• Способы выделения последа


    Способ выделения отделившегося последа.

    Способ Абуладзе. После опорожнения мочевого пузыря про­изводят бережный массаж матки для ее со­кращения. Затем обеими руками берут брюшную стенку в продоль­ную склад­ку и предлагают роженице потужиться. Отделившийся послед обыч­но рождается легко.

    Способ Гентера. Мочевой пузырь опорожняют, дно матки приво­дят к срединной линии. Становятся сбоку от роженицы, лицом к ее ногам, ки­сти рук, сжатые в кулак, кладут тыльной поверхностью основных фаланг на дно матки (в области трубных углов) и постепенно надавливают в направлении книзу и внутрь; ро­женица не должна тужиться. Метод Гентера применяется сравнительно редко.

    Способ Креде - Лазаревича. Он менее щадящий, чем способы Абу­ладзе и Гентера, поэтому к нему прибе­гают после безу­спешного применения од­ного из этих способов. Тех­ника данного метода заклю­чается в сле­дующем: а) опорожняют мочевой пу­зырь; б) приводят дно матки в срединное положение; в) легким массажем стараются вызвать сокращение матки; г) становятся слева от роже­ницы (лицом к ее ногам), дно матки обхваты­вают пра­вой рукой таким образом, чтобы I палец находился на передней стенке матки, ла­донь — на дне, а 4 пальца — на задней поверхности матки ; д) производят выжимание последа: сжимают матку в переднезаднем размере и одновременно на­давливают на ее дно по направлению вниз и вперед вдоль оси таза. Отделившийся послед при этом способе легко выходит наружу.

    Невыполнение указанных правил может привести к спазму зева и ущемле­нию в нем последа. С целью уст­ранения спастического сокращения зева вво­дят 1 мл 0,1 % р-ра сульфата атропина или но-шпу, апрофен или наркоз. Обычно послед рождается сразу полностью; иногда после рождения плаценты обнару­живается, что оболочки, соединенные с детским местом, задерживаются в матке. В таких случаях родившуюся плаценту берут в ладони обеих рук и медленно вращают в одном направлении. При этом происходит скручива­ние оболочек, способствующее постепенному их отслое­нию от стенок матки и выведению наружу без обрыва.

    Существует способ выделения оболочек по Гентеру; после рождения пла­центы роженице предлагают опе­реться на ступни и поднять таз; при этом плацента свисает вниз и своей тяжестью способствует отслоению оболочек.

    Родившийся послед тщательно осматривают, чтобы убедиться в целости плаценты и оболочек. Плаценту раскладывают на гладком подносе или на ладонях материнской поверхностью вверх и внимательно осматри­вают ее, одну дольку за другой. Необходимо очень тщательно осмотреть края плаценты; края целой плаценты гладкие и не имеют отходящих от них обо­рванных сосудов Осмотрев плаценту, переходят к осмотру оболочек. Плаценту переворачивают материнской стороной вниз, а плодовой — кверху. Края разрыва обо­лочек берут пальцами и расправляют их, стараясь вос­становить яйцевую камеру, в которой на­ходился плод вместе с водами. При этом обращают внимание на целость водной и ворсистой обо­лочек и выяс­няют, нет ли между оболочками оборванных сосудов, отходящих от края плаценты. Наличие таких сосудов указывает на то, что бы­ла добавочная долька плаценты, которая осталась в полости матки. При ос­мотре оболочек выясняют место их разрыва; это позволяет в известной степе­ни судить о месте прикрепления плаценты к стенке матки. Чем ближе к краюплаценты находится место раз­рыва оболочек, тем ниже она была прикреплена к стенке матки.

    Определение целости плацен­ты имеет важнейшее значение. За­держка в матке частей плаценты является грозным осложнением родов. Последствием его бывает кровотечение, которое возникает вскоре после рождения последа или в более поздние сроки после­родового периода. Кровотечение может быть очень сильным, угро­жающим жизни родильницы. За­державшиеся кусочки плаценты способствуют также развитию септических послеродовых заболе­ваний. Поэто­му оставшиеся в матке частицы плаценты удаляют рукой (реже тупой кюреткой) непо­средственно после установления дефекта. Задер­жавшиеся части оболочек не требуют внутриматочного вме­шательства: они некротизируются, распадаются и выходят вместе с выделениями из матки.

    Плаценту после осмотра измеряют и взвешивают. Все данные о плаценте и оболочках заносят в историю ро­дов (после осмотра плаценту сжигают или зарывают в землю в местах, установленных санитарным надзором). Да­лее из­меряют общее количество крови, потерянное в последовом периоде и непос­редственно после родов.

    После рождения последа наружные половые органы, область промежно­сти и внутренние поверхности бедер обмывают теплым слабым дезинфици­рующим раствором, высушивают стерильной салфеткой и осматривают. Вна­чале осматривают наружные половые органы и промежность, затем раздви­гают стерильными тампонами поло­вые губы и осматривают вход во влагалище. Осмотр шейки матки с помощью зеркал производят у всех жен­щин. Особенно внимательно следует осматривать шейку матки у первородя­щих, так как разрывы у них возникают особенно часто, а также у родильниц, перенесших родоразрешающие акушерские операции (акушерские щипцы, эк­стракция плода за тазовый конец и др.).

    Разрывы мягких тканей родовых путей являются входными воротами для инфекции. Кроме того, разрывы про­межности в дальнейшем способствуют опущению и выпаданию половых органов. Разрывы шейки матки могут при­вести к появлению выворота шейки, хронического эндоцервицита, эрозий. Все эти патологические процессы могут создать условия для возникновения рака шейки матки. Поэтому разрывы промежности, стенок влагалища и шейки матки необходимо тщательно ушивать непосредственно после родов. Уши­вание разрывов мягких тканей родовых путей является профилактикой после­родовых инфекционных заболеваний.

    За родильницей наблюдают в родильной комнате не менее 2 ч (ранний послеродовой период). При этом обра­щают внимание на общее состояние женщины, определяют пульс, справляются о самочувствии, периодически пальпируют матку и выясняют, нет ли кровотечения из влагалища. Необходи­мо учитывать, что иногда в первые часы после родов возникает кровотечение, связанное чаще всего с пониженным тонусом матки. Если жалоб нет, состояние родильницы хорошее, пульс нормального на­полнения и не учащен, матка плотная и кровянистые выделения умеренные, родильницу через 2-3 ч перевозят в послеродовое отделение. Вместе с ро­дильницей направляют ее историю родов, где должны быть своевременно сделаны все записи.

     

    МЕХАНИЗМ

    Главным усло­вием, способствующим отслоению плаценты, являются последовые схватки; в изгнании отделившегося по­следа, кроме схваток, участвует брюшной пресс. После рождения ребенка матка сокращается, приобретает округлую фор­му, дно ее располагается на уровне пупка; через несколько минут начинаются ритмические сокращения матки — последовые схватки. При последовых схват­ках сокращается вся мускулатура матки, включая и область прикрепления плаценты, которая называ­ется плацентарной площадкой. Плацента не обладает способностью к сокращению, поэтому происходит ее смещение от суживающегося места прикрепления. С каждой схваткой плацентарная пло­щадка уменьшается, плацента образует складки, выпячивающиеся в полость матки, и, наконец, отслаивается от ее стенки. Плацента от­слаивается в спонгиозном (губчатом) слое; в области плацентарной площадки на стенке матки остаются базаль­ный слой слизистой оболочки и частицы спонгиозного слоя.

