Выделение чистой бактериальной культуры

Чистая культура бактерий и методы ее выделения

Методы выделения чистых культур микроорганизмов

Культивирование микроорганизмов, помимо состава питательной сре­ды, зависит от физических и химических факторов (температура, кислотность, аэрация, свет и т. д.). При этом количественные показатели каждого из них неодинаковы и определяются особенностями метаболиз­ма каждой группы бактерий. Существуют методы культивирования мик­роорганизмов на твердых и в жидких питательных средах в аэробных, анаэробных и других условиях.

Методы выделения чистых культур аэробных микроорганизмов. Для того, чтобы получить изолированные колонии, при нанесении материал распределяют так, чтобы клетки бактерий были удалены друг от друга. Для получения чистой культуры используют две основные группы методов:

а) мето­ды, основанные на принципе механического разделения микроорганизмов;

б) методы, основанные на биологиче­ских свойствах микроорганизмов.

Методы, основанные на принципе механического разде­ления микроорганизмов

Рассев шпателем по Дригальскому. Берут 3 чашки Петри с питательной средой. На 1-ю чашку петлей или пипеткой наносят кап­лю исследуемого материала и растирают шпателем по всей поверхности питательного агара. Затем шпатель пе­реносят во 2-ю чашку и втирают оставшуюся на шпателе культуру в поверхность питательной среды. Далее шпа­тель переносят в 3-ю чашку и аналогичным образом про­изводят посев. На 1-й чашке вырастает максимальное количество колоний, на 3-й — минимальное. В зависимо­сти от содержания микробных клеток в исследуемом ма­териале на одной из чашек вырастают отдельные коло­нии, пригодные для выделения чистой культуры микро­организма.

Метод Пастера (метод разведений). Из исследуемого материала готовят ряд последовательных, чаще десятикратных серийных разведений в жидкой стерильной среде или физиологическом растворе в пробирках. Далее высевают материал газоном по 0,5 мл из каждой пробирки. Предполагают, что в какой-то из пробирок останется количество микроорганизмов, поддающихся подсчету при высеве на пластинчатые среды. Этот метод дает возможность подсчитать микробное число в исследуемом материале. (Микробное число — количество колоний на последней чашке с ростом микроорганизмов, умноженное на степень разведения материала).

Рассев петлей (посев штрихами). Берут одну чашку Петри с питательным агаром и делят ее на 4 сектора, проводя разграничительные линии на внешней стороне дна чашки. Исследуемый ма­териал петлей вносят в первый сектор и проводят ею па­раллельные линии по всему сектору на расстоянии одна от другой около 5 мм. Этой же петлей, не изменяя ее положения по отношению к агару, проводят такие же линии на других секторах чашки. В том месте, где на агар попало большое количество микробных клеток, рост микроорганизмов будет в виде сплошного штриха. На секторах с небольшим количеством клеток вырастают отдельные колонии. Кроме того, можно наливать разведен­ные растворы смешанной культуры на поверхность твер­дых сред в чашках.

Метод фильтрации. Основан на пропускании исследуемого материала через специальные фильтры с определенным диаметром пор и разделении содержа­щихся микроорганизмов по величине. Этот метод при­меняется главным образом для очистки вирусов от бак­терий, а также при получении фагов и токсинов (в фильтрате — чистый фаг, очищенный токсин).

Методы, основанные на биологических свойствах мик­роорганизмов

Создание оптимальных условий для размножения

• Создание оптимального температурного режима для избирательного подавления размножения сопутствующей микрофлоры при низкой температуре и получения культур психрофильных или термофильных бактерий. Большинство микробов неплохо развиваются при 35-37°С, иерсинии хорошо растут при 22°С, лептоспиры культивируют при 30°С. Термофильные бактерии растут при температурах, лежащих за пределами температурных режимов прочих сопутствующих видов бактерий (так, кампилобактер культивируют при 42°С).
• Создание условий для аэробиоза или анаэробиоза. Большинство микроорганизмов хорошо растут в присутствии атмосферного кислорода. Облигатные анаэробы растут в условиях, исключающих присутствие атмосферного кислорода (возбудители столбняка, ботулизма, бифидумбактерии, бактероиды и др.). Микроаэрофильные микроорганизмы растут только при низком содержании кислорода и повышенном содержании СО2 (кампилобактер, геликобактер).
• Метод обогащения. Исследуемый материал за­севают на элективные питательные среды, способствую­щие росту определенного вида микроорганизмов.

Метод Пастера (метод предельных разведений).Заключается в том, что из исследуемого материала делают ряд последовательных разведений в жидкой питательной среде. Для этого каплю посевного материала вносят в пробирку со стерильной жидкой средой, из нее каплю переносят в следующую пробирку и так засевают до 8…10 пробирок. С каждым разведением количество микробных клеток, попадающих в среду, будет уменьшаться и можно получить такое разведение, в котором во всей пробирке со средой будет находиться только одна микробная клетка, из которой разовьется чистая культура микроорганизма.

Так как в жидких средах микробы растут диффузно, т.е. легко распределяются во всей среде, то изолировать одну микробную клетку от другой трудно. Таким образом, метод Пастера не всегда обеспечивает получение чистой культуры. Поэтому в настоящее время этот метод используется, главным образом, для предварительного уменьшения концентрации микроорганизмов в материале перед посевом его в плотную среду для получения изолированных колоний.

Методы механического разделения микроорганизмов с использованием плотных питательных сред.К таким методам относятся метод Коха и метод Дригальского.

Метод Коха (метод глубинного посева).

Исследуемый материал вносят бактериологической петлей или пастеровской пипеткой в пробирку с расплавленной плотной питательной средой. Равномерно размешивают содержимое пробирки, вращая ее между ладонями. Каплю разведенного материала переносят во вторую пробирку, из второй – в третью и т.д. Содержимое каждой пробирки, начиная с первой, выливают в стерильные чашки Петри. После застывания среды в чашках, их помещают в термостат для культивирования.

Для выделения анаэробных микроорганизмов по методу Коха необходимо ограничить доступ кислорода к культуре.

С этой целью поверхность глубинного посева в чашке Петри заливают стерильной смесью парафина и вазелина (1:1). Можно также оставлять посевной материал, тщательно перемешанный с агаризованной средой, непосредственно в пробирке.

Ватную пробку при этом заменяют резиновой или заливают поверхность агара смесью парафина и вазелинового масла. Чтобы извлечь выросшие колонии анаэробных микроорганизмов, пробирки слегка нагревают, быстро вращая над пламенем горелки. Агар, прилегающий к стенкам, расплавляется, и столбик легко выскальзывает в подготовленную чашку Петри. Далее столбик с агаром разрезают стерильным скальпелем, колонии извлекают стерильной петлей или стерильной капиллярной рубкой и переносят в жидкую среду.

Метод Дригальского основан на механическом разделении микробных клеток на поверхности плотной питательной среды в чашках Петри.

Каждая микробная клетка, фиксируясь в определенном месте, начинает размножаться, образуя колонию.

На поверхность среды вносят каплю исследуемого материала.

Затем с помощью стерильного шпателя эту каплю распределяют по всей питательной среде (посев газоном).

Посев также можно проводить штрихом, используя бактериологическую петлю. Этим же шпателем или петлей осуществляют посев во вторую, третью и т.д. чашки. Как правило, в первой чашке после культивирования посева появляется рост микробов в виде сплошного налета, в последующих чашках содержание микроорганизмов снижается и образуются изолированные колонии, из которых отсевом можно легко выделить чистую культуру.

Таким образом, в первых секторах получается сплошной рост, а вдоль последующих штрихов вырастут обособленные колонии, представляющие собой потомство одной клетки.

В целях экономии сред и посуды можно пользоваться одной чашкой, разделив ее на сектора, и последовательно засевать их штрихом (метод истощающего штриха).

Для этого материал берут петлей и проводят ею ряд параллельных штрихов сначала по поверхности первого сектора, а затем последовательно оставшимися на петле клетками засевают все другие сектора.

При каждом последующем штрихе происходит уменьшение количества засеваемых клеток.

Метод выделения чистых культур с помощью химических веществ используется при изолировании культур микроорганизмов, устойчивых к определенным химическим веществам.

Например, с помощью этого метода можно выделить чистую культуру туберкулезных микобактерий, устойчивых к действию кислот, щелочей и спирта. В этом случае исследуемый материал перед посевом заливают 15 % раствором кислоты или антиформином и выдерживают в термостате в течение 3…4 часов.

После воздействия кислоты или щелочи клетки туберкулезной палочки остаются живыми, а все другие микроорганизмы, содержащиеся в исследуемом материале, погибают. После нейтрализации кислоты или щелочи обработанный материал высевают на плотную среду и получают изолированные колонии возбудителя туберкулеза.

Биологические методы выделения чистых культур патогенных микроорганизмов основаны на заражении исследуемым материалом лабораторных животных, восприимчивых к данному виду возбудителя.

Если патогенный микроорганизм содержится в исследуемом объекте, то лабораторное животное заболевает и погибает. После вскрытия павшего животного из внутренних органов делают посевы на специальные среды, на которых вырастают чистые культуры выделяемых микробов.

Выделение чистой культуры бактерий

Чистой называют культуру, содержащую микроорганизмы одного вида и полученную как потомство одной клетки. Чистые культуры можно получить из исходной микробной клетки, изолиро­ванной при помощи микроманипулятора, или из изолированных колоний путем их пересева в отдельные пробирки с питательной средой.

Для выделения чистой культуры используют следующие методы.

1. Метод Дригалъского.При этом методе расплавленную питательную среду разливают в 3 чашки Петри. В первую чашку вносят одну каплю исследуемого материала и сте­рильным шпателем распределяют его по поверхности питательной среды. Затем шпатель переносят во вторую и далее в третью чашки, втирая в поверхность питательных сред оставшийся на нем материал.

При посеве этим методом на второй и на третьей чашках вырастают изолированные колонии. Полученные отдельные колонии пересевают в пробирки с питательной средой для получения чистой культуры микроорганизма.

