• Среда питательная для выделения стафилококков сухая


    Питательная среда для выделения стафилококков сухая (Стафилококкагар)

    Предназначена для выделения стафилококков из исследуемого материала: пищевые продукты, грудное молоко, смывы, вода, кровь, кал, моча, мокрота, мазки из носоглотки, отделяемое ран, свищей, глаз и др. 
    Представляет собой мелкодисперсный, гигроскопичный, светочувствительный порошок светло-желтого цвета. 
    Состав: питательный агар для культивирования микроорганизмов сухой, натрия хлорид, натрий углекислый, динатрия фосфат обезвоженный. 
    Приготовление: набор реагентов в количестве, указанном на этикетке для приготовления конкретной серии питательной среды, размешивают в 1 л дистиллированной воды, доводят до кипения, кипятят 2-3 мин до полного расплавления агара. Среду фильтруют через ватно-марлевый фильтр и стерилизуют автоклавированием в течение 15 мин при температуре (121±2)°С. Среду охлаждают до температуры 45-50°С, разливают в стерильные чашки Петри слоем 3-4 мм. После застывания среды в чашках ее подсушивают, соблюдая правила асептики, при температуре (37±1) в течение 40-60 мин.Готовая среда в чашках Петри светло-желтого цвета.
    Готовую среду можно использовать в течение 10 сут при условии хранения ее при температуре от 2 до 8°С.
    Принцип действия: при посеве по 0,1 мл микробной взвеси каждого тест-штамма: Staphylococcus epidermidis АТСС 14990 и Staphylococcus saprophyticus АТСС 15305 из разведения 10~6 и Staphylococcus aureus «Виотко» из разведений 10"6 и 10’7, набор реагентов должен обеспечивать рост тест-штаммов на всех засеянных чашках не позднее 48 ч инкубации при температуре (37±1) °С в виде непрозрачных, круглых, слегка выпуклых, с ровными краями, влажной глянцевой поверхностью колоний, диаметром 1-3 мм. Колонии тест-штамма S. aureus «Виотко» желтого цвета, тест-штаммов S. epidermidis АТСС 14990 и S. saprophyticus АТСС 15305 - белого цвета.
    Набор реагентов должен полностью подавлять рост тест-штамма Proteus vulgaris НХ19 222, Escherichia coli 168/59 и Pseudomonas aeruginosa 273 на всех засеянных чашках при посеве по 0,1 мл микробной взвеси из разведения 10'2 и инкубации через (45±3) ч при температуре (37±1)°С.
    Проведение анализа: посев исследуемого материала проводить согласно ФС 42-1846-88 «Испытание лекарственных средств на микробиологическую чистоту» и приказом Минздрава СССР от 22.04.85 № 535 «Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследований, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебнопрофилактических учреждений». Учет результатов производят согласно ФС 42-1846-88 «Испытание лекарственных средств на микробиологическую чистоту» приказом Минздрава СССР от 22.04.85 № 535 «Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследований, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений».
    Цена дана с учетом НДС 10 % за 1 упаковку 250 г.

    Набор реагентов для бактериологических исследований «Питательная среда для выделения стафилококков сухая»

    Набор реагентов для бактериологических исследований «Питательная среда для выделения стафилококков сухая» (Стафилококкагар) предназначен для выделения стафилококков из исследуемого материала: пищевые продукты, грудное молоко, смывы, вода, кровь, кал, моча, мокрота, мазки из носоглотки, отделяемое ран, свищей, глаз и др. 

    Питательная среда для выделения стафилококков сухая представляет собой мелкодисперсный, гигроскопичный, светочувствительный порошок светло-желтого цвета.  

    Состав: питательный агар для культивирования микроорганизмов сухой, натрия хлорид, натрий углекислый, динатрия фосфат обезвоженный. 

    Приготовление: набор реагентов в количестве, указанном на этикетке для приготовления конкретной серии питательной среды, размешивают в 1 л дистиллированной воды, доводят до кипения, кипятят 2-3 мин до полного расплавления агара. Среду фильтруют через ватно-марлевый фильтр и стерилизуют автоклавированием в течение 15 мин при температуре (121±2)°С. Среду охлаждают до температуры 45-50°С, разливают в стерильные чашки Петри слоем 3-4 мм. После застывания среды в чашках ее подсушивают, соблюдая правила асептики, при температуре (37±1) в течение 40-60 мин.Готовая среда в чашках Петри светло-желтого цвета. Готовую среду можно использовать в течение 10 сут при условии хранения ее при температуре от 2 до 8°С.

    Принцип действия: при посеве по 0,1 мл микробной взвеси каждого тест-штамма: Staphylococcus epidermidis АТСС 14990 и Staphylococcus saprophyticus АТСС 15305 из разведения 10~6 и Staphylococcus aureus «Виотко» из разведений 10"6 и 10’7, набор реагентов должен обеспечивать рост тест-штаммов на всех засеянных чашках не позднее 48 ч инкубации при температуре (37±1) °С в виде непрозрачных, круглых, слегка выпуклых, с ровными краями, влажной глянцевой поверхностью колоний, диаметром 1-3 мм. Колонии тест-штамма S. aureus «Виотко» желтого цвета, тест-штаммов S. epidermidis АТСС 14990 и S. saprophyticus АТСС 15305 - белого цвета.

    Набор реагентов должен полностью подавлять рост тест-штамма Proteus vulgaris НХ19 222, Escherichia coli 168/59 и Pseudomonas aeruginosa 273 на всех засеянных чашках при посеве по 0,1 мл микробной взвеси из разведения 10'2 и инкубации через (45±3) ч при температуре (37±1) °С.

    Проведение анализа: посев исследуемого материала проводить согласно ФС 42-1846-88 «Испытание лекарственных средств на микробиологическую чистоту» и приказом Минздрава СССР от 22.04.85 № 535 «Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследований, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебнопрофилактических учреждений».

    Учет результатов производят согласно ФС 42-1846-88 «Испытание лекарственных средств на микробиологическую чистоту» приказом Минздрава СССР от 22.04.85 № 535 «Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследований, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений».

    Упаковка: полиэтиленовые банки по 0,25 кг.

    Срок годности- 2 года.

    Цена дана с учетом НДС за 1кг.

    Питательные среды для культивирования стафилококков — Мегаобучалка

    Для выделения культур стафилококков обычно используют 5%-ный кровяной агар (кровь овцы, кролика, крупного рогатого скота). При исследовании образцов, содержащих постороннюю микрофлору, целесообразно использовать селективные среды.