    Нарушение связи между плацентой и стенкой матки сопровождается раз­рывом маточно-плацентарных сосудов в области отделившегося участка пла­центы. Кровь, излившаяся из сосудов, накапливается между плацентой и стенкой матки и способствует дальнейшему отделению плаценты от места прикрепления. Отделение плаценты от стенки матки происходит либо с ее центра, либо с ее края.

    Если вначале отслаивается центральная часть плаценты, то ме­жду отделившимися участками и стенкой матки образуется скопление кро­ви — ретроплацентарная гематома. Нарастающая гематома способст­вует дальнейшей отслойке плаценты и выпячиванию ее в полость матки. Оконча­тельно отделившаяся плацента рождается из полости матки и увлекает за со­бой оболочки. Плацента выходит из половых путей плодовой поверх­ностью наружу; оболочки вывернуты наизнанку (водная оболочка располагается сна­ружи, децидуальная — внутри). Вывернутые оболочки располагаются на сто­роне материнской поверхности плаценты.

    Если отделение начинается с периферии плаценты, обычно с нижнего края, то кровь из нарушенных сосудов не образует ретроплацентарной гематомы, а стекает вниз между стенкой матки и оболочками. С каж­дой схваткой отслаиваются все новые, расположенные выше участки плаценты. После полного отделения пла­цента скользит вниз и тянет за собой оболочки, которые тоже отделяются от матки. Плацента выходит из поло­вых путей нижним краем вперед; расположение оболочек сохраняется в том виде, в ко­тором они находились в матке (водная — внутри, децидуальная — снаружи). Такое отделение плаценты встречается реже.

    Выделению последа, отделившегося от стенок матки, кроме схваток, спо­собствуют потуги. Рефлекторное со­кращение брюшных мышц происходит в результате смещения отделившейся плаценты в нижний сегмент матки и во влагалище и раздражения ре­цепторов указанных отделов родовых путей. В процессе выделения последа вспомогательное значение имеют тяжесть самой плаценты и образовавшаяся ретроплацентарная гематома.

    При нормальных родах отделение плаценты от стенки матки наблюдает­ся только в третьем периоде родов. В первом и во втором периодах родов от­слойки плаценты не происходит, несмотря на сильные схватки и присоедине­ние потуг в периоде изгнания. Объясняется это тем, что место прикрепления плаценты в период раскры­тия и из­гнания сокращается меньше, чем другие от­делы матки; отделению плаценты препятствует также внутриматочное давле­ние.

    Последовый период характеризуется выделением крови из маточно-плацентарных сосудов, целость которых нарушается при отслойке плаценты. При нормальном течении последового периода кровопотеря составляет 100 — 300 мл, в среднем 250 мл. Эта кровопотеря физиологическая, она не оказывает от­рицательного влияния на орга­низм женщины. После изгнания последа мат­ка приходит в состояние длительного сокращения, сократившиеся маточные волокна и пучки сдавливают просвет зияющих сосудов, в связи с чем кровоте­чение прекращается.

     

     


    

    методов инкапсуляции плаценты | TCM и сырые продукты

    Основы: плацента обрабатывается паром, а затем обезвоживается (температура варьируется) до полного высыхания, а затем измельчается в порошок

    Выход таблеток: 2,88 капсулы 0 размера на 10 г сырой плаценты, 130 капсул из плаценты 450 г (средний размер)

    С 1500-х годов плацента использовалась в китайской медицине, хотя изначально не использовалась для послеродового лечения. Существует множество вариантов подготовки ТКМ для плаценты, но основная характеристика, которая отличает ее от других методов, заключается в том, что плацента обрабатывается паром перед обезвоживанием.

    В зависимости от протокола плаценту можно готовить на пару с продуктами (лимон, халапеньо, красный перец, перец чили) или травами / специями (имбирь, ладан, мирра, лемонграсс, чеснок, турмерик, корень белого пиона), но они не добавляются в готовые таблетки. Настоящая подготовка к ТКМ требует консультации врача, практикующего ТКМ, который может оценить уникальные потребности матери и назначить ей точную подготовку. Без консультации этот метод подготовки считается западной интерпретацией традиционной китайской медицины.Фактически, комбинация лимона / имбиря / халапеньо была впервые представлена ​​в 1984 году американской акушеркой Рэйвен Лэнг.

    Температура, при которой нарезанная паром плацента обезвоживается, варьируется в широких пределах. Рэйвен Лэнг учил 115F. Некоторые учебные организации преподают 125F, другие - 160F.

    Плюсов:
    • Обработка паром с большей вероятностью убьет любые поверхностные бактерии на плаценте.
    • Некоторые считают, что приготовление пищи делает железо более биодоступным. Однако мы не знаем, относится ли это к человеческому железу, поскольку большинство исследований проводилось на растительных и животных источниках железа.
    • Дополнительное нагревание плаценты согласуется с принципами традиционной китайской медицины, предусматривающими усиление тепла, энергии ян для уравновешивания холода, энергии инь, которая более распространена в послеродовом периоде.
    Минусы:
    • Плацента теряет примерно 35% своей массы во время обработки паром (в основном это кровь). Это дает меньше таблеток.
    • Даже если травы или продукты не обезвожены и не измельчены в последние таблетки, они могли вступить в контакт с плацентой во время процесса.Это может вызвать аллергическую реакцию у женщин, чувствительных к пище.

    Основы: плацента нарезается и обезвоживается при температуре 118 ° F или ниже до полного высыхания, а затем измельчается в порошок

    Выход таблеток: 3,76 капсулы 0 размера на 10 г сырой плаценты, 169 капсул из плаценты 450 г (средний размер)

    Этот препарат основан на методике питания Raw Foods. Сыроедение учит, что еда является наиболее питательной, если ее не нагревают выше 118F. В отсутствие тепла бактерии не могут быть уничтожены во время приготовления, но сыроеды считают, что это полезно, поскольку помогает заселить кишечник полезной флорой.Они также чтят традиции нескольких культур, которые сушат мясо на солнце, чтобы сохранить его, а не готовить.

    Плюсов:
    • Поскольку плацента не распаривается, выход таблеток несколько выше. Вы получите больше таблеток из плаценты того же размера.
    Минусы:
    • Плацента не подвергается тепловой обработке, хотя она полностью высохла. Хотя у нас нет сообщений о болезнях пищевого происхождения из капсул плаценты, приготовленных методом Raw Foods, возможно, риск пищевых заболеваний увеличивается.

    Существует множество других способов инкапсуляции плаценты. Одна из самых популярных альтернатив его приготовлению в соответствии со стандартами Министерства сельского хозяйства США для вяленого мяса, согласно которому плаценту необходимо нагреть до 160F, а затем обезвоживать при 160F в течение всего времени. Следует отметить, что инкапсуляция плаценты - это другой тип подготовки, нежели отрывистый, поскольку плацента полностью высыхает, а отрывистое мясо остается влажным и податливым.

    .

    Развитие плаценты - Имплантация - Перенос

    Плацента - жизненно важный связующий орган между маткой матери и плодом.

    Он поддерживает развивающийся плод внутриутробно, снабжая его питательными веществами, устраняя продукты жизнедеятельности плода и обеспечивая газообмен через материнское кровоснабжение.

    В этой статье мы рассмотрим развитие плаценты.

    [caption align = "aligncenter"] Рис. 1. Плацента поддерживает развивающийся внутриутробный плод.[/ caption]

    Предварительная имплантация

    Развитие плаценты начинается при имплантации бластоцисты .