2. Метод параллельных штрихов.При этом способе материал с помощью бактериологической петли распределяют по поверхности агара параллельными штрихами в одном направлении.

Затем, повернув чашку на 90°, проводят штрихи в направлении, перпендикулярном первым штрихам. При таком способе посева материал, находящийся в петле, расходу­ется постепенно, и по линиям штрихов, нанесенных в конце посева, вырастают изолированные колонии микробов.

3. Метод Коха (метод рассева в глубине среды).При этом методе в пробирку с агаром, расплавленным и остуженным до 43-45°С, вносят одну бактериологическую петлю исследуемого материала и тщательно перемешивают.

После этого из этой пробирки одну петлю материала переносят во вторую пробирку, а затем из нее – в третью пробирку. Приготовленные разведения бактерий выливают из пробирок в стериль­ные чашки Петри. После застывания среды чашки помещают в термостат. Количество колоний в чашках с питательной средой уменьшается по мере разведения материала.

Контрольные вопросы по теме занятия:

1. Характер роста бактерий в жидких, на полужидких и плотных питательных средах.

2. Характеристика колоний микроорганизмов.

3. Пигменты бактерий и их роль для микроорганизмов.

4. методы выделения чистых культур бактерий.

Литература для подготовки к занятию:

Основная литература:

1. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. Под ред. А.А.Воробьева. М., 2004.

Дополнительная литература:

1. Л.Б. Борисов. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. М., 2002.

2. О.К. Поздеев. Медицинская микробиология.М., ГЭОТАР-МЕДИА, 2005.

3. Медицинская микробиология. Справочник. Под ред. В.И. Покровского и О.К. Поздеева. М., ГЭОТАР-МЕД, 1998.

ЗАНЯТИЕ 5

ТЕМА ЗАНЯТИЯ: Ферменты бактерий. Изучение ферментативной активности микроорганизмов. Дыхание бактерий. Методы культивирования и выделения чистой культуры анаэробов.

УЧЕБНАЯ ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ: Ознакомиться с ферментами бактерий.

Изучить методы определения ферментативной активности микроорганизмов. Ознакомиться с процессами дыхания бактерий. Изучить методы культивирования и выделения чистой культуры анаэробов.

ЗАДАЧИ ЗАНЯТИЯ:

1. Ознакомиться с ферментами бактерий.

2. Изучить методы определения ферментативной активности микроорганизмов.

3. Ознакомиться с процессами дыхания бактерий.

4. Изучить методы культивирования и выделения чистой культуры анаэробов.

Ферменты бактерий

Все биохимические процессы в клетке микро­организмов, связанные с метаболизмом, ростом и размножением, совершаются при участии ферментов (энзимов).

Ферменты синтезируются самой микробной клеткой, и имеют сложное строение. Они представляют собой либо только белок с высокой молекулярной массой (трипсин, пепсин и др.), либо состоят из белка (апофермента), связанного с кофактором (коферментом). Кофермент может быть низкомолекулярным неорганическим (металл) или органическим ве­ществом.

Классификация ферментов основана на типах реакций, которые они катализируют.

Все ферменты делятся на шесть классов:

1). Оксидоредуктазы — ферменты переноса электронов. Эти ферменты катализируют окис­лительно-восстановительные реакции. К ним отно­сятся дегидрогеназы (НАД, НАДФ, ФАД), каталаза, цитохромы.

2).Трансферазы — ферменты переноса групп между молекулами от одних соединений к другим. К ним относятся ацетилтрансфераза, фосфотрансфераза, аминотрансфераза.

3). Гидролазы — ферменты переноса функциональных групп с участием воды. К этому классу ферментов относятся пептидгидролазы, глюкозидаза, амилазы, эстеразы, липаза, фосфатаза.

4). Лиазы — ферменты, отщепляющие или присоединяющие без участия воды различные соединения с двойной связью.

К этим ферментам относятся пируватдекарбоксилаза, альдолаза.

5). Изомеразы — ферменты, переносящие группы внутри молекул с образованием изомерных форм. К этим ферментам относятся триизофосфатизомераза, глюкозофосфатизомераза.

6). Лигазы (синтетазы) — ферменты, объединяющие две молекулы с одновременным разрывом фосфатных связей с использованием энергии АТФ. К лигазам относятся ферменты, катализирующие синтез сложных органических веществ из простых соединений (аспарагинсинтетаза, кокарбоксилазы).

Активность ферментов измеряют в международных еди­ницах (ME). 1 ME соответствует количеству ферментов, пре­вращающему один микромоль субстрата в 1 минуту в стандарт­ных условиях.

У бактерий различают эндоферменты и экзоферменты.

Эндоферменты находятся внутри бактериальной клетки, катализиру­ют внутриклеточные процессы обмена веществ. Экзоферменты выделяются во вне­шнюю среду и выполняют функцию расщепления сложных питательных веществ.

Ферменты агрессии. У патогенных бактерий имеется особая группа экзоферментов, которые называются ферментами агрессии. Они выполняют функции облегчения проникновения и распространения бактерий в тканях организма хозяина и ослабления его защитных свойств.

К ферментам агрессии относятся: гиалуронидаза, нейраминидаза, коллагеназа, протеазы, фибринолизин, гемолизин, лейкоцидин.

Конститутивные и индуцибельные ферменты. Ферменты, которые синтезируются клеткой с постоянной скоростью, независимо от наличия субстрата в среде называются конститутивными. Индуцибельные (адаптивные) ферменты образуются только в присутствии соответствующего субстрата в сре­де.

Например, фермент бета-галактозидазаначинает синтезироваться только при добавлении в питательную среду углевода лактозы, которую этот фермент расщепляет с образованием глюкозы и галактозы.

Методы определения ферментативной активности микробов

Обязательным условием идентификации выделенной чистой культуры бактерий является определение ферментативной активности в отношении углеводов и белков (биохимический «паспорт» вида).

Для выявления ферментов, расщепляющих углеводы (сахаролитические ферменты) используют дифференциально-диагностические среды Гисса.

В состав сред Гисса входит пептонная вода, индикатор рН, поплавок для улавливания газа и один из углеводов (глюкоза, лактоза, мальтоза, маннит, сахароза, крахмал и т.д.). Если бактерии расщепляют углевод, то образуется кислота и при этом меняется цвет среды за счет находящегося в ней индикатора рН. Большинство патогенных бактерий расщепляют углеводы с образованием только кислоты; некоторые виды ферментируют углеводы с образование кислоты и газа (СО2).

При этом меняется цвет среды и в поплавке появляется пузырек газа.

Протеолитическая активность бактерий. Показателями глубокого расщепления белка является образование индола, аммиака, сероводорода. Для выявления этих газообразных веществ делают посевы чистой культуры бактерий на мясо-пептонный бульон или пептонную воду в пробирки со специальными бумажными индикаторами.

При наличии продуктов расщепления меняется цвет соответствующего индикатора.

Протеолитическую активность бактерий определяют также путем посева чистой культуры уколом в столбик желатина по наличию и характеру разжижения среды, например, в виде перевернутой елочки, гвоздя, воронки и т.д.

Энергетический метаболизм

Это совокупность биохимических реакций, результатом которых является образование (накопление энергии) и расщепление (расход энергии) макроэргических связей в молекулах АТФ.

У бактерий АТФ может синтезироваться в результате процессов брожения и дыхания.

Брожение. Более древний, низкоэффективный способ получения энергии, при котором в результате расщепления молекулы глюкозы образуется 2 молекулы АТФ. Конечными продуктами брожения являются СО2, вода, спирты и органические кислоты.

Процесс происходит без участия кислорода.

Дыханием называют процесс окислительного фосфорилирования углеводов с образованием молекул АТФ, СО2 и воды. При распаде одной молекулы глюкозы высвобождаются 12 электронов, которые проходят через цепь дыхательных ферментов, отдавая энергию для синтеза 36 молекул АТФ. Освобождение дыхательной цепи от электронов осуществляют вещества, называемые акцепторами электронов.

К таким веществам относится кислород, сульфаты, нитраты, карбонаты. Если конечным акцептором электронов служит мо­лекулярный кислород, дыхание называют аэробным. В случае конечной акцепции электронов другими соединениями дыхание называют анаэробным.

По типу дыхания бактерии классифицируют на че­тыре основные группы:

1. Облигатные (строгие) аэробырастут при свободном доступе кислорода (возбудитель ту­беркулеза).

Микроаэрофилы растут при низкой (до 1%) концентрации кислорода и повышенной концентрации углекислого газа (гемофильная палочка).

Факультативные анаэробы могут расти как в присутствии кислорода, так и в анаэробных условиях (кишечная палочка).

4. Облигатные (строгие) анаэробы могут расти только при пол­ном отсутствии кислорода в окружающей среде (возбудители столбняка, ботулизма, газовой гангрены).

Выделение чистых культур микроорганизмов

Чистой культурой называют такую культуру, которая содержит микроорганизмы одного вида. Выделение чистых культур бактерий – обязательный этап бактериологического исследования в лабораторной диагностике инфекционных болезней, в изучении микробной загрязненности различных объектов окружающей среды, и, в целом, при любой работе с микроорганизмами.

Исследуемый материал (гной, мокрота, фекалии, кровь и другой материал от больных; вода, почва, воздух, пищевые продукты, трупы животных и человека, переносчики) обычно содержит ассоциации микробов.

Выделение чистой культуры позволяет изучить морфологические, культуральные, биохимические, антигенные и другие признаки, по совокупности которых определяется видовая и типовая принадлежность возбудителя, то есть производится его идентификация.

Для выделения чистых культур микроорганизмов используют методы, которые можно разделить на несколько групп.

Метод Пастера – последовательное разведение исследуемого материала в жидкой питательной среде до концентрации одной клетки в объеме (имеет историческое значение).

2. Метод Коха («пластинчатые разводки») – последовательное разведение исследуемого материала в расплавленном агаре (температура 48-500С), с последующим разливом в чашки Петри, где агар застывает.