    Таблица 9. Дифференциальные признаки стафилококков, имеющих основное медицинское значение

    Признак S. aureus S. epidermidis S. saprophyticus
    Anaerobius Aureus
    Наличие каротиноидного сегмента ± +
    Способность к росту в анаэробных условиях (тиогликолевая среда) + + + ±
    Рост на средах с 10% NaCI + + ± (слабо) +
    Рост при:        
    15°С ? + – (слабо) +
    45°С + + ±
    Образование кислоты при ферментации углеводов в аэробных условиях:
    ксилоза
    арабиноза
    раффиноза
    сахароза + + + +
    маннит + ±
    манноза + ±
    трегалоза + +
    лактоза + ± ±
    галактоза + ±
    фруктоза + + + +
    ксилит ±
    Восстановление нитратов + + (слабо)
    Щелочная фосфатаза + + +
    Гиалуронидаза + + + ?
    Уреаза ? ± + +
    Коагулаза (на сыворотке кролика) + +
    Фибринолизин ? ± ± ?
    Гемолитическая активность + + – (слабо)
    ДНКаза + + – (слабо)
    Чувствительность к новобиоцину (МИК >1,6 мкг/мл) + + +

     

    С целью дифференциации патогенных стафилококков от сапрофитных, а также от микрококков, используют среды, позволяющие одновременно определить один из признаков, характеризующих патоген­ные стафилококки. Приводим рецепты некоторых питательных сред.

    Молочно-солевой агар

    В 100 мл МПБ растворяют 6,5 г хлорида натрия, 20 г агар-агара. Устанавливают рН 7,4, стерилизуют при 121°С 20 минут. Перед использованием агар расплавляют, охлаждают до 45°С, добавляют 10% стерильного обезжиренного молока и разливают по чашкам Петри. На этой среде определяют пигментообразование и способность к росту при наличии 6,5% хлорида натрия.



    Лактозо-солевой бульон с фенолротом

    В 1000 мл дистиллированной воды растворяют 10 г триптона, 5 г мясного экстракта, 1 г дрожжевого экстракта, 5 г хлористого лития, 20 г агара. Устанавливают рН 6,8, разливают по пробиркам и стерилизуют при 121°С 15 минут. При росте коагулазоположигельных стафилококков среда желтеет (тест на коагулазу положительный).

    Теллурит-полимиксин-желточный агар Крисли

    В 1000 мл дистиллированной воды растворяют 10 г триптона, 5 г дрожжевого экстракта, 5 г маннита, 20 г хлорида натрия, 2 г хлористого лития, 18 г агара. Устанавливают рН 7,3, стерилизуют 15 минут при 121°С. Перед использова­нием в среду добавляют 100 мл 30%-ной желточной эмульсии (на фи­зиологическом растворе), 0,4 мл стерилизованного фильтрацией 1%-ного водного раствора полимиксина М, 10 мл стерилизованного автоклавированием (121°С 15 мин) 1%-ного водного раствора теллурита натрия.

    Среда Джиолиотта и Кантони

    В 1000 мл дистиллированной воды растворяют 10 г триптона, 5 г мясного экстракта, 5 г дрожжевого экст­ракта, 5 г хлористого лития, 20 г маннита, 5 г хлористого натрия, 1,2 г глицина, 3 г пирувата натрия. Устанавливают рН 6,9, стерилизуют при 115°С 20 мин. Перед употреблением к среде добавляют 0,1 мл 1%-ного водного раствора теллурита натрия, стерилизованного фильтра­цией, При росте коагулазоположительных стафилококков наблюдается почернение среды или черный осадок.

    Среда Бэрда-Паркера

    К 90 мл основной среды с температурой 45°С добавляют 6,3 мл глицинового раствора, 1 мл раствора теллурита натрия, 5 мл эмульсии желтка, перемешивают и разливают в чашки Петри. Среда пригодна к использованию в течение 28 дней (хранение при 4°С). Перед посевом на поверхность среды наносят 0,5 мл 20%-ного водного раствора пирувата натрия, стерилизованного фильтра­цией; распределяют по поверхности, подсушивают. Колонии коагула­зоположительных стафилококков черные, блестящие, с узкой серо-белой полосой и окружены прозрачной зоной.

    Желточная эмульсия. Свежее куриное яйцо выдерживают в 0,001%-ном растворе HgCl2. Соблюдая требования асептики, отделяют желток и эмульгируют его в 200 мл физиологического раствора.

    Глициновый раствор. Глицин — 20 г, дистиллированная вода — 100 мл. Стерилизуют при 120°С 15 минут.

    Раствор теллурита натрия. Теллурит натрия — 1 г, дистиллированная вода — 100 мл. Стерилизуют фильтрацией.

    Желточно-солевой агар Чистовича

    В расплавленный МПА с 10% хлорида натрия (рН 7,2), охлажденный до температуры 60°С, добавляют желточную эмульсию. После тщательного перемешивания питательную среду разливают в чашки Петри.

    Среда Чаплина-Бернса

    К 100 мл МПА добавляют 3,3 мл 0,1%-ного водного раствора кристаллического фиолетового и 5 г лактозы. Устанавливают рН 6,8. Стерилизуют автоклавированием (110°С 30 минут). Колонии патогенных стафилококков растут быстрее, чем непатогенных, и приобретают фиолетовый или оранжевый цвет.

    Среда Чемпена (для выделения патогенных стафилококков)

    Вариант 1: пептон — 1%, D-маннит — 1%, натрия хлорид — 7,5%, дрожжевой экстракт — 0,25%, двузамещенный фосфорнокислый ка­лий — 0,5%, агар-агар — 1,5%. Среду стерилизуют 90 минут при 110°С, устанавливают рН 7,0 и добавляют 10% стерильного обезжиренного молока (молоко способствует лучшему образованию пигмента).

    Вариант 2: пептон — 1%, дрожжевой экстракт — 0, 25%, желатин — 3%, лактоза — 0,2%, D-маннит — 1%, натрия хлорид — 7,5%, двузамещен­ный фосфорнокислый калий — 0,5%, агар-агар — 1,5%. Стерилизуют 90 минут при 110°С, устанавливают рН 7,0.

    Среда элективная солевая (Агар)

    Среда элективная солевая (Агар)