    Бластоциста из 32-64 клеток содержит два различных типа дифференцированных эмбриональных клеток: клеток внешнего трофобласта и внутреннюю клеточную массу. Клетки трофобласта образуют плаценту. Внутренняя клеточная масса образует плод и плодные оболочки.

    Имплантация

    На 6 -й день , когда блестящая оболочка распадается, бластоциста «вылупляется», позволяя осуществить имплантацию.Клетки трофобласта взаимодействуют с децидуальным эпителием эндометрия, обеспечивая проникновение в материнские клетки матки.

    Затем эмбрион секретирует протеазы, чтобы обеспечить глубокое проникновение в строму матки . Имплантация интерстициальная. Нормальная имплантация происходит на передней или задней стенке тела матки. Наиболее частое место внематочной имплантации находится в ампуле фаллопиевой трубы.

    На 8 день развития клетки трофобласта дифференцируются во внешний многоядерный синцитиотрофобласт , , который разрушает материнские ткани, посылая выступы, и внутренний мононуклеарный цитотрофобласт, который активно пролиферирует.

    Синцитиотрофобласт отвечает за выработку таких гормонов, как Хорионический гонадотропин человека (ХГЧ) ко второй неделе, который используется при тестировании на беременность.

    Постимплантационный

    На 9-й день внутри синцитиотрофобласта образуются лакуны или пространства. Синцитиотрофобласт также разрушает материнские ткани, позволяя материнской крови из спиральных артерий матки проникать в лакунарную сеть. Таким образом, к концу 2 недели устанавливается раннее маточно-плацентарное кровообращение.

    Тем временем цитотрофобласт начинает формировать первичных ворсинок хориона (пальцевидные выступы), которые проникают и расширяются в окружающий синцитиотрофобласт. На 3 -й неделе внеэмбриональная мезодерма прорастает в эти ворсинки, образуя ядро ​​из рыхлой соединительной ткани, после чего эти структуры называются вторичными ворсинками хориона.

    К концу третьей недели эмбриональные сосуды начинают формироваться в эмбриональной мезодерме вторичных ворсинок хориона, превращаясь в третичные ворсинки хориона.

    Клетки цитотрофобласта из третичных ворсинок растут по направлению к decidua basalis материнской матки и распространяются по ней, образуя цитотрофобластическую оболочку. Ворсинки, которые связаны с базальной децидуальной оболочкой через цитотрофобластическую оболочку, известны как , закрепляющие ворсинки .

    Ворсинки, растущие наружу в межворсинчатом пространстве от стволовых (закрепляющих) ворсинок, называются ветвистыми ворсинками и обеспечивают площадь поверхности для обмена метаболитов между матерью и плодом.Представление ворсинок в виде древовидных выступов может помочь визуализировать их структуру.

    Создание обращения

    Материнские спиральные артерии претерпевают ремоделирование для создания условий с низким сопротивлением и высоким кровотоком для удовлетворения потребностей плода. Клетки цитотрофобласта проникают в спиральные артерии матери и замещают эндотелий матери. Они подвергаются дифференцировке от эпителия к эндотелию, что увеличивает диаметр и снижает сопротивление сосудов.

    Преэклампсия - это трофобластическое заболевание, связанное с недостаточной или неполной дифференцировкой цитотрофобластических клеток во время трансформации эпителия в эндотел.

    [caption align = "aligncenter"] Рис. 2. Установившееся плацентарное кровообращение [/ caption]

    Плацентарный барьер

    В первом триместре (0-13 недель) поверхность ворсин хориона образована синцитиотрофобластом. Эти клетки покоятся на слое цитотрофобластических клеток, которые, в свою очередь, покрывают сердцевину сосудистой мезодермы.Следовательно, плацентарный барьер относительно толстый.

    Площадь поверхности для обмена резко увеличивается к доношенному сроку (27-40 недель). Плацентарный барьер намного тоньше, и слой цитотрофобласта под синцитиотрофобластом утрачен.

    Плацентарный барьер не является настоящим барьером, поскольку он позволяет многим веществам проходить между кровообращением матери и плода. К сожалению, это означает, что различные наркотики (например, героин, кокаин) и вирусы (например, ЦМВ, краснуха, корь) могут попадать в кровоток плода.Поскольку материнская кровь в межворсинчатых промежутках отделяется от крови плода производными хориона, человеческая плацента известна как гемохориальный тип .

    К четвертому месяцу плацента состоит из двух компонентов: материнской части , то есть децидуальной основы, и плодной части, то есть лобного хориона. По мере продвижения беременности формируется лобный хорион («густой» хорион) по мере того, как на эмбриональном полюсе развивается больше ворсинок. На поверхности плода плацента покрыта хорионической пластиной ; со стороны матери она граничит с decidua basalis, децидуальная пластинка которой наиболее тесно связана с плацентой.

    В течение четвертого и пятого месяцев децидуальная оболочка формирует децидуальных перегородок , которые выступают в межворсинчатое пространство, но не присоединяются к хорионической пластине. Эти перегородки имеют сердцевину из материнской ткани, но покрыты слоем синцитиальных клеток. Всегда существует синцитиальный слой, который отделяет материнскую кровь в межворсинчатых озерах от ткани ворсинок плода. Перегородки разделяют плаценту на части, называемые семядолями. Кровоснабжение семядолей осуществляется через 80–100 спиральных артерий, пронизывающих децидуальную пластинку.

    [caption align = "aligncenter"] Рис. 3. Плацента человека, сторона матери (внизу) и сторона плода (вверху) [/ caption]

    Доношенная плацента

    При доношенных сроках плацента имеет дискообразную форму , диаметр 15-25 см, толщину примерно 3 см и вес примерно 500-600 г. При рождении он отрывается от стенки матки и примерно через 30 минут после рождения ребенка выходит из полости матки.

    На материнской стороне будет 15-20 выпуклых участков, которые представляют собой семядоли, покрытые тонким слоем decidua basalis. Межворсинчатые озера взрослой плаценты содержат примерно 150 мл материнской крови, которая обновляется 3-4 раза в минуту.

    Поверхность плода покрыта хорионической пластинкой. Сосуды хориона сходятся к пуповине . Это ряд крупных артерий и вен. Хорион покрыт слоем амниона. Пуповина обычно прикрепляется к середине плаценты перпендикулярно ей. Пуповина может произойти, если пуповина выходит за пределы плаценты, но это бывает редко.

    Конец беременности

    Целью изменений, происходящих с плацентой в конце беременности, является уменьшение обмена между кровообращением матери и плода. Эти изменения заключаются в следующем:

    • Увеличение фиброзной ткани в ядре ворсинки
    • Утолщение базальных мембран капилляров плода
    • Облитерирующие изменения мелких капилляров ворсинок
    • Отложение фибриноида на поверхности ворсинок в зоне соединения и в хорионической пластинке.

    Отложение фибриноидов приводит к инфаркту межворсинчатого озера или иногда всей семядоли, которая впоследствии становится беловатой.

    [старт-клинический]

    Клиническая значимость - отслойка плаценты

    Отслойка плаценты - это когда часть или вся плацента преждевременно отделяется от стенки матки и является важной причиной дородового кровотечения. Считается, что это происходит после разрыва материнских сосудов в базальном слое эндометрия, когда кровь накапливается и вызывает отделение плаценты от базального слоя - любая отделенная часть не может функционировать, что может привести к быстрому повреждению плода.

    Важные факторы риска для этого включают предшествующей отслойки плаценты, преэклампсии, аномальное ложное положение плода, многоводие, курение, многоплодную беременность, лежащую в основе тромбофилию и травму живота. Наиболее вероятным прогностическим фактором является отслойка плаценты при предыдущей беременности.