Высевы делают, как правило, из трех-четырех последних разведений, где бактерий становится мало и, в дальнейшем, при росте на чашках Петри появляются изолированные колонии, образующиеся из одной исходной материнской клетки. Из изолированных колоний в глубине агара получают чистую культуру бактерий пересевом на свежие среды.

Метод Шукевича – применяется для получения чистой культуры протея и других микроорганизмов обладающих «ползущим» ростом. Посев исследуемого материала производят в конденсационную воду у основания скошенного агара. Подвижные микробы (протей) способны подниматься вверх по скошенному агару, неподвижные формы остаются расти внизу на месте посева.

Пересевая верхние края культуры можно получить чистую культуру.

4. Метод Дригальского – широко применяется в бактериологической практике, при этом исследуемый материал разводят в пробирке стерильным физиологическим раствором или бульоном.

Одну каплю материала вносят в первую чашку и стерильным стеклянным шпателем распределяют по поверхности среды. Затем этим же шпателем (не прожигая его в пламени горелки) делают такой же посев во второй и третьей чашках. С каждым посевом бактерий на шпателе остается все меньше и меньше и, при посеве на третью чашку, бактерии будут распределяться по поверхности питательной среды отдельно друг от друга.

Через 1-7 сут выдерживания чашек в термостате (в зависимости от скорости роста микроорганизмов) на третьей чашке каждая бактерия дает клон клеток, образуя изолированную колонию, которую пересевают на скошенный агар с целью накопления чистой культуры.

5. Метод Вейнберга. Особые трудности возникают при выделении чистых культур облигатных анаэробов.

Если контакт с молекулярным кислородом не вызывает сразу же гибели клеток, то посев производят по методу Дригальского, но после этого чашки сразу помещают в анаэростат. Однако чаще пользуются методом разведения. Сущность его заключается в том, что разведения исследуемого материала проводят в расплавленной и охлажденной до 45-500С агаризированной питательной среде. Делают 6-10 последовательных разведений, затем среду в пробирках быстро охлаждают и заливают поверхность слоем смеси парафина и вазелинового масла, чтобы помешать проникновению воздуха в толщу питательной среды.

Иногда питательную среду после посева и перемешивания переносят в стерильные трубки Бурри или капиллярные пипетки Пастера, концы которых запаивают. При удачном разведении в пробирках, трубках Бурри, пипетках Пастера вырастают изолированные колонии анаэробов.

Чтобы изолированные колонии хорошо были видны, используют осветленные питательные среды. Для извлечения изолированных колоний анаэробов, пробирку слегка нагревают, вращая ее над пламенем, при этом агар, прилегающий к стенкам, плавится и содержимое пробирки в виде агарового столбика выскальзывает в стерильную чашку Петри.

Столбик агара разрезают стерильным пинцетом и извлекают колонии петлей. Извлеченные колонии помещают в жидкую среду, благоприятную для развития выделяемых микроорганизмов (например, среду Китта-Тароцци). Агаризированную среду из трубки Бурри выдувают, пропуская газ через ватную пробку.

6. Метод Хангейта – когда хотят получить изолированные колонии бактерий с особенно высокой чувствительностью к кислороду (строгие аэробы) используют метод вращающихся пробирок Хангейта.

Для этого расплавленную агаризированную среду засевают бактериями при постоянном токе через пробирку инертного газа, освобожденного от примеси кислорода. Затем пробирку закрывают резиновой пробкой и помещают горизонтально в зажим, вращающий пробирку, среда при этом равномерно распределяется по стенкам пробирки и застывает тонким слоем. Применение тонкого слоя в пробирке, заполненной газовой смесью, позволяет получить изолированные колонии, хорошо видимые невооруженным глазом.

Выделение отдельных клеток с помощью микроманипулятора. Микроманипулятор – прибор, позволяющий с помощью специальной микропипетки или микропетли извлекать одну клетку из суспензии. Эту операцию контролируют под микроскопом. На предметном столике микроскопа устанавливают влажную камеру, в которую помещают препарат «висячая капля».

В держателях операционных штативов закрепляют микропипетки (микропетли), перемещение которых в поле зрения микроскопа осуществляется с микронной точностью благодаря системе винтов и рычагов.

Исследователь, глядя в микроскоп, извлекает отдельные клетки микропипетками и переносит их в пробирки со стерильной жидкой средой для получения клона клеток.

Методы выделения чистых культур аэробных бактерий

Механического разобщения Биологические

Метод Пастера Метод Коха Биологический Физический

значение) разводок) Химический Метод Щукевича

Посев петлей Посев шпателем

(Метод Дригальского)

Методы выделения чистых культур (схема 11):

Методы механического разобщения основаны на разъединении микробов путем последовательного растирания исследуемого материа­ла по поверхности агара.

а) Метод Пастера – имеет историческое значение, предусматривает последовательное разведение исследуемого материала в жидкой питательной среде методом переката

б) Метод Коха – метод пластинчатых разводок – основан на последовательном разведении исследуемого материала мясо-пептонным агаром с последующей разливкой пробирок с разведенным материалом в чашки Петри

в) Метод Дригальского – при посеве материала, обильно обсемененного микрофлорой, используют 2–3 чашки для последовательного посева шпателем.

г) Посев петлей параллельными штрихами.

Биологические методы основаны на биологических свойствах возбудителей.

а) Биологический – заражение высокочувствительных животных, где микробы быстро размножаются и накапливаются.

В одних случаях, этот метод является единственным, позволяющим вы­делить культуру возбудителя от больного человека (например, при туляремии),в других случаях – он более чувствителен (например, выделение пневмококка на белых мышах или воз­будителя туберкулеза на морских свинках).

б) Химический – основан на кислотоустойчивости микобактерий. Для освобождения материала от сопутствующей флоры, его
обрабатывают раствором кислоты.

Вырастут только туберкулезные палочки, так как кислотоподатливые микробы погибли под действием кислоты.

в) Физический метод основан на устойчивости спор к нагреванию. Для выделения культуры спорообразующих бактерий из
смеси материал прогревают при 80°С и засевают на питательную среду. Вырастут только споровые бактерии, так как споры их остались живыми и дали рост.

г) Метод Щукевича – основан на высокой подвижности вуль­гарного протея, способного давать ползучий рост.

Методика пересева из колоний на скошенный агар и МПБ:

а) Пересев из колоний на скошенный агар

Приоткрывают крышку чашки, прокаленной остуженной петлей снимают часть отдельной колонии, открывают пробирку со стерильным скошенным агаром, держа ее в левой руке в наклонном положении, так, чтобы можно было наблюдать поверхность среды.

Переносят петлю с культурой в пробирку, не прикасаясь к стенкам, растирают по питательной среде, скользя по поверхности от одного края пробирки к другому, поднимая штрихи до верхушки среды – посев штрихом. Пробирку закрывают и, не выпуская из рук, подписывают название посеянного микроба и дату посева.

б) Пересев из колонии на мясо-пептонный бульон

Техника пересева на МПБ в основном такая же, как и при посеве на плотную среду.

При посеве на МПБ петлю с находящимся на ней материалом погружают в среду. Если материал вязкий и с петли не снимается, его растирают на стенке сосуда, а затем смывают жидкой средой. Жидкий материал, набираемый стерильной пастеровской или градуированной пипеткой, вливают в питательную среду.

В результате самостоятельной работы студент должен знать:

1.Методы выделения чистой культуры микроорганизмов

2. Методы культивирования микроорганизмов

Уметь:

1. Навыки соблюдения правил противоэпидемического режима и техники безопасности

2. Обеззараживать материал, проводить обработку рук

3. Приготовить препараты из колоний бактерий

4. Микроскопировать колоний

5. Окрашивать по Граму микроорганизмы

ТЕХНИКА ПОСЕВА, МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР И КУЛЬТУРАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА МИКРООРГАНИЗМОВ. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА БАКТЕРИЙ

Цель занятия. Освоить технику посева микроорганизмов на плотные и жидкие питательные среды и методы выделения чис­тых бактериальных культур. Ознакомить студентов с основными культуральными характеристиками микроорганизмов и методами определения количества бактерий.

Оборудование и материалы. Бульонные и агаровые культуры В. cereus, Е. coli и S. aureus в пробирках и в чашках Петри, сме­шанная бульонная культура Е. соli и S. aureus, стерильные МПА и МПБ в пробирках, чашках Петри, солевой МПА (8 % хлорида натрия) в чашках Петри, стеклянные шпатели, стерильные пи­петки Пастера, бактериологические петли.

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

Культура микроорганизмов — это популяция (расплодка) кле­ток на питательной среде. Посев и пересев культур микроорга­низмов на питательные среды — наиболее частый методический прием, который используют для первичного выделения микро­организма из какого-либо объекта, а также для поддержания культур в жизнеспособном состоянии в лабораторных условиях.

Чистая культура — это популяция бактерий одного вида или биологического варианта (биовара), выращенная на питательной среде.

Штаммы — чистые культуры микроорганизмов одного вида, выделенные из разных объектов или из одного и того же объекта, но в разное время.

Колония — макроскопически видимое скопление клеток мик­роорганизма на поверхности или внутри плотной питательной среды, образовавшихся в результате размножения одной жизне­способной клетки. По этой причине колонию обычно рассматри­вают как чистую культуру микроорганизма.

Техника посева микроорганизмов. Посевы из нативного мате­риала чаще проводят пастеровской пипеткой, из культур микро­организмов—бактериологической петлей в зоне стерильного воздуха над пламенем горелки. На культуральных сосудах (про­бирки, чашки Петри, колбы и т.д.) пишут номер экспертизы, под которым зарегистрирован материал, дату посева.

Посев на жидкую питательную среду. Пробирку с исследуемым материалом и пробирку с питательной средой держат в левой руке, в правую руку берут бактериологическую петлю или пипет­ку и'пробки от пробирок (рис. 37). Над пламенем горелки обжи­гают края пробирок, бактериологическую петлю (пипетку) вводят в пробирку с материалом, переносят материал в пробирку со сте­рильной питательной средой и стряхивают с петли в среду, не смачивая при этом петледержатель. Края пробирок вновь прово­дят над пламенем горелки, закрывают пробирки пробками, сте­рилизуют петлю и ставят ее в штатив. Использованную пипетку опускают концом вниз в банку с дезинфицирующим раствором.