    Предназначен для приготовления жидких и плотных питательных сред, используемых при проведении микробиологических исследований.
    Среда элективная солевая - питательная среда для выделения стафилококков, сухая представляет собой мелкодисперсный гомогенный, гигроскопичный, светочувствительный  порошок желтого цвета.
    Состав (в пересчете на 1 л готовой среды):
    • Пептон ферментативный, сухой - 5,0 г.
    • Гидролизат рыбный ферментативный - 8,0 г.
    • Экстракт автолизированных дрожжей осветленный - 1,4 г.
    • Натрий хлористый - 85,0 г.
    • Агар микробиологический (для плотной среды) - 11,0 г.
    • Натрий углекислый - 0,3 г.
    • Натрий фосфорнокислый двузамещённый безводный - 0,3 г.
    Жидкая или плотная питательная среда для выделения стафилококков при микробиологическом контроле.
    Приготовление жидкой среды: 98 г сухой среды размешать в 1 л воды очищенной, довести до кипения, кипятить 1-3 мин до полного растворения, при необходимости профильтровать через бумажный фильтр, разлить по 5 мл в стерильные пробирки. Стерилизовать в течение 15 мин при температуре 121оC. 
    Готовая среда должна быть прозрачной, светло-желтого цвета. Готовую среду до использования можно хранить в темном месте не более 10 сут при температуре 2-8 °С.
    Приготовление плотной питательной среды: 111 г сухой среды размешать в 1 л воды очищенной, довести до кипения, кипятить 1-3 мин до полного растворения, при необходимости профильтровать через ватно-марлевый фильтр. Стерилизовать при температуре 121оC в течение 15 мин. Среду охладить до 50C, разлить в стерильные чашки Петри. Оставить чашки открытыми при комнатной температуре для застывания и подсушивания на 1,5 часа в асептических условиях. Добавление 10% желточной  взвеси приготовленной на стерильном физиологическом растворе в среду обеспечивает рост колоний  Staphylococcus aureus с ЛВА.
    Готовая среда должна быть прозрачной, светло-желтого цвета. Готовую среду до использования можно хранить в темном месте не более 10 сут при температуре 2-8°С.
    Посевы исследуемых образцов инкубировать 44 - 48 ч при температуре 37оС. На жидкой среде рост  стафилококков регистрируется по помутнению среды, на плотной – по появлению на чашках изолированных непрозрачных окрашенных колоний.
    Потенциальный риск применения набора – класс 2б (Приказ МЗ РФ № 4н от 06.06.2012г.). Меры предосторожности при использовании по назначению готовых питательных сред – соблюдение требований СП 1.3.2322-08 Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и гельминтами и возбудителями паразитарных инфекций. 
    Утилизация сухих сред с истекшим сроком хранения и использованных готовых питательных сред – в соответствии с требованиями СанПиН 2.1.7.728-99 Правила сбора, хранения и удаления отходов лечебно-профилактических учреждений.
    Хранение - в упаковке предприятия-изготовителя в сухом, защищенном от света месте при температуре от 2оС до 25оС. Замораживание не допускается.
    Срок годности сухих сред – 2 года. Среды с истекшим сроком годности применению не подлежат.
    Транспортирование - при температуре от 2оС до 25оС. Замораживание не допускается.
    Цена дана с учетом НДС 10% за 1 кг среды.

    Питательные среды для выращивания стафилококка

    01.11.2010г.

    Питательный солевой агар приготовляется по следующему рецепту:

    • мясной воды — 1000 мл;
    • хлористый натр — 75,0;
    • пептона — 10,0 агарагар — 20,0.

    Среда стерилизуется при 110°С тридцать минут, рН = 7,2— 7,4. После стерилизации в автоклаве среду сохраняют в рефрижераторе при температуре 6—10°С.

    Молочно-солевой агар готовится добавлением к солевому агару стерильного снятого молока 10—20% и разливается в чашки Петри. Стерильное молоко рекомендуется заготовлять по 15—20 мл в пробирках. Стерилизация проводится текучим паром три дня подряд по 30 минут. Твердые среды можно готовить и на казеиновом бульоне.

    Желточно-солевой агар — элективно-дифференциальная среда для выделения патогенных стафилококков (Г. Н. Чистович, 1952).

    Приготовление: к растопленному и остуженному до 50—55° мясопептонному агару, содержащему 10% хлорида натрия, добавляется 20процентная желточная взвесь. Яйцо перед вскрытием моют в теплой воде с мылом, помещают в 5% раствор карболовой кислоты на 4 минуты, протирают стерильной ватой, смазывают спиртом и обжигают. 

    В стерильную колбу выливают стерильно извлеченный желток, перемешивают с 180—200 мл стерильного физиологического раствора до получения однородной суспензии. Желточная взвесь, разлитая на чашки, может храниться при температуре от 4 до 8° 20— 30 дней. На этой среде патогенный стафилококк через 24 часа образует колонии с радужным венчиком в результате лецитовителазной реакции.

    При отсутствии ЖСА для выделения стафилококков можно использовать МПА с 10% содержанием хлорида натрия и МПБ с 10—15% содержанием хлорида натрия.


    «Бактериологическая диагностика и профилактика стафилококковых заболеваний»,
    Н.Р.Иванов, Л.М.Скитева, Н.С.Солун

    Читайте далее:

    каталог стр 4

    КАТАЛОГ ПРОДУКЦИИ

    О207  Лактобакагар полужидкий

    Питательная среда для выделения и культивирования лактобацилл сухая

    ⁠⁠Фасовка 250 г.

    Срок годности – 2 года со дня изготовления. 

     

    О107 Мартена пептон

    ⁠Белковая основа питательных сред

    ⁠Фасовка 0,2-0,4 л.

    Срок годности – 2 года со дня изготовления.

     1    2       3      4       5      6      7       8       9      10     11     12

    Питательные среды

    Маннитовый солевой агар для изоляции Staphylococcus aureus

    Маннитовый солевой агар

    (MSA) используется в качестве селективной и дифференциальной среды для выделения и идентификации Staphylococcus aureus из клинических и неклинических образцов. Он стимулирует рост группы определенных бактерий, подавляя рост других. Это селективная среда, приготовленная в соответствии с рекомендациями Чепмена для выделения предположительно патогенных стафилококков.

    Состав солевого агара с маннитолом (MSA)

    ткани животного происхождения
    Ингредиенты
    г / л
    Панкреатический гидролизат казеина 5,0 г
    Пептический гидролизат г
    Экстракт говядины 1,0 г
    Хлорид натрия 75,0 г
    D-маннитол 10,0 г
    Фенол красный 0.025 г
    Агар 15,0 г
    Всего 111,025 г

    Дистиллированная вода = 1000 мл

    Конечный pH 7,4 ± 0,2 при 25 ° C.

    Принцип действия маннитолового солевого агара

    Маннитовый солевой агар содержит пептонов, и говяжьего экстракта, , которые обеспечивают азот, витамины, минералы и аминокислоты, необходимые для роста. 7,5% концентрация хлорида натрия приводит к частичному или полному подавлению бактериальных организмов, отличных от стафилококков. Хлорид натрия также поставляет необходимые электролиты для транспортного и осмотического баланса. Маннитол - ферментируемый углевод, ферментация которого приводит к образованию кислоты, обнаруживаемой индикатором фенолового красного. помогает в дифференциации стафилококков. Коагулазо-положительные стафилококки (например, Staphylococcus aureus ) образуют желтые колонии и окружающую желтую среду, в то время как коагулазо-отрицательные стафилококки образуют красные колонии и не меняют цвет индикатора фенолового красного. Агар - отвердитель.

    Добавление 5% об. / Об. Эмульсия яичного желтка позволяет определять липазную активность стафилококков наряду с ферментацией маннита. Соль очищает эмульсию яичного желтка, а выработка липазы определяется как желтая непрозрачная зона вокруг колоний.

    Использование маннитолового солевого агара

    1. Он используется для селективного выделения и дифференциации Staphylococcus aureus из клинических образцов.
    2. Он также используется для подсчета стафилококков в пищевых и молочных продуктах.
    3. Эта среда также включена в Руководство по бактериологическому анализу для тестирования косметики.
    4. Он также используется при бактериологическом исследовании воды плавательных бассейнов, спа и питьевой воды с использованием мембранной фильтрации.

    Приготовление солевого агара с маннитолом

    1. Суспендировать 111,025 г среды MRS в 1000 мл дистиллированной воды.
    2. Кипятить для полного растворения среды.
    3. Автоклав при 121 ° C в течение 15-20 минут.

    ( Дополнительно : добавить 5% об. Эмульсии яичного желтка)

    1. Охладить до 45-50 ° C и разлить в чашки Петри.