    Женщины обычно имеют болезненных вагинальных кровотечения во время беременности. При осмотре матка может быть деревянистой (напряженной) и болезненной при пальпации.

    Ведение отслойки плаценты должно состоять из:

    • Реанимация матери с использованием подхода ABCDE
    • CTG для оценки / мониторинга состояния плода, если срок беременности превышает 26 недель
    • Дайте anti-D в течение 72 часов после начала кровотечения, если у женщины резус-D отрицательный
    • Экстренные роды / Индукция родов / Консервативное ведение и наблюдение за плодом в зависимости от степени дистресса плода и состояния здоровья матери

    Дополнительную информацию об отслойке плаценты можно найти здесь.

    [окончание клинической]

    .

    ассоциированных клинических проявлений и осложнений - ретроспективное исследование

    Цели. Ретроспективно проанализировать исходы беременности при обходной плаценте и спрогнозировать обходной плаценты во время беременности на основе ее клинических особенностей. Методы. Исходы беременности 92 женщин с окаймляющей плацентой, которые родили живые одиночки в центре третичной медицинской помощи в период с января 2000 года по сентябрь 2012 года, сравнивались с таковыми у 9057 контрольных женщин. Результаты. У женщин с окружной плацентой чаще наблюдались преждевременные роды (64,1%), отслойка плаценты (10,9%), экстренное кесарево сечение (45,6%), недоношенность для гестационного возраста (36,9%), неонатальная смерть (8,9%) поступление в реанимацию новорожденных (55,4%) и хронические заболевания легких (33,9%). Когда вагинальное кровотечение во втором триместре и преждевременный химический разрыв плодных оболочек (PCROM) использовались в качестве прогностических факторов для огибающей плаценты, чувствительность составила 28.8% и специфичность 99,9%. Заключение. При огибающей плаценте исходы беременности были плохими и имели характерные клинические проявления. У женщин с вагинальным кровотечением и PCROM во время беременности следует сильно подозревать окаймление плаценты.

    1. Введение

    Окружная плацента - это форма экстрахориальной плаценты с приподнятым краем плаценты кольцевой формы. Хорионическая пластинка меньше базальной пластинки, и несоосность между ними вызывает удержание гематомы на краю плаценты.Таким образом, огибающая плацента часто вызывает стойкое вагинальное кровотечение, начинающееся в 1-м триместре, преждевременный разрыв плодных оболочек (PROM), преждевременные роды и отслойку плаценты и, таким образом, связана с неблагоприятными исходами беременности [1].

    Однако сообщалось о нескольких случаях окклюзии плаценты. Диагностика во время беременности затруднительна, и плацента, окаймляющая ее, часто определяется только при исследовании плаценты после родов [2–5].

    Здесь мы ретроспективно рассмотрели исходы беременности у женщин с окаймляющей плацентой.Мы также оценили полезность использования клинических признаков, в том числе преждевременного химического разрыва плодных оболочек (PCROM) и вагинального кровотечения, для пренатального прогнозирования возникновения циркумвалляции плаценты.

    2. Материалы и методы

    Мы ретроспективно проанализировали медицинские карты женщин, которые родили живые одиночки после 22 недель гестации, и у которых в Перинатальном центре для беременных и новорожденных Медицинского центра Йокогамского городского университета был поставлен диагноз «полностью огибающая плацента» при макроскопическом исследовании плаценты после родов. с января 2000 г. по сентябрь 2012 г.Исключались женщины с аномалиями развития плода, аномалиями матки, полипами шейки матки, которые могут вызывать вагинальное кровотечение, предлежанием плаценты и наследственным кровоточащим диатезом, включая тромбоцитопению, тромбоцитопатию и воздействие антикоагулянтов или антитромбоцитарных препаратов. Полная окружная плацента определялась как плацента, удовлетворяющая следующим критериям: хорионическая пластинка, которая находится на фетальной стороне плаценты, меньше, чем плацентарная базальная пластинка, которая расположена на материнской стороне; периферия раскрыта; а поверхность плода такой плаценты представляет собой центральное углубление, окруженное по окружности толстым серо-белым кольцом [6].В группу обследованной плаценты вошли женщины, у которых огибающая плацента была диагностирована с помощью макроскопического исследования плаценты, проведенного после родов обученными акушерами, а затем подтверждена патологическим обследованием. В контрольную группу вошли женщины, родившие синглтон после 22 недель гестации в течение того же периода, за исключением тех, у кого была окаймленная плацента.

    Девяносто две женщины соответствовали вышеуказанным критериям. Девять тысяч пятьдесят семь женщин, имевших морфологически нормальную плаценту и родивших живые одиночки через 22 недели гестации в течение того же периода, служили контролем.

    Исходные факторы субъектов и исходы беременности сравнивались между двумя группами. Фоновыми факторами были возраст, число детей и частота лечения бесплодия. Исходами беременности были неделя беременности при родах, вагинальное кровотечение в 1-м и 2-м триместрах, субхорионическая гематома, маловодие, недоношенный PROM (pPROM), PCROM, отслойка плаценты и частота кесарева сечения. Неонатальные исходы, включая массу тела при рождении, малость для гестационного возраста (SGA), неонатальную смерть, поступление в отделение интенсивной терапии новорожденных (NICU) и хроническое заболевание легких (CLD), также сравнивались между 90 новорожденными в группе наблюдения за плацентарной окантовкой. не менее 4 недель и контрольной группы.

    Группа плацентарной окклюзии была разделена на две подгруппы: преждевременные () и доношенные () роды. Мы сравнили вагинальное кровотечение в 1 и 2 триместрах и PCROM между двумя подгруппами. Кроме того, мы сравнили вагинальное кровотечение во 2 триместре + PCROM и вагинальное кровотечение во время 1 триместра + вагинальное кровотечение во 2 триместре + PCROM между двумя подгруппами. Аналогичные сравнения были выполнены между плацентой с округлой формой плаценты и контрольной группой.Вагинальное кровотечение определялось как макроскопическое кровотечение, обнаруживаемое с помощью зеркала. pPROM определяли как сильное истечение околоплодных вод до 37 недель гестации с положительным pH околоплодных вод или результатами белка-1, связывающего инсулиноподобный фактор роста (IGFBP-1). PCROM был определен как утечка околоплодных вод, не поддающаяся грубой идентификации и трудно отличимая от вагинального кровотечения, и диагностирована как разрыв плодных оболочек на основании положительных результатов IGFBP-1 [7]. Субхорионическая гематома определялась как низкоэхогенная область вокруг гестационного мешка на УЗИ в течение 1 триместра.Олигогидрамнион определялся как индекс амниотической жидкости <5 см или амниотический карман <2 см. Отслойка плаценты была диагностирована на основании клинических данных, включая вагинальное кровотечение, ригидность живота, частые сокращения матки и позднее замедление сердечного ритма плода, что потребовало неотложных родов [8]. Диагноз подтвержден наличием свежей ретроплацентарной гематомы при послеродовом исследовании плаценты. SGA был определен как масса тела при рождении ниже 10-го процентиля эталонной кривой массы при рождении и гестационного возраста [9].ХЗЛ определяли как симптомы респираторного дистресса с потребностью в кислороде, начинающейся в неонатальном периоде и сохраняющейся после возраста 28 дней из-за легочных аномалий, отличных от врожденных пороков развития.