Посев на плотную питательную среду. Выполняют разными способами.

При посеве в пробирку: 1) пробирки с засеваемой мик­робной культурой и питательной средой (МПА) берут в левую руку, пробирку с МПА держат скошенной поверхностью среды вверх. В открытую у пламени пробирку с микробной культурой (или другим материалом) вводят простерилизованную бактерио­логическую петлю, слегка прикасаясь петлей к поверхности сре­ды (материала), берут материал, переносят его в пробирку со сте­рильной питательной средой. Петлю опускают до дна пробирки, погружают в конденсационную жидкость и зигзагообразным движением проводят снизу вверх по поверхности среды (посев «штрихом») (рис. 38). Пробирки закрывают пробками, петлю прожигают. Пробирки с посевами ставят в термостат; 2) при по­севе уколом в столбик среды пробирку с плотной (нескошенной) средой берут в левую руку, над пламенем горелки извлекают из пробирки пробку, петлей с материалом прокалывают вертикаль­но по центру пробирки питательную среду, петлю вынимают, прожигают, пробирку с засеянной средой закрывают пробкой (рис. 39).

При посеве на чашку Петри: чашку берут в левую руку, большим пальцем левой руки слегка приподнимают крышку, об­жигают на пламени горелки края чашки в зоне щели, вносят по­севной материал на поверхность питательной среды, затем рас­тирают его при помощи стеклянного шпателя или бактериологи­ческой петли (рис. 40).

Посев на полужидкую питательную среду. Выполняют методом укола в столбик питательной среды.

Выделение чистых культур микроорганизмов. При бактериоло­гическом исследовании искомый микроорганизм обнаруживают в материале, как правило, в смеси с бактериями других видов. Классическими методами бактериологии возможно идентифици­ровать микроорганизм только при условии, что он находится в виде чистой культуры.

Методы, основанные на механическом разобщении клеток. Эти методы наиболее часто применяют при выделении чистых куль­тур микроорганизмов.

Метод Пастера (метод разведений): из исследуемого материала готовят ряд последовательных, чаще десятикратных разведений на стерильной жидкой питательной среде в пробир­ках или колбах (10^-1…10^-10). Предполагают, что количество мик­робных клеток в каждом последующем разведении будет меньше, чем в предыдущем, и в какой-то из пробирок останется только одна микробная клетка, которая и даст/начало чистой культуре Микроорганизма. Однако для успешного применения этого мето­да необходимо, чтобы искомый микроорганизм в материале ко­личественно преобладал над сопутствующими видами.

Метод Коха (метод заливок): исследуемый материал в небольшом количестве вносят в пробирку с расплавленным и ох­лажденным до 45...50 "С МПА, перемешивают, затем каплю пи­тательной среды переносят во вторую пробирку с расплавленным МПА и т. д. Количество разведений зависит от предполагаемой численности микроорганизмов в исследуемом материале. Затем содержимое каждой пробирки выливают в стерильные чашки Петри, после затвердения среды посевы помещают в термостат. Фиксированные в плотной среде микробные клетки при размно­жении формируют колонии, из которых можно отвить (пересе­ять) чистую культуру микроорганизма.

Метод Дригальского: берут три—пять чашек Петри с плотной питательной средой. В одну из чашек вносят посевной материал и распределяют его шпателем по поверхности пита­тельной среды. Не обжигая шпатель, оставшийся на нем матери­ал последовательно растирают на поверхности среды во второй, третьей и остальных чашках. В последних чашках Петри после инкубирования в термостате обычно наблюдают формирование изолированных колоний бактерий.

Более экономичен следующий способ получения изолированных колоний. Бактериологичес­кой петлей с посевным матери­алом несколько раз делают па­раллельные штрихи в одном секторе чашки Петри с пита­тельным агаром (рис. 41). Пет- о лю прожигают в пламени горел­ки, дают остыть и часть матери­ала из первого сектора {А) ана­логичным образом распре­деляют во втором секторе (В), затем в третьем (С) и четвертом (Д) секторах. Даже при рассеве бактериальной массы из коло­ний в секторе Д при таком спо­собе получают рост изолирован­ных колоний.

Методы, основанные на био­логических особенностях микроорганизмов.Направлены на подав­ление роста сопутствующей микрофлоры.

Прогревание: при выделении чистой культуры споро-образующего вида бактерий исследуемый материал прогревают при 80 °С 20 мин или кратковременно кипятят. Вегетативные клетки сопутствующей микрофлоры в этих условиях погибают, а споры искомого микроорганизма сохраняют жизнеспособность и прорастают после посева на питательные среды.

Использование селективных питатель­ных сред, которые содержат вещества, подавляющие рост сопутствующей микрофлоры (антибиотики, красители и т. д.), — частый прием при исследовании контаминированного материа­ла. Однако необходимо учитывать, что селективные факторы ча­сто находятся не в бактерицидных, а в бактериостатических кон­центрациях, поэтому клетки сопутствующих микроорганизмов не растут, но остаются жизнеспособными на поверхности пита­тельной среды и при отвивке колоний исследуемой культуры на обычные среды могут быть причиной получения смешанной культуры.

Биопроба — заражение чувствительных лабораторных животных — метод, с помощью которого не только выделяют возбудитель из патологического материала, но также изучают вирулентность чистой культуры. Организм животного с его за­щитными факторами служит биологическим «фильтром», кото­рый уничтожает сопутствующую непатогенную микрофлору, но не способен подавить размножение вирулентных бактерий, что позволяет достаточно легко выделить возбудитель в чистой культуре из тканей погибшего или убитого с диагностической целью животного.

При выделении чистых культур некоторых видов бактерий ис­пользуют их другие биологические особенности. Например, спо­собность микроорганизма расти при низких (листерии) или высо­ких (термофильные бактерии) температурах, которые лежат за пределами температурных диапазонов сопутствующих видов бак­терий. Для выделения культуры P. vulgaris используют способность данного вида давать ползучий рост (роение) на поверхности плот­ной питательной среды. С этой целью материал, содержащий P. vulgaris, засевают в конденсационную воду на дне пробирки со скошенным МПА, не касаясь поверхности среды. Сопутствующая микрофлора растет в нижней части питательной среды, а протей в виде прозрачной пленки распространяется вверХ.

Для выделения С. tetani материал засевают точечно на плот­ную питательную среду в чашках Петри и после выращивания отвивают культуру с периферии ползучего роста.

Культуральные свойства микроорганизмов. В процессе иденти­фикации наряду с другими свойствами у микроорганизмов изу­чают культуральные признаки — особенности роста на плотных, жидких и полужидких питательных средах при определенных ус­ловиях.

На плотных средах изучают колонии микроорганизмов. Бакте­рии каждого вида формируют колонии с определенными призна­ками, которые обычно учитывают при идентификации. Раз­мер колоний: крупные — диаметром 4...6 мм и более, сред­ние—2...4 мм, мелкие — 1...2мм и точечные колонии диаметром менее 1 мм. Форма колоний может быть правильной круг­лой, неправильной (амебовидной, розеткообразной), корневид­ной (рис. 42). Цвет зависит от способности микроорганизма образовывать пигмент: белый, желтый, красный, сине-зеленый и т. д. Бактерии, не синтезирующие пигмент, формируют бесцвет­ные колонии. Учитывают характер поверхности, ко­торая может быть шероховатой, блестящей, матовой, сухой, влажной, гладкой, радиально или концентрически исчерченной. Края колонии могут быть ровными, волнистыми, зазубренны­ми, бахромчатыми, их исследуют невооруженным глазом и под малым увеличением микроскопа (рис. 43). Рельеф (про­филь) определяют, рассматривая колонию сбоку; различают плоские, конусообразные, куполообразные, плоские с конусо­видным центром или углублением в центре колонии, с утолщен­ными (валикообразными) краями (рис. 44). Учитывают про­зрачность колонии: непрозрачная, полупрозрачная, про­зрачная. Структура может быть однородной, зернистой, волокнистой и т.д. (рис. 45). Ее выявляют при слабом увеличе­нии микроскопа. Консистенция может быть пастообраз­ной, слизистой, плотной (сухой) и т.д.; ее определяют, дотраги­ваясь до колонии бактериологической петлей. Колонии некото­рых видов врастают в толщу питательной среды, что также определяют при помощи бактериологической петли. Запах: многие виды бактерий в процессе роста на питательных средах выделяют специфические ароматические вещества.

Ценную дополнительную информацию об особенностях стро­ения колоний дает их изучение в косопадающем пучке света (рис. 46). Культуры на прозрачной агаровой среде в чашках Пет­ри помещают на предметный столик бинокулярной лупы. Между бинокулярной лупой и источником света помещают зеркало от микроскопа вогнутой стороной вверх таким образом, чтобы лучи, отраженные от него, попадали в плоскость изучаемого объекта под углом 40...45°. Зеркало устанавливают на равном уда

В жидких средах учитывают следующие признаки: степень помутнения среды (интенсивное, среднее, слабое), на­личие или отсутствие пристеночного кольца на гра­нице мениска и внутренней поверхности пробирки, харак­тер поверхностной пленки (толщина, цвет, поверхность), характер осадка (обильный, скудный, ком­пактный, хлопьевидный, слизистый). При характеристике осадка пробирку слегка встряхивают и учитывают результат: осадок раз­бивается в гомогенную равномерную суспензию; образуются мелкие или крупные хлопья, глыбки; слизистый осадок при встряхивании обычно поднимается в виде косички. Пигментообразующие микроорганизмы вызывают окрашивание питательной среды и осадка (желтое, зеленоватое, красное и т. д.).

Определение количества бактерий. При характеристике разви­тия микробной популяции, санитарной оценке кормов, продук­тов питания, при вычислении показателя вирулентности микро­организма необходимо устанавливать количество микробных клеток в единице объема того или иного материала.