    Интерпретация результатов на солевом агаре с маннитолом

    Организмы
    Результаты
    Staphylococcus aureus Желтые колонии с желтыми зонами.
    Стафилококки, кроме S. aureus (, например, Staphylococcus epidermidis) Бесцветные или красные колонии с красными зонами.
    Streptococci Нет роста, чтобы проследить рост.
    Micrococci Большие, от белого до оранжевого.
    Грамотрицательные бактерии Нет роста, чтобы проследить рост.

    Контроль качества маннитолового солевого агара

    Положительный контроль: Staphylococcus aureus ATCC 6538, желтые колонии среднего размера

    Отрицательный контроль: Escherichia coli ATCC 25922, частичное ингибирование.

    Ограничения маннитолового солевого агара

    1. Несколько видов Staphylococcus , кроме aureus , являются маннитол-положительными и образуют желтые колонии, окруженные желтыми зонами на этой среде (e.грамм. S. capitis, S. xylosus, S. cohnii, S. sciuri, S. simulans и другие виды). Следовательно, необходимы дальнейшие биохимические тесты для идентификации S. aureus или других видов.
    2. Большинство организмов, кроме стафилококков, подавляются высокой концентрацией соли, обнаруженной в солевом агаре с маннитолом, за исключением некоторых галофильных морских организмов.
    3. Некоторые штаммы Staphylococcus aureus могут проявлять замедленную ферментацию маннита. Перед утилизацией отрицательные чашки необходимо повторно инкубировать в течение ночи.
    4. Предположительный Staphylococcus aureus должен быть подтвержден с помощью теста на коагулазу.

    Ссылки

    1. Маннитовый солевой агар. HiMedia.
    2. Маннитол-солевой агар (MSA) (среда Чепмена) Европейская фармакопея, Усп.
    3. Маннитовый солевой агар. Аккумикс.
    4. Маннитовый солевой агар. Биокар Диагностика - Rue des Quarante Mines - ZAC de Ther - Allonne - B.P. 10245 - F60002 Бове Седекс - Франция.
    5. Маннитовый солевой агар. Ремел.
    6. Маннитовый солевой агар.PML Microbiologicals, Inc.
    7. Маннитовый солевой агар. Acumedia Manufacturers, Inc.
    8. Маннитоловый солевой агар. Руководство Difco ™ и BBL ™, 2-е издание
    9. Маннитовый солевой агар. Liofilchem ​​SRL.
    10. BD Маннитовый солевой агар. Becton Dickinson GmbH.
    11. Маннитоловый солевой агар (MSA). Харди Диагностика.
    12. Маннитовый солевой агар. Обезвоженные питательные среды. Thermo Fisher Scientific Inc.
    13. https://en.wikipedia.org/wiki/Mannitol_salt_agar
    .

    PPT - Выделение и идентификация стафилококков Презентация PowerPoint

  • Выделение и идентификация стафилококков

  • Пятно по граммам • Грамположительный стафилококк, CN, стафилококки, стафилококки, стафилококки, стрептококки, стафилококки, стафилококки, стрептококки, стафилококки, стафилококки saprophyticus

  • Грамположительные кокки

  • Каталаза + ve

  • Oxidase -ve

  • CoagulaseS ocus Nermochylocity Nermochylocity Nermochylocity Nermochylocity Положительный стапокисовый нерв Трубчатый метод Коагулазный тест

  • Негемолитический Вид стафилококка: Staphylococcus epidermidis

  • Staphylococcus saprophyticus: негемолитический, ярко-белый, кремового цвета nies

  • Штаммы Staphylococcus aureus образуют золотисто-желтый пигмент

  • Штаммы Staphylococcus aureus не являются золотисто-желтым пигментом производитель

  • МАННИТОЛ САЛТИН• Экстракт говядины. • D-маннит .............. 1,0%. • Хлорид натрия ...... 7,5%. • Агар ......................... 1,5%. • Фенол красный. КАК ИНДИКАТОР PH • Конечный pH 7,4 ± 0,2 при 25 ° C.

  • PRINCIPLEAND RESULTS • Маннитоловый солевой агар является питательной средой из-за содержания в нем пептонов и экстракта говядины, которые обеспечивают жизненно важные факторы роста, такие как азот, углерод, серу и микроэлементы. • 7,5% концентрация хлорида натрия приводит к подавлению других бактериальных организмов, кроме стафилококков.• Ферментация маннита, на что указывает изменение индикатора фенолового красного, способствует дифференциации стафилококков.

  • Маннитол Солевой агар Staph. epidermidis Staph. aureus

  • Маннитол Солевой агар

  • NB Staph. saprophyticus Staph. epidermidis Coagulase Negative Staph. Novobiocin. Тест на устойчивость к новобиоцину. Процедура: 1. Засейте пластину кровяного агара тестируемым организмом. 2. С соблюдением правил асептики нанесите диск Novobiocin на центр области с полосами.3. Инкубируйте планшет при 37 ° C в течение 24 часов. 4. Точно измерьте диаметр запрещенной зоны вокруг диска.

  • Тест на новобиоцин Диск с новобиоцином будет помещен на чашку. Новобиоцин - это антибиотик, к которому чувствительны многие штаммы стафилококка, за исключением одного, Staph. saprophyticus, который является антибиотиком новобиоцина.

  • Staphylococcus epidermidis Рост на кровяном агаре Обратите внимание, что на кровяном агаре нет гемолиза (гамма-реакции), и организм чувствителен к антибиотику новобиоцину, что показано зоной ингибирования.

  • Staphylococcus saprophyticus Рост на кровяном агаре Обратите внимание, что на кровяном агаре нет гемолиза (гамма-реакции), и организм устойчив к антибиотику новобиоцину.

  • Staphylococcus aureus Рост на кровяном агаре Обратите внимание на бета-гемолиз (полный лизис эритроцитов вокруг колоний; см. Стрелки) на кровяном агаре, и организм чувствителен к антибиотику новобиоцину.

  • DNase TEST AGAR Ингредиенты среды Ферментативный гидролизат казеина................. 1,5% ферментного переваривающего вещества тканей животных ..... 0,5% хлорида натрия .................. ................. 0,5% дезоксирибонуклеиновая кислота ............. 0,2% агар ............. ........................... 1,5% Конечный pH: 7,3 ± 0,2 при 25 ° C Принципы процедуры Азот, витамин и углерод Источники предоставлены Enzymatic Digest of Casein и Enzymatic Digest of Animal Tissue. Хлорид натрия обеспечивает необходимые ионы, сохраняя при этом осмотический баланс. Дезоксирибонуклеиновая кислота позволяет обнаруживать ДНКазы, которые деполимеризуют ДНК.Агар - это отвердитель. Процедура испытания 1. Засейте чашки, нанеся пятна или штриховку тяжелого инокулята исследуемого организма. 2. Инкубируйте планшеты при 35 ± 2 ° C в течение 18–24 часов и до 48 часов. 3. Залить пластины с 1 н. HCl. 4. Следите за расчисткой вокруг пятна или полосы. Запишите результаты. Результаты. Зона просвета вокруг пятна или полосы указывает на активность ДНКазы.