    Данные представлены как медианы или частоты (%). Для статистического анализа использовались Microsoft Excel и SPSS. Для сравнения категориальных данных между группами применялись точные тесты Фишера. Для непрерывных переменных использовался тест Манна-Уитни. Статистически значимыми считались различия со значением.Более того, линейная регрессия и логистическая регрессия использовались для корректировки неонатального исхода с учетом смешанной переменной (гестационная неделя при родах). И результаты были выражены как отношение шансов (OR) и 95% доверительный интервал (CI).

    3. Результаты

    Нет значительных различий в возрасте матери, частоте первородящих или частоте лечения бесплодия между плацентарным окном и контрольной группой (Таблица 1).


    Окружающая плацента () Контроль () значение

    Возраст матери (лет) 31.9 (19–45) 31,6 (16–50) 0,76
    Возраст матери ≥35 25 (27,2%) 2691 (29,7%) 0,60
    Primipara 46 (50%) 4579 (50,5%) 0,92
    Самопроизвольная беременность 84 (91,3%) 8383 (92,5%) 0,65
    Беременность путем искусственного оплодотворения 2 (2,2 %) 126 (1,4%) 0.53
    Беременность с помощью препарата от бесплодия 2 (2,2%) 194 (2,1%) 0,98
    Беременность путем экстракорпорального оплодотворения 4 (4,3%) 355 (3,9%) 0,96

    В таблице 2 показаны исходы беременностей обеих групп. Гестационная неделя к моменту родов составила 32,8 недели в группе плацентарной окклюзии. Преждевременные роды были значительно выше в плаценте, окруженной плацентой, чем в контрольной группе.В частности, преждевременные роды до 28 недель гестации были значительно выше в окружной плаценте, чем в контрольной группе. Частота вагинальных кровотечений в течение 1 и 2 триместров, субхорионической гематомы, маловодия, pPROM и отслойки плаценты также была значительно выше в околоплазматической плаценте, чем в контрольной группе. Экстренное кесарево сечение было значительно выше в окружной плаценте, чем в контрольной группе.


    Окружающая плацента () Контроль () значение

    Неделя беременности при родах (неделя) 32.8 (22,1–41,7) 38,2 (22,1–42,6) <0,01
    Чрезвычайно преждевременные роды * 29 (31,5%) 214 (2,4%) <0,01
    Преждевременные роды 59 (64,1%) 1069 (11,8%) <0,01
    VB в течение 1 триместра 30 (32,6%) 85 (0,9%) <0,01
    VB во 2 триместре 36 (39.1%) 53 (0,6%) <0,01
    Субхорионическая гематома 14 (15,2%) 93 (1,0%) <0,01
    pPROM 36 (39,1%) 362 (4,0%) <0,01
    PCROM 19 (20,6%) 3 (0,03%) <0,01
    Олигогидрамнионы 22 (23,9%) 177 ( 2,0%) <0,01
    Отслойка плаценты 10 (10.9%) 120 (1,3%) <0,01
    Способ родов
    Нормальные вагинальные роды 42 (45,6%) 6397 (70,6%) <0,01
    Инструментальные роды 3 (3,2%) 419 (4,6%) 0,53
    Кесарево сечение плановое 4 (4,3%) 1062 (11,7%) 0 .03
    Экстренное кесарево сечение 42 (45,6%) 1180 (13,0%) <0,01

    Чрезвычайно преждевременные роды: роды в гестационном возрасте от 22 недель 0 дней и 27 недель 6 дней.
    VB: вагинальное кровотечение; pPROM: преждевременный преждевременный разрыв плодных оболочек; PCROM: преждевременный химический разрыв мембран; PIH: гипертензия, вызванная беременностью.

    В таблице 3 показаны исходы новорожденных без корректировок и с поправкой на смешивающие переменные (гестационная неделя при родах).Хотя нескорректированный анализ выявил повышенный риск для UA pH <7,10 и поступления в отделение интенсивной терапии как в плацентарной группе, так и в контрольной группе, не было никаких различий в этих переменных между двумя группами, когда анализ был скорректирован на гестационную неделю при родах.

    Без корректировок

    Контроль Окружающая плацента OR (95% ДИ) значение

    SGA
    Unad 1 4.64 (3,02–7,12) <0,01
    Скорректировано * 1 2,50 (1,58–3,95) <0,01
    UA pH <7,10
    Не скорректировано 1 4,65 (2,22–9,73) <0,01
    Скорректировано * 1 0 0,81
    Прием в ОИТН
    1 8.68 (5,69–13,2) <0,01
    Скорректировано * 1 0,50 (0,19–1,30) 0,16
    Хроническое заболевание легких
    Не скорректировано 1 27,2 (15,9–46,6) <0,01
    Скорректировано * 1 2,92 (1,30–6,56) <0,01
    Неонатальная смерть
    Без корректировок 1 32.6 (14,4–74,0) <0,01
    Скорректировано * 1 2,70 (1,03–7,10) <0,05

    SGA: малый - для -срок беременности; UA pH: pH пупочной артерии; ОИТН: отделение интенсивной терапии новорожденных; SE: стандартная ошибка; ИЛИ: отношение шансов.
    * Скорректировано по неделям беременности при родах.

    Было проведено сравнение клинических симптомов в подгруппах преждевременных () и доношенных () родов в группе циркумвалляционной плаценты (таблица 4).Вагинальные кровотечения в 1-м и 2-м триместрах были значительно выше у недоношенных, чем в подгруппе доношенных (1-й триместр 42,3% против 15,2%; 2-й триместр 52,5% против 15,2%). Влагалищное кровотечение во время 1-го и 2-го триместров с помощью PCROM составило 20,3% в подгруппе преждевременных родов, в то время как ни в одном случае в подгруппе доношенных родов не было этого осложнения.


    Преждевременные роды () Срок родов () значение

    VB в течение 1 триместра 25 (42.3%) 5 (15,2%) 0,010
    VB во 2 триместре 31 (52,5%) 5 (15,2%) <0,01
    Субхорионическая гематома 11 ( 18,6%) 3 (9,1%) 0,36
    PROM 36 (61,0%) 5 (15,2%) <0,01
    pPROM 36 (61,0%) 0 (0%) <0,01
    PCROM 19 (32.2%) 0 (0%) <0,01
    VB во 2 триместре + PCROM 17 (28,8%) 0 (0%) <0,01
    VB во время 1-й и 2-й триместры + PCROM 12 (20,3%) 0 (0%) <0,01

    VB: вагинальное кровотечение; ПРОМ: преждевременный разрыв плодных оболочек; pPROM: преждевременный преждевременный разрыв плодных оболочек; PCROM: преждевременный химический разрыв оболочек.

    Как показано в Таблице 5, частота вагинальных кровотечений во 2-м триместре с PCROM и вагинальных кровотечений в 1-м и 2-м триместрах с PCROM была значительно выше в окружной плаценте, чем в контрольной группе (18,5% по сравнению с контрольной группой). 0,1%, и 13,0% против 0,09%, соответственно). Когда вагинальное кровотечение во 2 триместре и PCROM использовались в качестве прогноза циркумвалляционной плаценты, чувствительность составила 28,8%, а специфичность - 99,9%.


