигзагообразный узор. Затем используется либо новая одноразовая петля, либо, в случае проволочной петли, ее стерилизуют горелкой Бунзена, обжигая ее до докрасна по всей длине проволоки. Это использование новой петли или петли для стерилизации пламенем удаляет все оставшиеся бактериальные клетки, способствуя их разведению. Затем горячий контур охлаждают на воздухе в течение нескольких секунд, а затем протягивают через первую секцию, чтобы создать три-четыре отдельных линии, каждая из которых несет только часть бактерий во вторую секцию.Остальные секции наносятся таким же образом, используя каждый раз стерильную петлю и однократно проходя через предыдущую полосу.

  При использовании этого цикла штриховки и стерилизации концентрация бактерий в каждой последующей секции должна быть снижена так, чтобы последняя секция содержала только несколько дискретно расположенных бактерий. После инкубации эти отдельные бактерии размножаются с образованием изолированных клональных колоний дочерних клеток, которые называются колониеобразующими единицами или КОЕ.Их можно собрать и повторно посеять, чтобы гарантировать, что в последующей работе будет задействован только один тип бактерий, называемый чистой культурой. Помимо выделения отдельных колоний из смешанной бактериальной культуры, метод посева штрихов также используется для отбора штаммов, специфичных для среды, определения морфологии бактериальных колоний или идентификации различных видов бактерий. В этом видео мы продемонстрируем, как выделить колонии отдельных бактерий из суспензии смешанных бактерий с помощью метода посева полос.

  Для начала наденьте лабораторные перчатки и лабораторный халат. Затем простерилизуйте рабочее пространство, используя 70% этанол. Затем выберите подходящую среду, которая будет поддерживать используемые виды или штамм бактерий, и начните подготовку среды. Здесь обычный агар LB готовится путем отвешивания десяти граммов предварительно приготовленной порошкообразной среды и 7,5 граммов агара. Добавьте взвешенные высушенные компоненты в стеклянную бутыль, которая вмещает вдвое больший конечный объем, чтобы избежать переполнения. Затем налейте в бутылку 500 миллилитров воды и плотно закройте ее.Стерилизуйте среду, поместив бутылку в автоклав, нагретый до 121 градуса Цельсия, на двадцать минут. После завершения используйте термостойкие перчатки или подставку под горячее, чтобы удалить носитель из машины, а затем сразу же закрутите крышку бутылки, чтобы плотно закрыть ее.

  Для использования в тот же день дайте носителю остыть, поместив бутылку в водяную баню, нагретую до примерно 45 градусов Цельсия, чтобы сохранить носитель в жидком состоянии. В качестве альтернативы носитель можно оставить при комнатной температуре для хранения в твердом состоянии.При необходимости поместите бутылку в микроволновую печь со слегка приоткрытой крышкой, чтобы среда расплавилась, и дайте ей остыть на водяной бане с температурой 45 градусов Цельсия.

  Затем возьмите упаковку стерильных чашек Петри и с помощью перманентного маркера пометьте их именем исследователя и носителя, а также датой. Затем перенесите требуемый объем среды в стерильный сосуд и при необходимости добавьте антибиотики или другие чувствительные компоненты. Здесь 50 миллилитров среды смешивают со 100 микролитрами канамицина до конечной концентрации 25 микрограммов на миллилитр.Вращайте трубку, чтобы обеспечить равномерное распределение добавленных компонентов в среде. Медленно, чтобы избежать образования пузырьков, налейте от 20 до 25 миллилитров культуральной среды примерно 45 градусов Цельсия в каждый из планшетов. Если появляются пузырьки или пена, быстро удалите их с помощью обычной пипетки и стерильного наконечника. Затем немедленно закройте все крышки, чтобы предотвратить загрязнение. Дайте агару затвердеть при комнатной температуре не менее двух часов или на ночь. После застывания храните планшеты для культивирования в перевернутом виде при температуре 4 градуса Цельсия, чтобы минимизировать конденсацию на поверхности среды.

  Для посева выбранной культуры сначала возьмите чистую культуральную чашку и снимите крышку. Быстро погрузите одноразовую стерильную петлю в желаемый посевной материал, а затем сразу же зигзагообразным движением протрите петлю по первому квадранту планшета. Закройте чашку крышкой, выбросьте использованную петлю для посева, а затем выберите новую стерильную петлю. Используя новую петлю, сделайте от трех до четырех штрихов, пересекающих исходную линию мазка, исходящую из первого квадранта, которая должна содержать относительно плотную популяцию бактерий во втором квадранте.Закройте крышку еще раз и выбросьте петлю. С новой петлей повторите это действие снова, но на этот раз переходя из второго квадранта в третий. Затем снова с новой петлей сделайте еще одну полоску с третьей на четвертую часть пластины. Наконец, свежей петлей сделайте последний штрих зигзагообразным узором от четвертого квадранта к центру пластины. Распространенность бактерий в этой области будет ниже, что в идеале позволит создать отдельные колонии из одной жизнеспособной материнской клетки.