  • Staphylococcus aureus Рост на ДНКазном агаре Обратите внимание, что в агаре происходит разрушение ДНК.Вокруг роста бактерий имеется четкая зона (стрелка), где в агаре больше не остается ДНК, которая могла бы выпасть из раствора после добавления 1 н. HCL.

  • Staphylococcus epidermidis Рост на ДНКазном агаре Обратите внимание, что в агаре нет разрушения ДНК. После добавления 1 н. HCl вся пластина стала мутной, поскольку ДНК выпала из раствора. Вокруг роста бактерий нет четкой зоны.

  • ДНКазный тест-агар с метиловым зеленым Метиловый зеленый образует комплекс с интактной (полимеризованной) ДНК, образуя среду зеленого цвета.Активность ДНКазы деполимеризует ДНК, разрушая комплекс метиловый зеленый-ДНК, что приводит к образованию бесцветных зон вокруг колоний тестируемого организма. На отрицательный результат указывает отсутствие бесцветной зоны вокруг колоний.

  • ДНКазный тест-агар с толуидиновым синим Толуидиновый синий образует комплекс с интактной (полимеризованной) ДНК. В интактном комплексе ДНК толуидиновый синий имеет нормальный синий цвет. Активность ДНКзы деполимеризует ДНК, разрушая комплекс краситель-ДНК.В присутствии нуклеотидов, образующихся в результате деполимеризации ДНКазы, краситель принимает свой метахроматический цвет, образуя зоны от розового до красного вокруг роста бактерий. Отрицательный результат теста указывается, когда среда остается синей.

  • Белок A Латексный тест L Белок A обнаружен на поверхности клеток примерно 95% человеческих штаммов S. aureus и обладает способностью связывать Fc-часть иммуноглобулина G (IgG) L IgG SSLSS Fc LLSS = S.aureus с белком AL = латексная частица S Белок AS

  • Staphyloslide ™ Латексный тест на Staphylococcus aureus Латексный тест состоит из латексных частиц, покрытых человеческим фибриногеном и IgG.При смешивании латексного реагента с колониями стафилококков, в которых присутствует фактор слипания или протеин А, произойдет перекрестное сшивание, приводящее к видимой агглютинации латексных частиц. Такая агглютинация происходит, в частности, с S. aureus. Если ни фактор слипания, ни белок A не присутствуют, агглютинация не происходит, и результат будет считаться отрицательным.

  • Конец

  • .

    % PDF-1.4 % 213 0 объект > endobj xref 213 90 0000000016 00000 н. 0000002786 00000 н. 0000002954 00000 н. 0000002990 00000 н. 0000003502 00000 н. 0000003615 00000 н. 0000003727 00000 н. 0000003839 00000 н. 0000004741 00000 н. 0000005378 00000 п. 0000005542 00000 н. 0000006439 00000 н. 0000006586 00000 н. 0000006623 00000 н. 0000007793 00000 н. 0000008957 00000 н. 0000009023 00000 н. 0000022531 00000 п. 0000023852 00000 п. 0000025017 00000 п. 0000025950 00000 п. 0000026846 00000 н. 0000028011 00000 п. 0000028936 00000 п. 0000029575 00000 п. 0000030741 00000 п. 0000031622 00000 п. 0000032493 00000 п. 0000032634 00000 п. 0000032688 00000 п. 0000044450 00000 п. 0000045270 00000 п. 0000046089 00000 п. 0000047003 00000 п. 0000047303 00000 п. 0000047466 00000 п. 0000047698 00000 п. 0000048635 00000 п. 0000049397 00000 п. 0000052090 00000 н. 0000062453 00000 п. 0000065751 00000 п. 0000076209 00000 п. 0000087495 00000 п. 0000097419 00000 п. 0000108646 00000 п. 0000108706 00000 н. 0000108766 00000 н. 0000118744 00000 н. 0000119855 00000 н. 0000120141 00000 н. 0000120203 00000 н. 0000125009 00000 н. 0000126630 00000 н. 0000126915 00000 н. 0000127408 00000 н. 0000127495 00000 н. 0000145086 00000 н. 0000145158 00000 н. 0000145417 00000 н. 0000145515 00000 н. 0000145615 00000 н. 0000145732 00000 н. 0000145846 00000 н. 0000145984 00000 п. 0000146111 00000 п. 0000146249 00000 н. 0000146401 00000 п. 0000146531 00000 н. 0000146670 00000 н. 0000146785 00000 н. 0000146939 00000 н. 0000147112 00000 н. 0000147233 00000 н. 0000147385 00000 п. 0000147516 00000 н. 0000147635 00000 п. 0000147796 00000 н. 0000147946 00000 н. 0000148083 00000 н. 0000148244 00000 н. 0000148406 00000 н. 0000148539 00000 н. 0000148672 00000 н. 0000148812 00000 н. 0000148967 00000 н. 0000149118 00000 н. 0000149237 00000 п. 0000149408 00000 п. 0000002096 00000 н. трейлер ] / Назад 695162 >> startxref 0 %% EOF 302 0 объект > поток hb```f` b, ep * @ Y [ӂ29PM> bGgD> 9ϗJ [r ~ VXz {z \ * 'mk "V ULPL 珉 $ oO 4ѯCcc P $$ xa [LV: M; = .№

    .

    PPT - Выделение и идентификация стафилококков PowerPoint Presentation

  • بسم الله الرحمن الرحيم Выделение и идентификация стафилококков

  • Стафилококки в других полостях слизистой оболочки стафилококков часто обнаруживаются в качестве стафилококков ( Стафилококки). а также на коже. • Грамположительные кокки диаметром 0,8–1,0 мкм встречаются поодиночке, парами, короткими цепочками и, как правило, неправильными гроздьями, напоминающими виноград.• Каталаза положительный. • Оксидаза отрицательный • Восстанавливает нитраты до нитритов. • Обычно переносят относительно высокие концентрации хлорида натрия (7,5-10%) и теллурита. Эта способность часто используется при приготовлении селективных сред для стафилококков.

  • Грамположительные кокки

  • Положительные по каталазе

  • Оксидаза -ve

  • Стафилококки Виды стафилококков Клинические виды инфекций, вызываемых стафилококками:• Эпидермальный стафилококк. • Staphylococcus haemolyticus. • Staphylococcus saprophyticus.

  • Граму • грамотрицательные кокки каталазы _ + стрептококки Oxidase _ + тест R Macrococci стафилококки Bacitracin Восприимчивость S Микрококки Коагулазо _ + эпидермального стафилококка ЦНС стафилококк гемолитический стафилококк стафилококк сапрофитный

  • стафилококк • золотистый стафилококк является наиболее патогенным видом и участвует в различных инфекциях.Приблизительно 30% взрослых и большинство детей являются здоровыми носителями S. aureus через нос. В большинстве случаев инфекции S. aureus источником организма является либо здоровый носовой носитель, либо контакт с абсцессом инфицированного человека. Входной портал - это обычно кожа. S. aureus вызывает воспалительные поражения, наполненные гноем, известные как абсцессы. • В зависимости от локализации и степени поражения тканей абсцесс может называться пустулом (инфицированный волосяной фолликул), фурункулом или фурункулом (если он распространяется от волосяного фолликула на прилегающую подкожную ткань) или карбункулом (множественные очаги инфекции. вовлекает более глубокую соединительную ткань).• Он также может распространяться через мягкие ткани и вызывать целлюлит. S. aureus часто вызывает инфицирование случайных ран и послеоперационных ран, хотя может также инфицировать здоровую неповрежденную кожу.