    Окружающая плацента () Контроль () значение

    VB во 2 триместре + PCROM 17 (18.5%) 9 (0,1%) <0,01
    VB в 1 и 2 триместрах + PCROM 12 (13,0%) 8 (0,09%) <0,01

    VB: вагинальное кровотечение; PCROM: преждевременный химический разрыв оболочек.
    4. Обсуждение

    Вагинальные кровотечения в 1-м и 2-м триместрах, субхорионическая гематома, pPROM, олигогидрамнион, преждевременные роды, отслойка плаценты и экстренное кесарево сечение были значительно выше в кольцевой плаценте, чем в контрольной группе.Даже с поправкой на гестационную неделю при родах, частота SGA, неонатальной смертности и CLD также была значительно выше в окружной плаценте, чем в контрольной группе, что указывает на плохие неонатальные исходы. У женщин с окаймляющей плацентой, родивших раньше срока, клинические симптомы, включая вагинальное кровотечение в течение 1 и 2 триместров и PCROM, были более распространены, чем у женщин, родивших доношенных детей. Примечательно, что женщины с вагинальным кровотечением во 2 триместре и PCROM составили 28.8% группы плаценты с окантованной плацентой рожали раньше срока , по сравнению с 0,1% контрольной группы. Таким образом, эти две особенности могут указывать на то, что плацента огибает во время беременности.

    Группа плаценты с окклюзионной поверхностью показывает плохие исходы беременности и родов. Окружающая плацента может привести к вагинальному кровотечению во 2-м триместре, ППНП и преждевременным родам. Сообщается, что гематома формируется в огибающем крае плаценты, вызывая восходящую инфекцию, прогрессирующую до хориоамнионита [10].Судзуки [1] исследовал акушерские исходы в 139 случаях окклюзии плаценты и сообщил о значительном увеличении случаев преждевременных родов (22%), маловодия (3,6%), отслойки плаценты (5,0%) и экстренного кесарева сечения (16%) у этих женщин. чем в контроле, наблюдения согласуются с нашими результатами.

    Заболеваемость SGA и CLD была выше в группе плаценты с циркумвалляцией, чем в контрольной. Что касается связи между окаймляющей плацентой и SGA, считается, что ограничение роста плода вызвано плацентарной недостаточностью из-за маргинального инфаркта, кровоизлияния и отложения гемосидерина, а также гипоплазии плаценты [2, 11].Также было высказано предположение, что длительное вагинальное кровотечение во время беременности вызывает отложение гемосидерина в плаценте и хорионе, что приводит к диффузному хориоамниотическому гемосидерозу, и что плод может проглотить околоплодные воды с кровью и тем самым развить ХЗП [12, 13].

    У женщин с окаймляющей плацентой часто наблюдались клинические симптомы вагинального кровотечения во время беременности и ППОП. В частности, среди тех, кто родил раньше срока, у 28,8% было вагинальное кровотечение во 2-м триместре и данные PCROM.Таким образом, эти две функции должны были быть полезными для антенатального прогнозирования околоземной плаценты. Бей и др. [14] утверждают, что при вагинальном кровотечении во 2-м триместре, несмотря на нормально имплантированную плаценту, в дифференциальный диагноз следует включить плаценту, окружающую ее. В нескольких исследованиях сообщалось, что окружающая плацента может быть диагностирована на основании ультразвуковых отклонений внешнего вида плаценты [2–5, 15]. Маккарти и др. [5] сообщили о диагностических критериях, основанных на неровном приподнятом крае плаценты (закругленный край плаценты) или краевой полке или крае (тонкий или пластинчатый край плаценты).Судзуки [2] описал измерение толщины плаценты (самая толстая часть ≥3,0 см) как полезное для скрининга окружной плаценты. Arlicot et al. [15] недавно сообщили, что периферическая плацента была диагностирована с помощью трехмерного сонографического изображения, показывающего периферическое углубление с толстым периферическим кольцом в плаценте. Harris et al. [3] обнаружили, что точность сонографии для диагностики полной окантованной плаценты составляет 2% на основании их критериев, сделав вывод о том, что это состояние сложно диагностировать с помощью сонографии.В настоящем исследовании периметральная плацента подозревалась антенатально только у 4 (4,3%) из 92 женщин. У всех четырех женщин подозрение на огибание плаценты было основано на сочетании характерных клинических симптомов (например, маловодие, вагинальное кровотечение во 2-м триместре и задержка роста плода) и результатов ультразвукового исследования (например, утолщение плаценты и гематома в плаценте) прибыль). Обращение плаценты не было подтверждено только результатами ультразвукового исследования. У женщин с огибающей плацентой наблюдались характерные клинические симптомы.Когда вагинальное кровотечение во 2 триместре и PCROM использовались в качестве прогноза циркумвалляционной плаценты, чувствительность составила 28,8%, а специфичность - 99,9%. У женщин с этими двумя особенностями следует сильно подозревать огибающую плаценту.

    У нашего исследования есть несколько ограничений. Во-первых, дизайн был ретроспективен с участием ограниченного числа женщин. Во-вторых, частота PCROM могла быть недооценена, потому что тест IGFBP-1 не проводился у всех женщин в группах с окклюзией плаценты и контрольной группе.В-третьих, выборка случай-контроль может исказить чувствительность, специфичность и расчеты, давая очевидную распространенность заболевания, которая сильно переоценивает фактическую распространенность болезни [16].

    Таким образом, огибающая плацента была связана с более высокой частотой не только материнских событий, таких как преждевременные роды и отслойка плаценты, но также и событий плода, таких как SGA, CLD и неонатальная смерть, что указывает на плохие исходы беременности и родов. Мы продемонстрировали, что прогнозирование окружной плаценты, хотя и сложно, возможно, основываясь на клинических симптомах.У женщин с вагинальным кровотечением во 2-м триместре и ПЦРОМ следует заподозрить циркулярную плаценту и тщательно контролировать их клиническое течение.

    Этический допуск

    Работа, описанная в этом документе, была выполнена в соответствии с Хельсинкской декларацией.

    Конфликт интересов

    Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов в отношении публикации этой статьи.

    .

    Выделение и увеличение мезенхимальных стволовых / стромальных клеток, полученных из ткани плаценты человека

    Процедура выделения плацентарных МСК обобщена в Рисунок 1. Три области анатомии плаценты, из которых были выделены МСК, выделены на Рисунок 2. Это децидуальная оболочка матери, а также в основном фетальные ткани хориональной пластинки и ворсинок хориона. Многие учебники, статьи и онлайн-ресурсы подробно описывают развитие и функциональную роль различных тканей плаценты (см. Ссылку 8 ).

    Морфология культур через 48 часов после выделения и удаления остатков ткани.
    После 48 часов культивирования МСК прикрепятся к пластику для тканевой культуры, в то время как эритроциты и большинство других клеточных остатков не прикрепятся. В это время среду необходимо заменить 35 мл свежей питательной среды. До этого обмена средой трудно проводить точные наблюдения из-за большого количества эритроцитов, которые затрудняют визуальную оценку. Внешний вид культурального супернатанта может существенно различаться у разных доноров плаценты.Это изменение можно увидеть визуально в примерах 1 и 2 (, рис. 3A, ). Эти два выделения МСК, которые оказались очень разными, были выполнены одновременно из двух разных плацент. Однако после промывания обе культуры выглядели одинаково (см. Промытый пример 3, , фиг. 3A ).

    Под микроскопом, после 48-часового обмена средой, только несколько клеток будут прикреплены к колбе ( Рисунок 3B ), и клетки будут выглядеть значительно отличными от более широко разросшихся МСК.Некоторые обломки и эритроциты будут видны как плавающие или прикрепленные комки, и они не будут мешать росту МСК. Более длинные фибробластические клетки, прикрепленные к дну колбы, вероятно, будут представлять собой смесь клеток, включая МСК, гематопоэтические, трофобластические или эндотелиальные клетки. Опять же, клетки, не являющиеся MSC, не подвергают опасности культуры MSC, поскольку эти клетки обычно не выживают более чем 1-2 пассажей в условиях культивирования MSC. Несмотря на некоторые различия в первоначальном внешнем виде культур, результаты последующего расширения в целом согласуются.