Определение общего количества микроорганизмов. Можно при­менять метод прямого счета и метод измерения светорассеяния.

Метод прямого счета: бактерии подсчитывают в камерах Горяева, Тома или в окрашенных мазках. В последнем случае 0,01 мл бактериальной суспензии микропипеткой нано­сят на предметное стекло и равномерно распределяют на 1 см2. Мазок фиксируют, окрашивают и подсчитывают клетки в 10... 15 полях зрения по диагонали квадрата. Определяют сред­нее число клеток в одном поле зрения. Делят 1 см² на площадь поля зрения, которую измеряют методом микрометрии (см. тему 1), затем частное умножают на среднее число микробных клеток в поле зрения, получают их количество в 0,01 мл взвеси бактерий.

Метод измерения светорассеяния считают более точным. Количество света, рассеиваемого суспензией бак­терий, пропорционально их концентрации. Этот показатель дос­таточно точно можно измерить при помощи фотоэлектроколориметра. Зависимость между оптической плотностью и концентра­цией клеток различна для бактерий разных видов. Поэтому при работе с таким прибором для каждого вида бактерий необходимо строить свою калибровочную кривую зависимости.

На практике широко используют простой субъективный ме­тод, основанный на визуальном сравнении мутности исследуе­мой бактериальной суспензии с так называемым «стандартом мутности», выпускаемым Государственным научно-исследова­тельским институтом стандартизации и контроля биологических препаратов им. Л. А. Тарасевича. Стандарт представляет собой взвешенные в воде частицы стекла «Пирекс» и состоит из трех запаянных пробирок-эталонов (5, 10 и 20 международных еди­ниц). Мутность стандарта на 10 ед. соответствует следующим кон­центрациям: для бактерий кишечной группы — 0,93*10⁹ кл/мл; коклюшной группы — 11 • 10⁹ кл/мл; для бруцеллезных бакте­рий — 1,7 • 10⁹ кл/мл; туляремийных микробов — 5 • 10⁹ кл/мл.

Мерной пипеткой вносят 0,1...0,5 мл исследуемой бактериаль­ной суспензии в пустую пробирку, соответствующую по диамет­ру и толщине стенок пробирке «стандарта мутности». К суспен­зии добавляют физиологический раствор до оптической плотнос­ти стандарта на 10 ед. Физиологический раствор вносят неболь­шими мерными порциями, записывая его количество и сравнивая мутность опытной и стандартной пробирок невоору­женным глазом на фоне специальной шрифтовой таблицы. Зная, во сколько раз развели исследуемую бактериальную суспензию, чтобы уравнять ее оптическую плотность со стандартом, можно рассчитать содержание микробных клеток в 1 мл исходной сус­пензии.

Например, в пробирку поместили 0,1 мл суспензии бактерий, содержащей неизвестное количество клеток. Для уравнивания оптической плотности исследуемой суспензии со стандартом мутности 10 ед. в пробирку добавили 0,9 мл физиологического раствора, т. е. исходную суспензию развели в 10 раз. Известно, что суспензия данного вида бактерий при оптической плотности 10 ед. содержит 1,3*10⁹ кл/мл. Следовательно, концентрация ис­следуемой суспензии составляет 1,3*10¹⁰ кл/мл.

При работе с бактериями, для которых нет данных о содержа­нии микробных клеток в 1 мл относительно «стандарта мутнос­ти», необходимо предварительно методом прямого счета опреде­лить их количество в суспензии, например, оптической плотнос­тью 10 ед.

Определение количества живых микроорганизмов. Метод осно­ван на выводе, что бактериальная колония — это результат деле­ния единичной клетки на плотной питательной среде (исключе­ние составляют бактерии, образующие цепочки из клеток).

Мерной пипеткой объемом 1 мл добавляют 1 мл культуры Е. coli в бактериологическую пробирку с 9 мл стерильного физио­логического раствора, подогретого до 37...38 °С (разведение 10-1). Далее аналогичным способом готовят разведения культуры от 10^-2 до 10^-8. Для каждого разведения используют новую пипетку того же объема и класса. Из пяти последних пробирок суспензию бактерий по 0,1 мл наносят на поверхность подсушенного МПА в две чашки Петри. Внесенный материал стерильным шпателем распределяют по поверхности питательной среды. Посевы инку­бируют при 37...38 ºС 24 ч.

Учет результатов: в чашках Петри, где выросло более 150...300 и менее 10 колоний, результаты не учитывают. Выбирают чашки Петри с параллельными посевами (из одного разведения), содер­жащими 10... 150 колоний. Подсчитывают колонии на чашках из одного разведения, суммируют, определяют среднее число коло­ний и с учетом степени разведения рассчитывают содержание жизнеспособных клеток (колониеобразующих единиц) в 1 мл исходной суспензии бактерий.

ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ

1. Провести пересев бульонной и агаровой культур бактерий на скошенный МПА и в МПБ в пробирках.

2. Провести посев смешанной бульонной культуры на МПА в чашках Петри по методу Дригальского.

3. Описать характер роста Е. coli, S. aureus, В. cereus на МПА (колонии) и в МПБ.

4. Определить количество микробных клеток в 1 мл бульонной культуры Е. coli методом прямого счета и при помощи стандарта мутности.

5. Провести посев бульонной культуры Е. coli на МПА в чаш­ках Петри с целью определения количества жизнеспособных клеток.

Контрольные вопросы

1.Что такое культура, смешанная культура, чистая культура, штамм и колония бактерий?

2.Какие методы применяют для получения чистых культур микроорганизмов?

3.Какие культуральные признаки учитывают при идентификации бактерий?

4.Какими методами определяют общее число микроорганизмов и количество жизнеспособных клеток?

Тема 9

БАКТЕРИАЛЬНАЯ КУЛЬТУРА — Большая Медицинская Энциклопедия

Бактериальная культура — совокупность бактерий, выросших на твердой или жидкой питательной среде.

Для получения бактериальной культуры достаточно внесения в питательную среду хотя бы одной микробной клетки, которая при оптимальных условиях за короткое время дает большое число поколений. Скорость размножения зависит от особенностей данного бактериального вида и от условий роста (питательная среда, pH, температура, аэрация и др.). Рост бактериальной культуры в жидкой питательной среде проявляется в помутнении среды, образовании осадка или поверхностной пленки. На плотной питательной среде бактерии образуют колонии (см. Колония бактериальная), которые имеют характерную морфологию и наряду с типом роста в жидкой питательной среде служат тестом для идентификации. При высеве большого числа бактерий на поверхность плотной питательной среды образуется сплошной рост культуры бактерий — газон. Если на питательной среде вырастают бактерии одного вида, культура считается чистой. Смесь двух или более видов бактерий носит название смешанной бактериальной культуры. В естественных условиях бактерии находятся в ассоциациях и при посеве на питательные среды вырастают в виде смешанных культур. Выделение чистых бактериальных культур требует применения специальных методов, основанных либо на механическом разобщении бактериальных клеток, которые затем выращиваются изолированно, либо на использовании биологических особенностей бактерий выделяемого вида, которые позволяют освободить их от сопутствующих бактерий. В чистой культуре проверяют видовую принадлежность бактерий с помощью системы тестов, включающей изучение морфологии и комплекса биологических свойств (см. Идентификация микробов). Выделение чистой бактериальной культуры и ее идентификация составляют основу бактериологического исследования (см. Бактериологические методики). После выделения и идентификации чистую бактериальную культуру называют штаммом (см.).

Бактериальная культура с различной степенью отклонений от свойств, характерных для данного вида, носят название атипичных. Отклонения могут касаться только одного свойства, часто важного в системе тестов, используемых для идентификации, или ряда свойств. В последнем случае идентификация стандартными методами затруднительна. Принципы идентификации атипичных бактериальных культур основаны на попытках их реверсии, а также на использовании дополнительных биохимических и биофизических методов исследования.

Бактериальные культуры, выращенные на различных питательных средах, носят соответствующие названия — агаровая культура, желатиновая, бульонная. Для получения агаровой бактериальной культуры применяют питательные среды, куда добавлен агар (см.) в концентрации, зависящей от целей исследования и вида микроорганизма. Для выращивания бактерий на поверхности твердой питательной среды применяют концентрации агар-агара 1—2%.

При концентрации 0,7% и ниже агар называют мягким или полужидким и используют для засева бактерий в глубину среды. Засев бактерий в питательную среду с желатиной применяется лишь со специальными целями, так как образуемый желатиной гель (10—15%) плавится при t° 25° и разжижается протеолитическими ферментами бактерий. Для многих исследований исходным материалом служит бульонная бактериальная культура, выращенная в течение ночи в термостате (примерно 16—18 часов). После разведения в свежей среде и подращивания легко получить бактериальную популяцию в любой фазе роста. При высокой концентрации клеток в быстрорастущей бактериальной культуре аэробов приходится прибегать к аэрации для пополнения содержания кислорода в среде (аэрированная бактериальная культура). Применяют либо встряхивание небольшого количества среды в сосуде относительно большого объема, либо пропускание через среду стерильного воздуха. Аэрация широко применяется в производственной практике при выращивании бактерий в реакторах больших объемов (глубинные бактериальные культуры).

Чистая бактериальная культура, растущая на питательной среде, представляет популяцию генетически идентичных особей. Тем не менее эти особи могут отличаться друг от друга по ряду физиологических признаков: по размерам, составу клеточной оболочки, возрасту и пр. Часть различий удается устранить при синхронизации деления бактерий. Принцип получения синхронных бактериальных культур состоит в остановке деления бактерий воздействием физических или химических факторов при сохранении физиологической активности. После устранения фактора, задерживающего деление, бактерии начинают делиться одновременно. Синхронность деления выявляется наиболее четко в течение первых 2—3 генераций.