  • Реже S. aureus может вырваться из локального поражения и распространиться с кровью на другие участки тела, вызывая различные системные инфекции, которые могут поражать все системы и органы. Такие системные инфекции включают сепсис, септический артрит, эндокардит, менингит и остеомиелит, а также абсцессы в легких, селезенке, печени и почках.Пневмония, вызванная S. aureus, также может быть вторичным респираторным осложнением вирусных инфекций, таких как корь и грипп. Наконец, S. aureus часто попадает в пищу через абсцессы или через носовую полость работников, занимающихся обработкой пищевых продуктов. Если ему позволить расти и вырабатывать энтеротоксин, он может вызвать стафилококковое пищевое отравление.

  • Факторы вирулентности для Staphylococcus aureus Факторы вирулентности для S. aureus включают: - • Экзотоксины, такие как: - • Лейкоцидин (убивает лейкоциты).• Альфа- и дельта-токсины (повреждают тканевые мембраны). • Микрокапсулы (сопротивляются поглощению и разрушению фагоцитами). • Коагулаза и протеин А (оба помогают противостоять поглощению фагоцитами). • Некоторые штаммы также продуцируют TSST-1 (токсин-1 синдрома токсического шока) и вызывают синдром токсического шока, обычно связанный с использованием тампонов или ранами. • Некоторые штаммы также продуцируют эксфолиатин, экзотоксин, вызывающий синдром ожога кожи, инфекцию, обычно наблюдаемую у младенцев и детей младшего возраста. • Поскольку большинство штаммов S. aureus продуцируют фермент коагулазу, их часто называют коагулазоположительными стафилококками.

  • Коагулазонегативные стафилококки • Клинически распространенные виды стафилококков, отличных от S. aureus, часто называют коагулазонегативными стафилококками. • Эти стафилококки представляют собой нормальную флору кожи и, как таковые, часто действуют как условно-патогенные микроорганизмы, особенно у пораженного хозяина. • S. saprophyticus - относительно частая причина инфекций мочевыводящих путей, особенно у здоровых молодых женщин, но редко выделяется из других источников.• S. epidermidis связан с эндокардитом.

  • Выделение и идентификация стафилококков Сегодня мы будем использовать ряд тестов, чтобы определить, является ли неизвестный S. aureus, S. epidermidis или S. saprophyticus. • Кровяной агар с диском новобиоцина (NB). Для выделения стафилококков клинические образцы обычно выращивают на Кровяном агаре. Стафилококки образуют круглые выпуклые непрозрачные колонии диаметром 1-2 мм. Диск новобиоцина используется для определения чувствительности или устойчивости к антибиотику новобиоцину.

  • Негемолитические Виды стафилококков: Staphylococcus epidermidis

  • Staphylococcus saprophyticus: негемолитические, ярко-белые, кремово-желтые колонии

  • золотисто-желтых стапур

  • Штамм Staphylococcus aureus не является золотисто-желтым пигментом производитель

  • Staphylococcus haemolyticus на кровяном агаре

  • Staph. Saprophyticus Коагулаза Negative Staph.Засейте пластинку с кровяным агаром исследуемым организмом. 2. С соблюдением правил асептики нанесите диск Novobiocin на центр области с полосами. 3. Инкубируйте планшет при 37 ° C в течение 24 часов.

  • Тест с новобиоцином Диск с новобиоцином будет помещен на планшет. Новобиоцин - это антибиотик, к которому чувствительны многие штаммы стафилококка, за исключением одного, Staph. saprophyticus, который является антибиотиком новобиоцина.

  • Staphylococcus epidermidis Рост на кровяном агаре Обратите внимание, что на кровяном агаре нет гемолиза (гамма-реакции), и организм чувствителен к антибиотику новобиоцину, что показано зоной ингибирования.

  • Staphylococcus saprophyticus Рост на кровяном агаре Обратите внимание, что на кровяном агаре нет гемолиза (гамма-реакции), и организм устойчив к антибиотику новобиоцину.

  • Окраска по Граму Все стафилококки выглядят как грамположительные кокки, обычно нерегулярными, часто похожими на виноградные гроздья. Ферментация маннита на агаре с солевым маннитом (MSA) Стафилококки способны переносить высокую концентрацию соли, обнаруженную в агаре с солевым маннитом, и поэтому легко растут.Если маннит сбраживается, образующаяся кислота превращает фенольный красный индикатор pH с красного (щелочной) на желтый (кислота).

  • MANNITOL SALT AGAR (MSA) • ИНГРЕДИЕНТЫ • Пептон. • Экстракт говядины. • D-маннит .............. 1,0%. • Хлорид натрия ...... 7,5%. • Агар ......................... 1,5%. • Фенол красный. КАК ИНДИКАТОР PH • Конечный pH 7,4 ± 0,2 при 25 ° C.

  • PRINCIPLEAND RESULTS • Маннитоловый солевой агар является питательной средой из-за содержания в нем пептонов и экстракта говядины, которые поставляют важные факторы роста, такие как азот, углерод, серу и микроэлементы.• 7,5% концентрация хлорида натрия приводит к подавлению других бактериальных организмов, кроме стафилококков. • Ферментация маннита, на что указывает изменение индикатора фенолового красного, способствует дифференциации стафилококков.

  • Маннитовый солевой агар

  • Продукция дезоксирибонуклеазы (ДНКазы) на ДНКазном агаре ДНКазный агар содержит 0,2% ДНК. Чтобы определить продукцию ДНКазы, планшет инокулируют и инкубируют.После выращивания пластину заливают 1 н. Соляной кислотой (HCl).

  • DNase TEST AGAR Ингредиенты среды Ферментативный гидролизат казеина ................. 1,5% ферментный гидролизат тканей животных ... 0,5% хлорид натрия .. ................................. 0,5% дезоксирибонуклеиновая кислота ............. 0,2% агар ........................................ 1,5% Конечный pH: 7,3 ± 0,2 при 25 ° C Принципы процедуры Источники азота, витаминов и углерода предоставлены Enzymatic Digest of Casein и Enzymatic Digest of Animal Tissue.Хлорид натрия обеспечивает необходимые ионы, сохраняя при этом осмотический баланс. Дезоксирибонуклеиновая кислота позволяет обнаруживать ДНКазы, которые деполимеризуют ДНК. Агар - это отвердитель. Процедура испытания 1. Засейте чашки, нанеся пятна или штриховку тяжелого инокулята исследуемого организма. 2. Инкубируйте планшеты при 35 ± 2 ° C в течение 18–24 часов и до 48 часов. 3. Залить пластины с 1 н. HCl. 4. Следите за расчисткой вокруг пятна или полосы. Запишите результаты. Результаты. Зона просвета вокруг пятна или полосы указывает на активность ДНКазы.