  Установите на место крышку планшета и, если это подходит для бактерий, закройте планшет парапленкой, чтобы предотвратить поток воздуха. Переверните культуральную чашку вверх дном, чтобы избежать капель конденсата, а затем поместите при температуре, подходящей для роста. Здесь инкубатор настроен на 37 градусов Цельсия. Дайте планшету инкубироваться, пока не станут видны колонии бактерий. Чтобы создать клональную бактериальную популяцию, выберите одну отдельную колонию из этой чашки. Теперь с помощью стерильной петли коснитесь целевой колонии и, как и прежде, сделайте полосу в первом квадранте новой чашки.Продолжайте поочередно стерилизовать петлю и штриховать оставшиеся квадранты пластины, как показано ранее, заканчивая зигзагом к центру. Закройте чашку и поместите ее для инкубации до образования отдельных колоний. После выращивания этих колоний они обычно представляют собой чистые клональные штаммы.

  Исходная пластина для штриховки может содержать колонии, происходящие из клеток разных видов бактерий или клеток с различным генетическим составом, в зависимости от чистоты образца.Посредством последующего выделения одной колонии, где все единицы получены из общей материнской клетки, вторая процедура штриховки генерирует относительно клональную бактериальную популяцию, подходящую для дальнейшей характеристики или инокуляции в бульон.

  .

  Методика полосовой пластины для изоляции микроорганизмов

  Разнообразные методы были разработаны для изоляции микроорганизмов, в основном бактерий, из образца или культур, и метод Streak plate является одним из наиболее широко используемых методов для получения дискретных и хорошо развитых колоний микробов.

  Методы культивирования обычно используются в лаборатории для различных целей, для которых они предназначены. Показания к культуре организма в основном выполнены -

  • Для демонстрации культурных характеристик бактерий (например,г. цвет, фактура, размер, высота и т. д.).
  • Для выделения бактерий отдельными колониями из образца, содержащего более 1 бактерии.
  • Для определения чувствительности и / или устойчивости бактерий к определенным лекарствам / антибиотикам или исследуемым веществам.
  • Для получения достаточного роста бактерии для различных биохимических и других тестов.
  • Для оценки количества жизнеспособных бактерий в образце.
  • Для содержания поголовья.
  • Для транспортировки или кратковременного хранения образца (например, посев на укол).

  Обычно используются три метода выделения микроорганизмов из образца, а именно:

  • Техника разливочной плиты
  • Техника распределительной пластины
  • Техника полосовой пластины

  В этой статье мы обсудим метод Streak Plate для выделения микроорганизмов в микробиологической лаборатории.

  Ознакомьтесь с техникой культивирования в чашке для выделения микроорганизмов

  ТЕХНИКА КУЛЬТУРЫ НА ПЛАСТИНАХ ДЛЯ ИЗОЛЯЦИИ МИКРООРГАНИЗМА / БАКТЕРИЙ В ЧИСТОЙ КУЛЬТУРЕ

  ПРИНЦИП ТЕХНИКИ РАБОЧЕЙ ПЛАСТИНЫ

  Метод Streak Plate для выделения микроорганизмов является наиболее практичным методом получения дискретных и хорошо развитых колоний микробов в чистых культурах.

  Первоначально он был разработан двумя бактериологами, Леффлером и Гаффки, в лаборатории Роберта Коха (отца бактериологии).

  В методике планшетов с полосами стерилизованную петлю или иглу для переноса погружают в смешанную культуру образца или подходящую разбавленную суспензию организмов или бульонных культур, которые затем наносят штрихами на поверхность планшетов со стерильной средой, чтобы сделать параллельные, неперекрывающиеся. полоски, которые затем инкубируют при оптимальной температуре в течение 24-48 часов обычно (для бактерий) или в течение нескольких недель в случае грибов.

  Целью этого метода является получение отдельных, хорошо развитых колоний микроорганизмов, которые являются чистыми, т.е.е. рост происходит из одной клетки / споры бактерий.

  Ознакомьтесь с техникой культивирования на чашках для выделения микроорганизмов

  СПОСОБ КУЛЬТУРЫ ДЛЯ ИЗОЛЯЦИИ МИКРООРГАНИЗМА / БАКТЕРИЙ В ЧИСТОЙ КУЛЬТУРЕ

  ТРЕБОВАНИЯ К ТЕХНИКЕ ПЛИТЫ

  • 24-часовая питательная бульонная культура двух или более бактерий (смешанная культура) или образец / образец.
  • Питательный агар, среда
  • Шесть пробирок для стерильной воды по 9 мл
  • Стерильные чашки Петри
  • Градуированная пипетка (1 мл или 1000 мл)
  • Горелка Бунзена или лампа Spirit
  • Маркер

  ПРОЦЕДУРА РАЗМЕЩЕНИЯ ПЛИТЫ

  ⇒ Приготовьте питательную агаровую среду (NAM) и пометьте стерильную чашку Петри идентификационным номером пациента.& Свидание.