Количественную оценку размножения бактерий в культуре проводят определением какой-либо величины, характеризующей интенсивность размножения. В зависимости от целей исследования такой величиной может служить общая масса бактерий либо число отдельных микроорганизмов в 1 мл культуры. При росте бактериальных культур масса и число бактерий изменяются независимо друг от друга, и в разные периоды роста отношение общей массы к числу бактерий колеблется. Характер процесса размножения бактериальных культур в конечном итоге определяется системой, в которой происходит размножение. В закрытой системе при ограниченном объеме среды (пробирка с бульоном) различают несколько последовательных фаз размножения, которые заканчиваются гибелью части популяции (см. Бактерии). В поточной культуре, напр, в открытой системе типа хемостата (см.), размножение бактерий непрерывно поддерживается подачей свежей среды и одновременным удалением части биомассы бактерий. Концентрация бактерий регулируется скоростью поступления свежей среды и зависит от концентрации одного или нескольких лимитирующих метаболитов.

Сохранение бактериальной культуры должно обеспечить постоянство состава бактериальной популяции в течение неограниченно долгого времени. Это достигается поддержанием жизнеспособности максимального числа бактерий, взятых для сохранения, так как при гибели значительной части популяции всегда существует возможность отбора вариантов. Исходную культуру рассевают на чашках для получения изолированных колоний. Убедившись в отсутствии загрязнения, отбирают для получения субкультур несколько десятков колоний. Это исключает, с одной стороны, возможность отбора мутантов из-за их редкости, с другой стороны, предупреждает отбор часто встречающихся вариантов немутационной природы, возможный при отсеве единичных колоний. При сохранении методом лиофильной сушки субкультуры колонии суспендируют в специальной многокомпонентной среде и подвергают быстрому испарению в комбинации с охлаждением и замораживанием. Лиофильная сушка (см. Лиофилизация) позволяет сохранить жизнеспособность существенной части популяции в течение ряда лет и исключает отбор.

Для сохранения бактериальной культуры на питательных средах используют засев на 0,6% питательный агар в столбике с добавлением сыворотки. При хранении ауксотрофов в среду следует добавлять необходимые факторы роста. Для предохранения от высыхания выросшие культуры заливают сверху стерильным вазелиновым маслом или запаивают пробирки и хранят их при t°—4°. Рекомендуется проводить пересевы культуры после проверки основных свойств не реже одного раза в 6 месяцев. Хранение на питательных средах при температуре выше 0° не исключает деления бактерий. Для некоторых видов бактерий необходимы более частые пересевы. Спорообразующие бактерии, напротив, могут храниться без обновления среды длительное время.

Бактериальные штаммы, используемые в производстве и научно-исследовательской работе, хранят в музеях живых культур при институтах и лабораториях соответствующих профилей. Организован обмен бактериальными штаммами между лабораториями различных стран.

Порядок хранения, обращения, отпуска и учета бактериальных культур патогенных Микроорганизмов установлен соответствующими инструкциями.

Библиогр.:

Мейнелл Д. и Мейнелл Э. Экспериментальная микробиология, пер. с англ., М., 1967, библиогр.;

Сборник методик по генетике микроорганизмов, под ред. Р. Клауса и У. Хейса, пер. с англ., М., 1970, библиогр.; Тимаков В. Д. и Гольдфарб Д. М. Основы экспериментальной медицинской бактериологии, М., 1958; Экспериментальная микробиология, под ред. С. Бырдарова, пер. с болг., София, 1965,библиогр.

С. С. Белокрысенко.

Методы выделения чистых культур микроорганизмов

Культивирование микроорганизмов, помимо состава питательной сре­ды, зависит от физических и химических факторов (температура, кислотность, аэрация, свет и т. д.). При этом количественные показатели каждого из них неодинаковы и определяются особенностями метаболиз­ма каждой группы бактерий. Существуют методы культивирования мик­роорганизмов на твердых и в жидких питательных средах в аэробных, анаэробных и других условиях.

Методы выделения чистых культур аэробных микроорганизмов. Для того, чтобы получить изолированные колонии, при нанесении материал распределяют так, чтобы клетки бактерий были удалены друг от друга. Для получения чистой культуры используют две основные группы методов:

а) мето­ды, основанные на принципе механического разделения микроорганизмов;

б) методы, основанные на биологиче­ских свойствах микроорганизмов.

Методы, основанные на принципе механического разде­ления микроорганизмов

Рассев шпателем по Дригальскому. Берут 3 чашки Петри с питательной средой. На 1-ю чашку петлей или пипеткой наносят кап­лю исследуемого материала и растирают шпателем по всей поверхности питательного агара. Затем шпатель пе­реносят во 2-ю чашку и втирают оставшуюся на шпателе культуру в поверхность питательной среды. Далее шпа­тель переносят в 3-ю чашку и аналогичным образом про­изводят посев. На 1-й чашке вырастает максимальное количество колоний, на 3-й — минимальное. В зависимо­сти от содержания микробных клеток в исследуемом ма­териале на одной из чашек вырастают отдельные коло­нии, пригодные для выделения чистой культуры микро­организма.

Метод Пастера (метод разведений). Из исследуемого материала готовят ряд последовательных, чаще десятикратных серийных разведений в жидкой стерильной среде или физиологическом растворе в пробирках. Далее высевают материал газоном по 0,5 мл из каждой пробирки. Предполагают, что в какой-то из пробирок останется количество микроорганизмов, поддающихся подсчету при высеве на пластинчатые среды. Этот метод дает возможность подсчитать микробное число в исследуемом материале. (Микробное число - количество колоний на последней чашке с ростом микроорганизмов, умноженное на степень разведения материала).

Рассев петлей (посев штрихами). Берут одну чашку Петри с питательным агаром и делят ее на 4 сектора, проводя разграничительные линии на внешней стороне дна чашки. Исследуемый ма­териал петлей вносят в первый сектор и проводят ею па­раллельные линии по всему сектору на расстоянии одна от другой около 5 мм. Этой же петлей, не изменяя ее положения по отношению к агару, проводят такие же линии на других секторах чашки. В том месте, где на агар попало большое количество микробных клеток, рост микроорганизмов будет в виде сплошного штриха. На секторах с небольшим количеством клеток вырастают отдельные колонии. Кроме того, можно наливать разведен­ные растворы смешанной культуры на поверхность твер­дых сред в чашках.

Метод фильтрации. Основан на пропускании исследуемого материала через специальные фильтры с определенным диаметром пор и разделении содержа­щихся микроорганизмов по величине. Этот метод при­меняется главным образом для очистки вирусов от бак­терий, а также при получении фагов и токсинов (в фильтрате - чистый фаг, очищенный токсин).

Методы, основанные на биологических свойствах мик­роорганизмов

Создание оптимальных условий для размножения

· Создание оптимального температурного режима для избирательного подавления размножения сопутствующей микрофлоры при низкой температуре и получения культур психрофильных или термофильных бактерий. Большинство микробов неплохо развиваются при 35-37°С, иерсинии хорошо растут при 22°С, лептоспиры культивируют при 30°С. Термофильные бактерии растут при температурах, лежащих за пределами температурных режимов прочих сопутствующих видов бактерий (так, кампилобактер культивируют при 42°С).

· Создание условий для аэробиоза или анаэробиоза. Большинство микроорганизмов хорошо растут в присутствии атмосферного кислорода. Облигатные анаэробы растут в условиях, исключающих присутствие атмосферного кислорода (возбудители столбняка, ботулизма, бифидумбактерии, бактероиды и др.). Микроаэрофильные микроорганизмы растут только при низком содержании кислорода и повышенном содержании СО₂ (кампилобактер, геликобактер).

· Метод обогащения. Исследуемый материал за­севают на элективные питательные среды, способствую­щие росту определенного вида микроорганизмов.

Читайте также:

Выделение чистых культур микроорганизмов.

Чистая культура микроорганизма- это популяция клеток одного вида, вы­росшая на стерильной питательной среде. Чистую культуру выделяют путем полу­чения потомства одной родительской клетки. Культура может расти в виде отдель­ных колоний на плотной питательной среде.

Методы выделения чистых культур аэробных микроорганизмов.

Все методы выделения чистых культур из микробных смесей можно разделить на 2 группы:

1. Методы, основанные на принципе механического разделения микроорганизмов;

2. Методы, основанные на биологических свойствах микроорганизмов.

Методы, основанные на принципах механического разделения микроорганизмов

Рассев шпателем по Дригальскому

Берут 3 чашки Петри с питательной средой. На первую чашку петлей или пи­петкой наносят каплю исследуемого материала и растирают шпателем по всей по­верхности агара. Затем шпатель переносят во вторую чашку и втирают оставшуюся на шпателе культуру в поверхность питательной среды. Далее шпатель переносят в третью чашку Петри и аналогичным образом производят посев. На первой чашке вырастает максимальное количество колоний (сплошной pocт) на третьей - мини­мальное в виде отдельно расположенных колоний.

Метод истощающего штриха

В целях экономии сред и посуды можно пользоваться одной чашкой, разделив её на 4 сектора и последовательно засеяв штрихом. Для этого материал берут пет­лёй и проводят ею на расстоянии 5 мм друг от друга ряд параллельных штрихов сна­чала по поверхности первого сектора, а затем последовательно оставшимися на пет­ле клетками засевают все другие секторы. При каждом последующем штрихе про­исходит уменьшение количества засеваемых клеток. После рассева чашки перевора­чивают вверх дном, чтобы конденсационная вода, образовавшаяся на крышке чашки Петри, не мешала получить изолированные колонии. Чашки выдерживают в термостате 1-7 суток, так как скорость роста различных микроорга­низмов неодинакова.

Таким образом, в первых секторах получается сплошной рост, а вдоль после­дующих штрихов вырастают обособленные колонии, представляющие собой потом­ство одной клетки.

Метод прогревания

Позволяет отделить спорообразующие бациллы от неспоровых форм. Прогре­вают исследуемый материал на водяной бане при 80°С 10-15 минут. При этом поги­бают вегетативные формы, а споры сохраняются и при посеве на соответствующую питательную среду прорастают, образуя колонии только спорообразующих бакте­рий.

Метод обогащения

Исследуемый материал засевают на элективные питательные среды, способст­вующие росту определенного вида микроорганизмов.