  • Staphylococcus aureus, выращиваемый на ДНКазном агаре Обратите внимание, что в агаре происходит разрушение ДНК. Вокруг роста бактерий имеется четкая зона (стрелка), где в агаре больше не остается ДНК, которая могла бы выпасть из раствора после добавления 1 н. HCL.

  • Staphylococcus epidermidis, выращиваемый на ДНКазном агаре Обратите внимание, что в агаре нет разрушения ДНК. После добавления 1 н. HCl вся пластина стала мутной, поскольку ДНК выпала из раствора.Вокруг роста бактерий нет четкой зоны.

  • Производство коагулазы Стафилококковый фермент коагулаза заставляет инокулированную цитратную плазму кролика превращаться в гель или коагулировать. Коагулаза превращает растворимый фибриноген в плазме в нерастворимый фибрин.

  • Коагулаза _ + Staphylococcus epidermidis Staphylococcus haemolyticus Staphylococcus aureus ЦНС Staphylococcus saprophyticus Отрицательный Положительный Положительный Отрицательный Метод скольжения Метод пробирки Protein Coagulase Test

    Latex

  • Latex
  • Тест на поверхности клеток % человеческих штаммов S.aureus и обладает способностью связывать Fc-часть иммуноглобулина G (IgG) L IgG SSLSS Fc LLSS = S.aureus с белком AL = латексная частица S-белок AS

  • Тест Staphyloslide® на фактор скопления клеточной стенки Тест Staphyloslide® обнаруживает фактор слипания полипептидов клеточной стенки, отличный от коагулазы. В тесте используются эритроциты барана, покрытые фибриногеном, которые смешиваются с организмом. Фактор слипания, если он присутствует на стенке бактериальной клетки, превращает растворимый фибриноген в нерастворимый фибрин, вызывая слипание эритроцитов барана.

  • Staphyloslide ™ Latex Test на Staphylococcus aureus Latex Test состоит из частиц латекса, покрытых человеческим фибриногеном и IgG. При смешивании латексного реагента с колониями стафилококков, в которых присутствует фактор слипания или протеин А, произойдет перекрестное сшивание, приводящее к видимой агглютинации латексных частиц. Такая агглютинация происходит, в частности, с S. aureus. Если ни фактор слипания, ни белок A не присутствуют, агглютинация не происходит, и результат будет считаться отрицательным.

  • .

    Новый упрощенный и быстрый метод скрининга и выделения полиненасыщенных жирных кислот, продуцирующих морские бактерии

    Бактериальное производство полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) - это потенциальный биотехнологический подход для производства ценных нутрицевтиков. Большая потребность в надежном методе скрининга количества штаммов за короткий период времени. Здесь мы сообщаем о новом упрощенном методе скрининга и выделения бактерий, продуцирующих ПНЖК, путем прямой визуализации с использованием анализа на планшете с H 2 O 2 .Окислительная стабильность ПНЖК в растущих бактериях по отношению к добавленному H 2 O 2 является отличительной характеристикой между продуцентами ПНЖК (без зоны ингибирования) и продуцентами не-ПНЖК (зона ингибирования) при прямой визуализации. Подтверждение результатов анализа осуществляли путем введения метиловых эфиров жирных кислот (FAME), продуцируемых отобранными морскими бактериями, в газовую хроматографию-масс-спектрометрию (GCMS). На сегодняшний день этот анализ является наиболее эффективным, недорогим и специфическим методом для бактерий, продуцирующих ПНЖК, и показывает резкое сокращение количества образцов, что позволяет экономить время, усилия и затраты на скрининг и изоляцию штаммов бактериальных продуцентов ПНЖК.

    1. Введение

    Микробные липиды представляют собой разнообразную группу соединений, которые имеют ряд жизненно важных нутрицевтических и фармацевтических применений и используются в коммерческих целях с 1980-х годов. Эти микробные липиды или полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК) получают из различных источников. Сегодня ПНЖК, производимые микроорганизмами (водоросли / грибы / бактерии), коммерчески конкурентоспособны с растительным и рыбьим жиром.

    ПНЖК - это жирные кислоты, имеющие более одной двойной связи. Эйкозапентаеновая кислота (EPA, 20: 5, n -3) и докозагексаеновая кислота (DHA, 22: 6, n -3) являются важными жирными кислотами n -3, а арахидоновая кислота (AA, 20: 4, n -6) представляет собой жизненно важную жирную кислоту n -6.EPA и DHA важны для профилактики артросклероза, рака, ревматоидного артрита, псориаза и заболеваний пожилого возраста, таких как болезнь Альцгеймера и возрастная дегенерация желтого пятна [1, 2]. АК и ДГК имеют особое значение для головного мозга и кровеносных сосудов и считаются необходимыми для пре- и постнатального развития мозга и сетчатки [3]. Эйкозаноиды, такие как простагландины, простациклины и лейкотриены, полученные из n -3 ПНЖК, также важны для развития новорожденных и младенцев, модулирующего сосудистого сопротивления и заживления ран [4–6].ПНЖК либо непосредственно доступны как компоненты рациона, либо производятся из предшественников, таких как линолевая кислота (LA, C18: 2 n -6) и α-линоленовая кислота (ALA, C18: 3 n -3) [7].

    Соответственно, ПНЖК являются очень важными веществами в фармацевтической, медицинской и пищевой областях. Недавние исследования были сосредоточены на микроорганизмах как альтернативном природном источнике для производства масел, содержащих ПНЖК. Это потенциально многообещающий источник липидов из-за их высокой скорости роста в простых средах и простоты манипуляции с ними.Поскольку количество традиционных источников n -3 жирных кислот, таких как рыбий жир, продолжает уменьшаться, идентификация альтернативных источников становится критически важной. Морские микроорганизмы представляют собой один из малоизученных источников биологически активных природных продуктов. Новые соединения с различной биоактивностью, такие как антибиотики, противоопухолевые, цитотоксические и противовоспалительные, были выделены и выяснены из этого источника [8].

    Учитывая важность ПНЖК, многие исследователи пытались изолировать и проверять морские организмы на наличие этих биоактивных соединений.Следующим шагом после выделения микроорганизмов является скрининг. В идеале селективная процедура позволила бы обнаруживать и изолировать микроорганизмы, продуцирующие желаемый метаболит. Этот первичный скрининг должен быть быстрым, недорогим, прогнозирующим, специфическим, но эффективным в широком диапазоне и применимым в больших масштабах. Иногда первичный скрининг занимает много времени и трудозатрат, когда необходимо проверить большое количество изолятов для выявления нескольких потенциальных. Однако это, возможно, самый важный шаг, поскольку он устраняет большую часть нежелательных изолятов, которые либо не являются производителями, либо производителями известных соединений.

    Сообщалось о методе скрининга и выделения длинноцепочечных ПНЖК морскими протистанами, но Bowles et al. Сочли его непригодным. для высокопроизводительного грохочения. Метод анализа на планшете H 2 O 2 может применяться к широкому спектру бактериальных образцов, собранных из разных регионов или из разных животных источников. Во время случайного скрининга сотен различных образцов морских бактерий мы успешно обнаружили новые штаммы морских микроорганизмов с особыми характеристиками для производства ПНЖК.