  УЗНАТЬ: Как приготовить питательную агаровую среду в лаборатории?

  ⇒ Теперь вылейте приготовленную питательную агаровую среду в стерильные чашки Петри в строгих асептических условиях. Дайте пластинам для печати затвердеть.

  Обычно метод «Streak plate» выполняется путем нанесения штрихов из образца непосредственно на чашки со средой с агаром, но в некоторых случаях, когда в образце присутствует более плотная популяция микроорганизмов, есть подозрение, что проводится серийное разведение образца, а затем Разбавленный образец наносят штрихами на чашки с затвердевшим агаром.

  Следуйте этапу разбавления, если требуется, в противном случае следуйте непосредственно протоколу штриховки (метод T-штрихов или метод квадранта)

  Серийные разведения образца / образца

  ⇒ Пометьте 6 бланков стерильной воды (9 мл стерильной воды в каждой пробирке) цифрами от 1 до 6 с помощью маркера. Кроме того, промаркируйте стерильные чашки Петри цифрами от 1 до 6. Вылейте агаровую среду в чашки и отложите для застывания.

  ⇒ Поместите промаркированные пробирки в штатив для пробирок.Хорошо перемешайте бульонную культуру 24-часовой давности для равномерного распределения бактериальных клеток в пробирке.

  ⇒ После перемешивания снимите ватный тампон и асептически перенесите 1 мл бактериальной суспензии из пробирки с культурой в бланк стерильной воды №. 1 с помощью градуированной пипетки.

  ⇒ Встряхните трубку № 1, чтобы хорошо перемешать содержимое и равномерно распределить бактериальные клетки. Перенесите 1 мл этого раствора в пустую пробирку для воды № 2 с помощью градуированной пипетки.

  Примечание: Каждый раз используйте отдельную стерильную пипетку для переноса содержимого из одной пробирки в другую.

  ⇒ Таким образом, сделайте последовательные разбавления до шести водных бланков (№ 1 - № 6).

  Посев / штриховка образца на пластинах со средой

  Существуют различные методы или образцы штрихов, разработанные для посева образца на чашки со средой для изоляции микроорганизмов.

  РАЗЛИЧНЫЕ СПОСОБЫ ПОСАДКИ

  Но в большинстве микробиологических лабораторий обычно используются три метода выделения микроорганизмов в чистых культурах, а именно:

  • Метод параллельных штрихов (квадрант)
  • Метод зигзагообразной штриховки (квадрант)
  • Метод T-полосы (три сектора)

  Метод параллельных квадрантов полос и метод квадрантов зигзагообразных полос - это методы квадрантов, тогда как метод Т-полосок - это метод трех секторов.

  Метод параллельных полос квадранта обычно используется в лабораториях для изоляции микроорганизмов. Тем не менее, использование методов нанесения полос и характер полос варьируется от лаборатории к лаборатории.

  ОБРАЗЕЦ СТЕКЛЯННЫХ РАЗЛИЧНЫХ - КАЖДАЯ ЛАБОРАТОРИЯ УСТАНАВЛИВАЕТ СВОИ СОПЫ

  Метод параллельных штрихов в квадранте

  ⇒ Держите пробирку с образцом или бульон для культивирования смешанной культуры или пробирку с разбавленным образцом в левой руке.

  ⇒ Теперь простерилизуйте петлю для посева в пламени горелки Бунзена или лампы Spirit, удерживая ее в правой руке. Удалите ватный тампон из трубки и немедленно зажгите горловину трубки.

  ⇒ Вставьте стерилизованную петлю для посева в пробирку с питательной средой и выньте одну петлю с культурой.

  ⇒ Незамедлительно обожгите горловину пробирки, замените ватную пробку и поместите пробирку в штатив для пробирок.

  ⇒ Теперь возьмите чашку с застывшей стерильной средой в левой руке под углом 60 ° и поместите посевной материал (петлю, содержащую каплю образца) на поверхность агара в области 1 (на самом дальнем от вас крае). ).

  ⇒ Подожгите посевную петлю и охладите в течение 5-10 секунд или сразу же, прикоснувшись к неиспользуемой области затвердевшей агаровой среды в чашке с питательной средой. Нанесите штрихи на посевной материал из стороны в сторону параллельными линиями на площади 1.