Метод заражения лабораторных животных

Этот метод используется для выделения чистой культуры из патологического материала, загрязненного посторонней микрофлорой, или в том случае, когда в исследуемом материале очень мало патогенных микроорганизмов.

Для за­ражения подбирают наиболее восприимчивые к предполагаемому возбудителю ин­фекции виды животных. Например, для выделения пневмококка из мокроты зара­жают белую мышь. Это животное весьма чувствительно к данному микробу и резистентно к другим микробам, находящихся в мокроте. В связи с этим пневмококк быстро размножается в организме мыши, а другие микробы погибают. Через 18-20 часов после заражения мышь забивают и кровь, взятую из сердца, засевают на питательную среду. Так как в крови содержится один пневмококк, то на питатель­ной среде вырастает чистая культура.

Методы, основанные на биологических свойствах микроорганизмов

Биологические методы выделения чистых культур основаны на учете того или иного свойства выделяемого микроба, отличающего его от других, находящихся с ним в смеси.

Метод Шукевича

Применяется для выделения подвижных микроорганизмов. Исследуемый ма­териал засевают в конденсационную воду скошенного агара, находящегося в про­бирке. При размножении подвижные формы микробов из конденсационной воды распространяются по агару, как бы "вползают" на его поверхность. Из верхней час­ти роста производят высев в конденсационную воду свежей питательной среды. Производя таким образом несколько пересевов, в конце концов получают чистую культуру подвижной бактерии.

Метод ингибирования

Основан на различном действии некоторых химических веществ и антибиоти­ков на микроорганизмы. Определённые вещества угнетают рост одних микроорга­низмов и не оказывают влияния на другие. Например, небольшие концентрации пенициллина задерживают рост грамположительных микроорганизмов и не влияют на грамотрицательные.

Первый этап выделения чистой культуры

1. Из исследуемого материала готовят мазок, окрашивают по Граму и микроскопируют.

2. Производят посев на чашки Петри с питательным агаром. Для этого исследуемый материал, в случае необходимости, разводят стерильным физиологическим раствором. Одну каплю приготовленного разведения наносят петлей на поверхность питательной среды в чашке Петри и тщательно втирают шпателем в среду, равномерно распределяя материал по всей ее поверхности. После посева чашку переворачивают дном кверху, подписывают и помещяют в термостат при 37ºС на 18-24 ч.

3. Производят посев на элективную питательную среду.

4. Производят посев на дифференциально-диагностическую среду.

5. Заражают лабораторных животных исследуемым материалом.

8. Методы выделения чистых культур микроорганизмов

Культивирование микроорганизмов, помимо состава питательной сре­ды, сильно зависит от физических и химических факторов (температура, кислотность, аэрация, свет и т. д.). При этом количественные показатели каждого из них неодинаковы и определяются особенностями метаболиз­ма каждой группы бактерий. Существуют методы культивирования мик­роорганизмов на твердых и в жидких питательных средах в аэробных, анаэробных и других условиях.

Методы выделения чистых культур аэробных микроорганизмов. Для того, чтобы получить изолированные колонии, при нанесении материал распределяют так, чтобы клетки бактерий были удалены друг от друга. Для получения чистой культуры используют две основные группы методов:

а) мето­ды, основанные на принципе механического разделения микроорганизмов;

б) методы, основанные на биологиче­ских свойствах микроорганизмов.

Методы, основанные на принципе механического разде­ления микроорганизмов

Рассев шпателем по Дригальскому. Берут 3 чашки Петри с питательной средой. На 1-ю чашку петлей или пипеткой наносят кап­лю исследуемого материала и растирают шпателем по всей поверхности питательного агара. Затем шпатель пе­реносят во 2-ю чашку и втирают оставшуюся на шпателе культуру в поверхность питательной среды. Далее шпа­тель переносят в 3-ю чашку и аналогичным образом про­изводят посев. На 1-й чашке вырастает максимальное количество колоний, на 3-й — минимальное. В зависимо­сти от содержания микробных клеток в исследуемом ма­териале на одной из чашек вырастают отдельные коло­нии, пригодные для выделения чистой культуры микро­организма.

Метод Пастера (метод разведений).Из исследуемого материала готовят ряд последовательных, чаще десятикратных серийных разведений в жидкой стерильной среде или физиологическом растворе в пробирках. Далее высевают материал газоном по 1 мл из каждой пробирки. Предполагают, что в какой-то из пробирок останется количество микроорганизмов, поддающихся подсчету при высеве на пластинчатые среды. Этот метод дает возможность подсчитать микробное число в исследуемом материале. (Микробное число - количество колоний на последней чашке с ростом микроорганизмов, умноженное на степень разведения материала).

Получение чистой культуры методом рассева в глубине среды Метод Коха (метод заливок).Исследуемый материал в небольшом количестве вносят в пробирку с расплавленным и охлажденным до 45-50°С МПА, перемешивают, затем каплю питательной среды с разведенным материалом переносят во вторую пробирку с расплавленным МПА и т.д. Количество разведений зависит от предполагаемой численности микроорганизмов в исследуемом материале. Приготовленные разведения мик­робов выливают из пробирок в стерильные чашки Петри, обозначенные номерами, соответствующими номерам про­бирок. После застудневания среды с исследуемым материалом чашки помещают в термостат. Количество колоний в чашках с питательной средой уменьшается по мере разведения мате­риала.

Рассев петлей (посев штрихами).Берут одну чашку Петри с питательным агаром и делят ее на 4 сектора, проводя разграничительные линии на внешней стороне дна чашки. Исследуемый ма­териал петлей вносят в первый сектор и проводят ею па­раллельные линии по всему сектору на расстоянии одна от другой около 5 мм. Этой же петлей, не изменяя ее положения по отношению к агару, проводят такие же линии на других секторах чашки. В том месте, где на агар попало большое количество микробных клеток, рост микроорганизмов будет в виде сплошного штриха. На секторах с небольшим количеством клеток вырастают отдельные колонии. Кроме того, можно наливать разведен­ные растворы смешанной культуры на поверхность твер­дых сред в чашках.

Метод фильтрации.Основан на пропускании исследуемого материала через специальные фильтры с определенным диаметром пор и разделении содержа­щихся микроорганизмов по величине. Этот метод при­меняется главным образом для очистки вирусов от бак­терий, а также при получении фагов и токсинов (в фильтрате - чистый фаг, очищенный токсин).

Методы, основанные на биологических свойствах мик­роорганизмов

Создание оптимальных условий для размножения

• Создание оптимального температурного режима для избирательного подавления размножения сопутствующей микрофлоры при низкой температуре и получения культур психрофильных или термофильных бактерий. Большинство микробов неплохо развиваются при 35-37°С, иерсинии хорошо растут при 22°С, лептоспиры культивируют при 30°С. Термофильные бактерии растут при температурах, лежащих за пределами температурных режимов прочих сопутствующих видов бактерий (так, кампилобактер культивируют при 42°С).

• Создание условий для аэробиоза или анаэробиоза. Большинство микроорганизмов хорошо растут в присутствии атмосферного кислорода. Облигатные анаэробы растут в условиях, исключающих присутствие атмосферного кислорода (возбудители столбняка, ботулизма, бифидумбактерии, бактероиды и др.). Микроаэрофильные микроорганизмы растут только при низком содержании кислорода и повышенном содержании СО₂(кампилобактер, геликобактер).

• Метод обогащения. Исследуемый материал за­севают на элективные питательные среды, способствую­щие росту определенного вида микроорганизмов.

Метод Шукевича.Исследуемый ма­териал засевают в конденсационную воду скошенного агара. При размножении подвижные формы микробов из конденсационной воды распространяются по агару, как бы «вползают» на его поверхность. Отсевая верхние края культуры в конденсационную воду свежескошенного агара и повторяя это несколько раз, можно получить чистую культуру. Так, для выделения культуры Proteus vulgaris, Clostridium tetani материал засевают в конденсационную воду на дне пробирки со скошенной плотной средой, не касаясь поверхности среды. Названные микроорганизмы способны давать ползучий рост (роение) на поверхности среды. Сопутствующие микробы растут в нижней части питательной среды, а протей и столбнячный микроб в виде пленки распространяются вверх и занимают всю скошенную часть агара.

Метод прогревания.Позволяет отделить спорообразующие бациллы от неспоровых форм. Прогрева­ют исследуемый материал на водяной бане при 80°С 10—15 мин. При этом погибают вегетативные формы, а споры сохраняются и при посеве на соответствующую пи­тательную среду прорастают.

Бактериостатический метод (метод ингибирования).Основан на различном действии некоторых химических веществ и антибиотиков на микроорганизмы. Определенные вещества угнетают рост одних микроор­ганизмов и не оказывают влияния на другие. Например, небольшие концентрации пенициллина задерживают рост грамположительных микроорганизмов и не влияют на грамотрицательные. Смесь пенициллина и стрептомици­на позволяет освободить нитчатые грибы и дрожжи от бактериальной флоры. Серная кислота (5% раствор) быстро убивает боль­шинство микроорганизмов, а туберкулезная палочка вы­живает в этих условиях. Необходимо учитывать, что селективные факторы часто включены в состав среды в бактериостатических концентрациях, поэтому сопутствующие микрооорганизмы остаются жизнеспособными и при переносе колоний исследуемой культуры на обычные среды могут быть причиной получения смешанной культуры.

Метод заражения лабораторных животных. Применяют в целях выделения и идентификации патогенных микроорганизмов и отделе­ния их от сапрофитной флоры. Для заражения подбира­ют наиболее восприимчивые к предполагаемому возбу­дителю инфекции виды животных. После появления у зараженных организмов признаков болезни их убивают и производят посев органов и тканей на питательные среды. При выделении и изучении облигатных паразитов этот метод является основным и един­ственным. Биопроба – метод, который позволяет не только выделить возбудитель из патологического материала, но также изучить вирулентность чистой культуры. Организм животного представляет собой биологический «фильтр», который в силу выраженности своих защитных свойств уничтожает сопутствующую непатогенную микрофлору, но не способен подавить размножение вирулентных бактерий. Биопроба проводится при выделении чистой культуры пневмококка, микобактерий туберкулеза, франциселл и т.п.