    Морфология культур МСК во времени.
    В этом репрезентативном примере через семь дней после выделения были видны небольшие фибробластные колонии MSC, хотя клетки, не относящиеся к MSC, также можно было увидеть как круглые или слабо прикрепленные клетки ( Рисунок 4A ) . Присоединенные клетки - это то, что первоначально было названо «колониеобразующей единицей-фибробластом» (CFU-F) 17 , а позже названо MSC 18 . Через тринадцать дней после выделения фибробластные колонии МСК были большими (, фиг. 4В, ).Как правило, монослой в этот момент будет сливаться на 80-90%, и клетки следует пассировать. Начиная со 2 пассажа, плацентарный монослой МСК будет развивать характерную водоворотную морфологию при слиянии (, рис. 4С, ). Если клетки не будут пассированы при низкой плотности, образование КОЕ-F больше не будет наблюдаться. При низкой плотности полученные из плаценты МСК имеют меньший квадратный вид, чем МСК 1 , полученные из костного мозга взрослых. В то время как происходящие из плаценты МСК и МСК костного мозга демонстрируют сходные скорости пролиферации, клетки, полученные из плаценты, менее склонны к быстрому старению 5 .

    Характеристика плацентарного MSC in vitro.
    Каждая увеличенная популяция клеток должна быть охарактеризована, чтобы гарантировать, что она соответствует стандартным критериям MSC 16 , включая (1) пластическую адгезию (2) наличие маркеров мезенхимальной поверхности и отсутствие маркеров кроветворной поверхности, и (3) способность подвергаться мезодермальной дифференцировке.

    Плацентарные МСК пластические адгезивные.
    Как показано на рис. 4 , МСК в культуре прилипают к пластику и имеют фибробластоподобную морфологию; это подтверждает, что ячейки соответствуют первым критериям, которые определяют MSC 16 .

    Плацентарный МСК отображает маркеры мезенхимальной поверхности.
    Второй определяющей характеристикой МСК является наличие маркеров мезенхимальной поверхности и отсутствие маркеров кроветворной поверхности 16 . Поскольку не существует единственного маркера, способного окончательно идентифицировать МСК, панели маркеров обычно используются в сочетании с анализом проточной цитометрии для идентификации клеток, которые являются мезенхимальными, но не гематопоэтическими. В представительном наборе данных, представленном здесь ( Рисунок 5A ), мы оценили клеточную экспрессию мезенхимальных маркеров CD73, CD105, CD90, CD146 и CD44, гематопоэтических маркеров CD45 и CD34, а также HLA-DR, а также эндотелиального маркера. CD31.Все антитела, используемые в этом процессе определения MSC плаценты, перечислены в Таблице материалов / оборудования . Окрашивание проводилось в соответствии с инструкциями производителя с описанными здесь методами анализа 19 .

    Клетки были положительными по мезенхимальным маркерам CD73, CD105, CD44 и отрицательными по маркерам клеточной поверхности CD45, CD34, HLA-DR и CD31, как ожидалось 5,20 . Приблизительно 37% и 57% клеток в нашем репрезентативном наборе данных были положительными по CD90 и CD146 21 соответственно.Как CD90, так и CD146 являются обычно используемыми маркерами MSC 21 . Профили маркеров на поверхности клеток МСК могут отличаться в зависимости от источника ткани МСК, состава среды или номера пассажа 22 . За время нашего многолетнего опыта мы не наблюдали долговременного заражения МСК из плаценты немезенхимальными клетками после 1-2 пассажей 5,11 .

    Плацентарные МСК демонстрируют потенциал мезенхимальной дифференцировки
    По определению МСК должны обладать in vitro способностью к мезодермальной дифференцировке 5,13 .Потенциал мезодермальной дифференцировки обычно оценивают с помощью тестов дифференцировки по трем или двум линиям. Анализы двух линий обычно оценивают способность к остеогенной и адипогенной дифференцировке, тогда как анализы трех линий дополнительно оценивают способность к хондрогенной дифференцировке. В представленных результатах, представленных здесь, мы показываем, что расширенные популяции МСК образуют как отложения кальция, свидетельствующие об остеогенной дифференцировке, так и липидные вакуоли, свидетельствующие о адипогенезе ( Рисунок 5B ).

    Чтобы охарактеризовать описанные здесь популяции МСК, мы высевали клетки в 24 лунки для культивирования в количестве 6 x 10 4 клеток в 1 мл индукционной среды. Компоненты среды перечислены в Таблице материалов / оборудования. Хотя составы индукционной среды распространены в литературе, опубликованные составы значительно различаются. По этой причине мы кратко перечисляем наши рецептуры индукционной среды и подходы к окрашиванию здесь. Среда для остеогенной индукции содержала DMEM-HG, 10% FBS, 1x раствор антибиотика антимикотика, 10 мМ β-глицеринфосфат, 100 нМ дексаметазон и 50 мкМ L-аскорбиновая кислота 2-фосфат.Среда для адипогенной индукции содержала DMEM-HG, 10% FBS, 1x раствор антимикотика антибиотика, 10 мкг / мл инсулина, 100 нМ дексаметазон, 200 мкМ индометацин и 500 мкМ 3-изобутил-1-метилксантин. Здесь культуры поддерживались в инкубаторе при 37 ° C, 5% CO 2 и культивировались в течение 14 дней. Среду для индукции меняли дважды в неделю в течение периода культивирования. После 14 дней индукции культуры были охарактеризованы либо на костный матрикс (остеогенез), либо на липидные вакуоли (адипогенез) в соответствии с нашей предыдущей публикацией 5 .Анализ отложений остеогенного кальциевого матрикса проводился путем аспирации среды, фиксации культур 4% параформальдегидом в течение 20 минут, промывания монослоя DPBS и затем окрашивания ализарином Red S в соответствии с инструкциями производителя. Индукцию адипогенности оценивали путем аспирации среды, фиксации культур 4% параформальдегидом в течение 20 минут, промывки монослоя и окрашивания раствором Oil Red O в соответствии с инструкциями производителя. Затем окрашенные отложения кальция и масляные вакуоли визуализировали с помощью светового микроскопа, а изображения сохраняли для использования в будущем.

    В предыдущих публикациях мы более подробно охарактеризовали потенциал дифференцировки плацентарных МСК 4,5 . Остеогенез MSC из плаценты аналогичен остеогенезу MSC из костного мозга, тогда как адипогенез, как правило, менее эффективен в MSC 5 из плаценты. Мы обычно не проводим хондрогенную дифференцировку по нескольким причинам, хотя ранее мы сообщали об этом для плацентарного MSC 5 . Во-первых, в то время как способность к мезодермальной дифференцировке является определяющей характеристикой MSC, она, вероятно, имеет второстепенное значение 23-25 ​​, особенно когда терапевтический эффект, вероятно, будет происходить от паракринных секреций MSC 26 .Во-вторых, хотя Dominici et al. предложил минимальные критерии для клинического производства MSC, полученных из костного мозга взрослого человека 16 , более поздние исследования показывают, что MSC из разных ниш имеют разные присущие свойства и возможности дифференциации 5,13,27-32 . Фактически, Parolini et al. предположил, что полученные из плаценты MSC должны дифференцироваться в «одну или несколько мезодермальных» ветвей, а не во все три линии 10 . Наконец, многие исследования МСК исключают хондрогенную дифференцировку, поскольку она происходит через аналогичный внутриклеточный сигнальный путь, как остеогенез (путь семейства TGFβ) 33-35 .