  ⇒ Снимите петлю и закройте тарелку с посевной средой. Повторно разожгите и охладите петлю, поверните пластину со средой на 90 ° против часовой стрелки, прикоснитесь стерилизованной петлей для посева к углу культуры в области 1 и проведите ею несколько раз по агару в области 2, несколько раз ударяя по исходной полосе.Помните, что петля никогда не должна снова входить в область 1.

  ⇒ Снимите петлю и закройте тарелку с посевной средой. Повторно разожгите и охладите петлю и поверните пластину для материала на 90 ° против часовой стрелки. Теперь пройдите по области 3 так же, как и по области 2, несколько раз поразив последнюю область.

  ⇒ Повторно разожгите и охладите петлю и поверните пластину материала на 90 °. Прикоснитесь петлей к углу посевной полосы в области 3 и нанесите посевной материал на агар.

  ⇒ Наконец, последняя полоса делается зигзагообразно, касаясь угла культуральной полосы в области 4 и зигзагообразно проводя ее, образуя хвост в культуре.Помните, что нельзя перекрывать этот замыкающий хвост какой-либо из областей квадранта.

  ⇒ Установите на место крышку планшета с засеянной средой и простерилизуйте петлю для посева в пламени горелки Бунзена или спиртовой лампы.

  ⇒ Инкубируйте все чашки при оптимальной температуре, обычно при 37 ° C, в перевернутом положении в течение 24–48 часов.

  Ознакомьтесь с методом Т-образных штрихов методики Streak Plate Technique для выделения микроорганизмов

  Ознакомьтесь с методом зигзагообразно-квадрантного метода полосовой пластинки для изоляции микроорганизмов

  Осмотрите чашки на предмет появления отдельных колоний, растущих в квадрантах в агаризованной среде.Колонии за пределами квадранта считаются заражением.

  РЕЗУЛЬТАТЫ ТЕХНИКИ КУЛЬТУРЫ ПОЛОСОВОЙ ПЛАСТИНЫ

  Как правило, сплошной рост будет наблюдаться там, где была сделана начальная полоса, рост менее плотный вдали от полоски, и отдельные колонии будут присутствовать в последней зоне и хвостовой полоске.

  Если разбавленный образец использовался для инокуляции чашек со средой, колонии в чашках со средой для культур будут иметь все меньшее и меньшее количество.колоний с увеличением фактора разведения, что означает максимальное количество. колоний разовьется на планшете № 1 и минимум нет. колоний в чашке № 6, который будет более или менее равномерно распределен по штриховым линиям.

  ПАРАЛЛЕЛЬНЫЕ ПОЛОСЫ - ТЕХНИКА КВАДРАНТНЫХ ПОЛОСОВ

  Выберите дискретную и хорошо развитую колонию и запишите такие характеристики, как цвет, форма, размер, внешний вид, высота, пигментация и т.

  Эти колонии могут быть перенесены i.е. субкультивировать в чашки со свежей средой с помощью штрихов или других методов культивирования для получения чистой культуры бактериальных клеток для дальнейшего изучения.

  МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ… ..

  ⇒ Протокол должен соблюдаться во всех асептических условиях, предпочтительно в ламинарном воздушном потоке (шкаф безопасности), чтобы избежать любого загрязнения.

  ⇒ Точно измерьте количество при приготовлении серийных разведений образца.

  ⇒ Дайте пластинам для материала равномерно затвердеть.Не засевайте образец на чашках с частично затвердевшей средой.

  ⇒ Не прижимайте посевную петлю слишком сильно к поверхности агара.

  ⇒ Крышка чашки Петри не должна подниматься полностью во избежание внешнего загрязнения.

  ⇒ После нанесения штрихов в области квадранта правильно простерилизуйте посевную петлю, чтобы избежать контаминации и получить отдельные и хорошо развитые колонии.

  Привет, я основатель и разработчик Paramedics World, блога, посвященного фельдшерам.Я техник в медицинской лаборатории, веб-разработчик и библиофил. Мое самое большое хобби - обучать и мотивировать других людей делать то, что они хотят делать в жизни.

  .

  ---

  Смотрите также

  • 
    Приложение 1 к заявлению о выделении необходимых средств
  • 
    Зеленоватые выделения с кислым запахом у женщин
  • 
    Какого значение выделения какие органы у животных осуществляют эту функцию
  • 
    Из стомы нет выделений
  • 
    Цвет выделений после родов по неделям
  • 
    Кровянистые выделения в пожилом возрасте
  • 
    Второй месяц после родов кровянистые выделения
  • 
    Выделения беловато желтые
  • 
    При лактации кровянистые выделения
  • 
    Болит живот на 9 неделе беременности выделений нет
  • 
    Обильные выделения прозрачные с запахом