    Как правило, ПНЖК представляют собой молекулы, наиболее чувствительные к кислороду и активным формам кислорода (АФК) [10]. Есть факты, что ПНЖК стабильны, когда они in vivo против окислительного стресса, вызванного АФК. Это исследование было основано на применении антиоксидантного действия ПНЖК против АФК (рис. 1) для быстрого скрининга большого количества морских изолятов. Однако никакой информации о скрининге ПНЖК, продуцирующих морские бактерии, не поступало. В следующей стратегии мы представили качественный метод быстрого скрининга производителей ПНЖК.


    2. Методики эксперимента
    2.1. Материалы

    Все химические вещества и компоненты среды, использованные в настоящем исследовании, были класса AR и были закуплены у Hi Media Ltd, Мумбаи, Индия. Азид натрия был приобретен у S.D. Fine Chemicals Limited, Мумбаи, Индия.

    2.2. Среда и условия культивирования морских микроорганизмов
    2.2.1. Сбор образцов

    Различные образцы были собраны в разных регионах западного побережья Махараштры, Индия (рис. 2) и были доставлены в нашу лабораторию для дальнейшего исследования.


    2.2.2. Выделение морских бактерий

    Собранные образцы серийно разбавляли и высевали на чашки с питательным агаром. Посевные планшеты инкубировали при ° C в течение 24–48 ч. После инкубации выбранные бактериальные колонии очищали и пересевали на питательную агаровую среду для дальнейшего исследования. Все морские изоляты хранили в глицериновой смеси при (-) 20 ° C.

    2.3. Первичный скрининг морских бактериальных изолятов с помощью анализа H 2 O 2 на планшете

    Около 100 изолированных морских штаммов были случайным образом отобраны и проверены на продукцию ПНЖК (рис. 3).Все отобранные морские культуры культивировали в среде Лурия-Бертани (LB) (1% триптон, 0,5% дрожжевой экстракт, 1% NaCl) при ° C в течение 24 часов, 180 об / мин. К этой среде добавляли 0,5% NaCl для правильного роста морских изолятов, а не с использованием искусственной морской воды [11]. Чтобы узнать реакцию бактерий на H 2 O 2 , использовали бактериальную культуру, достигающую 1,0 мМ оптической плотности при 660 нм, которую распределяли по чашке, содержащей среду LB и азид натрия (NaN 3 , 1 мМ). На поверхность фильтровальной бумаги диски диаметром 5 мм помещали аликвоты по десять микролитров раствора, содержащего H 2 O 2 (0.01, 0,5, 1,0%, приготовленного из 30% исходного раствора) добавляли на диск фильтра. Затем планшеты инкубировали при ° C в течение 24 часов. Наблюдали зону ингибирования, и дальнейшее подтверждение продуцентов PUFA проводили с помощью GCMS.


    2.4. Вторичный скрининг и подтверждение
    2.4.1. Среда и условия культивирования

    Среди всех прошедших скрининг морских бактериальных культур положительные штаммы были отобраны на основе отсутствия зоны ингибирования (продуценты ПНЖК) и использованы далее для вторичного скрининга и подтверждения продукции ПНЖК.Петлю бактериальной культуры, выращенной на предварительно законсервированных скошенных средах LB, переносили в 20 мл бульона LB в колбе Эрленмайера на 100 мл и оставляли на шейкере при ° C на 24 ч при 180 об / мин. Один мл культуры переносили в 50 мл свежего стерилизованного бульона LB и оставляли на шейкере при ° C на 24 ч при 180 об / мин. Биомассу клеток собирали из ферментированных сред центрифугированием при 8000 об / мин при ° C в течение 10 мин. Биомассу тщательно промывали дистиллированной водой и окончательно сушили при 50 ° C в течение ночи.

    2.4.2. Прямая экстракция липидов и этерификация жирных кислот

    В данном исследовании был разработан и применен метод быстрой прямой экстракции и этерификации. Экстракцию липидов из биомассы проводили по модифицированной методике Hoshi et al. [12]. Липиды экстрагировали в течение 3-4 ч трехкратным объемом смеси хлороформ / метанол (2: 1, об. / Об.), Содержащим 15 мг БГТ для предотвращения окисления ПНЖК [13]. Этерификацию проводили добавлением 0,2 мл 20 мМ моногидрата ацетата меди в метаноле и 1 мл 0.Добавляли 5 н. HCl в метаноле и смесь оставляли на указанное время (2-3 ч) при комнатной температуре или при ° C. Реакцию останавливали добавлением 0,4 мл воды. Нижний слой хлороформа объединяли, затем упаривали и концентрировали на роторном испарителе (Buchi Rotavapor) при 35 ° C. Наконец, метиловые эфиры жирных кислот (FAME) растворяли в гексане (1 мл), фильтровали через фильтровальную бумагу Whatman № 1 и анализировали с помощью GCMS.

    2.4.3. Анализ ПНЖК с помощью GCMS

    Анализ FAME проводили с помощью GCMS с использованием слегка модифицированной процедуры [14].Все соединения были идентифицированы путем сравнения их времен удерживания со значениями известных стандартов и подтверждены ГХМС с использованием масс-спектрометра с ионной ловушкой Varian 220-MS (Varian, Inc. Walnut Creek, Калифорния), подключенного к Varian 450-GC, оборудованному CP-SIL 88. капиллярная колонка (25 м × 0,25 мм внутренний диаметр × 0,39 мм внешний диаметр, Varian). Инжектор поддерживали при 250 ° C, а термостат колонки был запрограммирован на повышение со 160 до 220 ° C при 7 ° C мин, а затем поддерживался при 220 ° C в течение 10 минут. Коэффициент разделения был скорректирован до 1:20.В качестве газа-носителя использовали гелий, и скорость потока поддерживалась на уровне 1 мл / мин. GCMS работал при напряжении ионизации 70 эВ и температуре ловушки 220 ° C с диапазоном масс 40–350 атомных единиц массы.

    3. Результаты и обсуждение
    3.1. Первичный скрининг изолятов морских бактерий с помощью H 2 O 2 -планшетный анализ

    In H 2 O 2 Метод -планшетного анализа, клетки, чувствительные к внешнему добавлению H 2 O 2 не может расти соответствующим образом и, таким образом, имеет зону ингибирования, которая зависит от добавленной концентрации H 2 O 2 на диске из фильтровальной бумаги.Диаметр зоны ингибирования прямо пропорционален концентрации добавляемой H 2 O 2 . Противоречивая ситуация наблюдалась для бактериальных клеток, продуцирующих ПНЖК. Эти клетки способны расти в присутствии добавленного H 2 O 2 на диске из фильтровальной бумаги. Как показано на Фигуре 4 (а), бактерии выращивали даже в присутствии H 2 O 2 из-за экранирующего мембранного эффекта ПНЖК. В большинстве случаев ПНЖК входят в число молекул, наиболее уязвимых для кислорода и ROS

    .

    Смотрите также

© 2020 nya-shka.ru Дорогие читатели уважайте наш труд, не воруйте контент. Ведь мы стараемся для вас!