    Плацентарные МСК при использовании этого метода культивирования имеют материнское происхождение, несмотря на анатомическое расположение исходного материала.
    Во многих публикациях предполагается, что клетки, выделенные из хориона плода, дают фетальные МСК при культивировании 14 . Однако, как мы сообщали ранее 5 , все культуры, полученные из хориона плода, с использованием этого протокола, быстро обогащаются материнскими MSC, что интуитивно можно было бы ожидать для материнских децидуальных культур MSC. В этих репрезентативных результатах мы использовали плацентарную ткань младенцев мужского пола, чтобы можно было легко определить вклад эмбриональных и материнских клеток в увеличенные клеточные популяции.Для этих исследований мы использовали набор XY FISH, указанный в Таблице материалов / оборудования , и следовали инструкциям производителя.

    В представленных данных, представленных здесь, культуры, полученные из материнской децидуальной оболочки, составляли ~ 90% материнских клеток (XX) и ~ 10% плодных клеток (XY) при пассаже 0 ( Рисунок 6 ). При пассаже 2 популяции клеток, происходящие из материнских тканей, составляли ~ 100% материнских клеток (XX), а фетальные клетки (XY) не определялись. Это предполагает, что физическое рассечение материнской ткани привело к обогащению материнских клеток в последующих культурах.Тем не менее, очень важно учитывать результаты культивирования ворсинок хориона плода и культур, полученных из хорионической пластины. При пассаже 0 культуры, полученные как из ворсинок хориона плода, так и из хориональной пластинки, имели ~ 85% XY или фетального происхождения, что указывает на то, что целевое рассечение обогащено фетальными клетками (, фиг. 6, ). При пассаже 0 обе культуры содержали ~ 15% загрязнения материнскими клетками (XX). Удивительно, но при пассаже 2 обе культуры плода были заселены ~ 100% материнскими клетками (XX), и клетки плода (XY) больше не определялись.Анализ XY FISH показывает, что материнские клетки (ХХ-хромосомы) быстро и последовательно захватывают культуры, полученные из тканей хориона плода. Это важное культурное наблюдение, которое часто упускается из виду 5 . Детали этого анализа включены в этот протокол, потому что он демонстрирует очень важное наблюдение, что материнские клетки быстро заселяют все культуры, когда DMEM с добавлением 10% FBS используется без дополнительных факторов, предназначенных для поддержки популяций, полученных из плода.


    Рисунок 1: Краткое изложение процедуры выделения плацентарных МСК. ( Step 1 ) Ориентируйтесь по анатомии плаценты. ( Шаг 2 ) Вручную рассеките 10 г ткани децидуальной оболочки, ворсинок хориона или пластинки хориона с помощью ножниц. ( Шаг 3 ) Ножницами или скальпелем измельчите рассеченные части децидуальной оболочки, ворсинок хориона или тканей хориональной пластинки на мелкие кусочки.
    (, шаг 4, ) Освободите клетки от мелких кусочков путем расщепления в течение 1-2 часов диспазой и коллагеназой I.
    ( Step 5 ) Отделите клетки от фиброзной ткани путем импульсного центрифугирования и / или промывки их через фильтр для клеток. Собирают и ресуспендируют клетки в культуральной среде и помещают в культуральные колбы. Щелкните здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

    Мезенхимальные стромальные клетки (МСК) будут отобраны на основании их склонности к прилипанию к пластику и способности выживать и размножаться в культуральной среде. Наконец, в разделе результатов расширенный MSC может быть охарактеризован и сохранен для использования в будущих экспериментах.


    Рис. 2: Анатомия плаценты и тканей, выделенных в ходе этой процедуры. Первой собираемой тканью является децидуальная оболочка матери. Децидуальная оболочка - это ткань, которая остается тонким слоем на поверхности плаценты после отделения от стенки матки (децидуальная оболочка обозначается зелеными маркерами). Вторая ткань, которая будет взята из внутренней части плаценты, - это ворсинки хориона плода (синие маркеры). Третья ткань, подлежащая забору, - хорионическая пластинка плода (красные маркеры) (адаптировано из справочного материала 36 ).Щелкните здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.


    Рис. 3. Морфология культур через 48 часов после выделения и удаления остатков ткани. ( A ) Внешний вид культурального супернатанта может существенно различаться между донорами плаценты до смывания остатков. Примеры культур 1 и 2 демонстрируют эту вариацию. Эти два выделения были выполнены одновременно, но из двух разных плацент. После промывания культуры будут очищены от эритроцитов и остатков тканей, как показано в примере 3.Последующие результаты расширения в целом согласуются. ( B ) После 48-часового обмена средой только несколько клеток будут прикреплены к колбе. Масштабная линейка = 200 мкм. Щелкните здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.


    Рис. 4. Морфология культур МСК во времени. ( A ) Через семь дней после выделения видны небольшие фибробластные колонии MSC, хотя клетки, не относящиеся к MSC, также будут присутствовать в виде круглых или слабо прикрепленных клеток. ( B ) Через 13 дней после выделения фибробластные колонии МСК имеют большие размеры, и часто монослой МСК сливается и готов к пассажу.( C ) Начиная с пассажа 2 и далее, монослой MSC при слиянии приобретает характерную водоворотную морфологию. Масштабная линейка = 200 мкм. Щелкните здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.


    Рисунок 5: Характеристика МСК с помощью проточной цитометрии и мезодермальной дифференцировки. ( A ) MSC, полученные из ворсин хориона плаценты, демонстрируют классический профиль маркеров MSC по данным анализа проточной цитометрии, хотя для этих маркеров клеточной поверхности экспрессия одинакова для всех типов MSC человека.Каждая гистограмма показывает интенсивность сигнала (ось x) в сравнении с нормализованным количеством ячеек на оси y (% от макс.). В этом репрезентативном наборе данных клетки были положительными по CD73, CD105 и CD44 и отрицательными по гематопоэтическим маркерам CD45, CD34 и HLA-DR. ( B ) Плацентарные МСК обычно подвергаются сильной остеогенной дифференцировке, однако ( C ) адипогенная дифференцировка может быть менее эффективной, чем МСК костного мозга. Изображения в подписях B и C были сделаны с 40-кратным увеличением.Щелкните здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.


    Рис. 6: Плацентарные МСК имеют материнское происхождение при использовании этого метода культивирования, несмотря на анатомическое расположение исходного материала. Графики показывают количественную оценку клеточного состава плода (мужской, XY) и материнского (женский, XX) в культурах плацентарных МСК, выделенных из децидуальной ткани, ворсинок хориона и тканей хорионической пластинки при каждом втором пассаже. Материнские клетки (XX) быстро и воспроизводимо захватывают культуры, полученные из тканей хориона плода.Плод = мужские = XY хромосомы, обнаруженные в отдельной клетке, материнские = женские = XX хромосомы, обнаруженные в отдельной клетке. Представленные здесь данные были получены от N = 3 независимых донорских плацент от младенцев мужского пола, при этом минимум 100 клеток были окрашены на XY FISH и подсчитаны для каждой точки данных. Столбцы представляют собой средние значения, а столбцы ошибок отражают одно стандартное отклонение. Щелкните здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

    .

    Смотрите также