Изоляция чистых культур из смешанного населения | Микробиология | Методы биотехнологии | Ботанические лабораторные эксперименты

Получение чистых культур из смешанных Население:

1. Сначала смесь необходимо разбавить до тех пор, пока не появятся различные отдельные микроорганизмы. разделятся достаточно далеко друг от друга на поверхности агара, чтобы после при инкубации они образуют видимые колонии, изолированные от колоний других микроорганизмы. Эта пластина называется изолирующей пластиной.
2. Затем изолированную колонию можно асептически «снять» с изоляции. тарелка.

После инкубации все организмы в новой культуре будут потомками тот же организм; то есть чистая культура.

Методы изоляции разливочной и вращающейся пластин
Еще один метод отделения бактерий - метод наливной тарелки.С заливкой планшетный метод, бактерии смешивают с расплавленным агаром до равномерного распределения и разделены по всей жидкости. Затем расплавленный агар выливают в пустую тарелку и дают затвердеть. После инкубации отдельные бактериальные колонии затем можно обнаружить, что он растет как на агаре, так и в агаре.

Использование специализированных средств массовой информации
В дополнение к механическим методам изоляции, таким как штриховая пластина метод, микробиологу доступно множество специальных сред для помощи при выделении и идентификации конкретных микроорганизмов. Эти особые Целевые среды делятся на 4 группы: селективные среды, дифференциальные среды, обогащающие среды. среды, а также сочетание селективных и дифференциальных сред.

Селективная среда
В селективную среду добавлены агенты, которые будут ингибировать рост одной группы. организмов, позволяя при этом расти другому.Например, Колумбия CNA-агар содержит антибиотики колистин и налидиксовую кислоту, которые ингибируют рост грамотрицательных бактерий, но не рост грамположительных. Это , следовательно, считается селективным для грамположительных организмов и будет полезно для разделения смеси грамположительных и грамотрицательных бактерий.

Дифференциальный носитель Дифференциальная среда содержит добавки, которые вызывают заметное изменение цвета. в среде, когда происходит определенная химическая реакция.Они полезны для дифференцирование бактерий по некоторым биохимическим признакам. В другом слова, они указывают, может ли конкретный организм выполнять определенные биохимическая реакция при нормальном метаболизме. Многие такие медиа будут будет использоваться в будущих лабораториях для идентификации микроорганизмов.

Среда обогащения
Среда обогащения содержит добавки, усиливающие рост некоторых организмы. Это полезно, когда организм, который вы хотите культивировать, присутствует в относительно небольшое количество по сравнению с другими организмами, растущими в смеси.

Комбинация селективных и дифференциальных сред
Комбинированная селективная и дифференциальная среда позволяет выращивать один группа организмов при подавлении роста другой. Кроме того, это дифференцирует те организмы, которые растут, в зависимости от того, могут ли они выполнять особые химические реакции. Например, агар с эозин-метиленовым синим (EMB) - это селективный fo

чистых культур и нанесение штрихов: выделение отдельных бактериальных колоний из смешанного образца

На чашке Петри, если одна бактерия подвергается нескольким циклам бесполого размножения, это приведет к образованию клональной колонии. Однако получение одной бактерии из смешанного образца, такого как почвенная суспензия, может быть трудным. Если взять одну петлю этой гетерогенной культуры, она может содержать до триллиона отдельных бактерий. Чтобы распространить такое количество бактерий на поверхность чашки с агаром и получить одну колонию, даже используя зигзагообразный узор, петлю нужно было бы непрерывно протягивать по поверхности достаточного количества чашек, установленных бок о бок, чтобы охватить целостность Острова Свободы.Очевидно, что ученые не используют столько пластин. Вместо этого они используют технику, называемую нанесением штрихов.

Методика планшетов основана на постепенном разбавлении бактериального образца и выполняется на твердой поверхности одной чашки Петри. Для начала поверхность носителя визуально разделена на пять участков: четыре фрагмента окружности обозначены как первые четыре участка, а центр пластины - как пятый. В результате из одной чашки Петри будет создано пять чашек с питанием.Затем, используя полную петлю желаемого посевного материала, на первом участке наносится зигзагообразный узор. Затем используется либо новая одноразовая петля, либо, в случае проволочной петли, ее стерилизуют горелкой Бунзена, обжигая ее до докрасна по всей длине проволоки. Это использование новой петли или петли для стерилизации пламенем удаляет все оставшиеся бактериальные клетки, способствуя их разведению. Затем горячий контур охлаждают на воздухе в течение нескольких секунд, а затем протягивают через первую секцию, чтобы создать три-четыре отдельных линии, каждая из которых несет только часть бактерий во вторую секцию.Остальные секции наносятся таким же образом, используя каждый раз стерильную петлю и однократно проходя через предыдущую полосу.

При использовании этого цикла штриховки и стерилизации концентрация бактерий в каждой последующей секции должна быть снижена так, чтобы последняя секция содержала только несколько дискретно расположенных бактерий. После инкубации эти отдельные бактерии размножаются с образованием изолированных клональных колоний дочерних клеток, которые называются колониеобразующими единицами или КОЕ.Их можно собрать и повторно посеять, чтобы гарантировать, что в последующей работе будет задействован только один тип бактерий, называемый чистой культурой. Помимо выделения отдельных колоний из смешанной бактериальной культуры, метод посева штрихов также используется для отбора штаммов, специфичных для среды, определения морфологии бактериальных колоний или идентификации различных видов бактерий. В этом видео мы продемонстрируем, как изолировать колонии отдельных бактерий из суспензии смешанных бактерий с помощью метода посева полос.

Для начала наденьте лабораторные перчатки и лабораторный халат. Затем простерилизуйте рабочее пространство, используя 70% этанол. Затем выберите подходящую среду, которая будет поддерживать используемые виды или штамм бактерий, и начните подготовку среды. Здесь обычный агар LB готовят путем отвешивания десяти граммов предварительно приготовленной порошкообразной среды и 7,5 граммов агара. Добавьте взвешенные высушенные компоненты в стеклянную бутыль, которая вмещает вдвое больший конечный объем, чтобы избежать переполнения. Затем налейте в бутылку 500 миллилитров воды и плотно закройте ее.Стерилизуйте среду, поместив бутылку в автоклав с температурой 121 градус Цельсия на двадцать минут. После завершения используйте термостойкие перчатки или подставку под горячее, чтобы удалить носитель из машины, а затем сразу же закрутите крышку бутылки, чтобы плотно закрыть ее.

Для использования в тот же день дайте носителю остыть, поместив бутылку в водяную баню, нагретую до примерно 45 градусов Цельсия, чтобы сохранить носитель в жидком состоянии. В качестве альтернативы носитель можно оставить при комнатной температуре для хранения в твердом состоянии.При необходимости поместите бутылку в микроволновую печь с приоткрытой крышкой, чтобы среда расплавилась, и дайте ей остыть на водяной бане с температурой 45 градусов Цельсия.

Затем возьмите упаковку стерильных чашек Петри и с помощью перманентного маркера пометьте их с именем исследователя и носителя, а также с датой. Затем перенесите требуемый объем среды в стерильный сосуд и при необходимости добавьте антибиотики или другие чувствительные компоненты. Здесь 50 миллилитров среды смешивают со 100 микролитрами канамицина до конечной концентрации 25 микрограммов на миллилитр.Вращайте трубку, чтобы обеспечить равномерное распределение добавленных компонентов в среде. Медленно, чтобы избежать образования пузырьков, налейте от 20 до 25 миллилитров культуральной среды приблизительно 45 градусов Цельсия в каждую из чашек. Если появляются пузырьки или пена, быстро удалите их с помощью обычной пипетки и стерильного наконечника. Затем немедленно закройте все крышки, чтобы предотвратить загрязнение. Дайте агару затвердеть при комнатной температуре не менее двух часов или на ночь. После застывания храните планшеты для культивирования в перевернутом виде при температуре 4 градуса Цельсия, чтобы минимизировать конденсацию на поверхности среды.

Для посева выбранной культуры сначала возьмите чистую культуральную чашку и снимите крышку. Быстро погрузите одноразовую стерильную петлю в желаемый посевной материал, а затем сразу же зигзагообразным движением протрите петлю по первому квадранту планшета. Закройте чашку крышкой, выбросьте использованную петлю для посева, а затем выберите новую стерильную петлю. Используя новую петлю, сделайте от трех до четырех штрихов, пересекающих исходную линию мазка, исходящую из первого квадранта, которая должна содержать относительно плотную популяцию бактерий во втором квадранте.Закройте крышку еще раз и выбросьте петлю. С новой петлей повторите это действие снова, но на этот раз переходя из второго квадранта в третий. Затем снова с новой петлей сделайте еще одну полоску с третьей на четвертую часть пластины. Наконец, с новой петлей сделайте последний штрих зигзагообразным узором от четвертого квадранта к центру пластины. Распространенность бактерий в этой области будет ниже, что в идеале позволит создать отдельные колонии из одной жизнеспособной материнской клетки.

Установите крышку планшета на место и, если это возможно для бактерий, закройте планшет парафиновой пленкой для предотвращения попадания воздуха. Переверните культуральную чашку вверх дном, чтобы избежать капель конденсата, а затем поместите при температуре, подходящей для роста. Здесь инкубатор настроен на 37 градусов Цельсия. Дайте планшету инкубироваться, пока не станут видны колонии бактерий. Чтобы создать клональную бактериальную популяцию, выберите одну отдельную колонию из этой чашки. Теперь с помощью стерильной петли коснитесь целевой колонии и, как и раньше, сделайте полосу в первом квадранте новой чашки.Продолжайте поочередно стерилизовать петлю и штриховать оставшиеся квадранты пластины, как показано ранее, заканчивая зигзагом к центру. Закройте чашку и поместите ее для инкубации до образования отдельных колоний. После выращивания этих колоний они обычно представляют собой чистые клональные штаммы.

Исходная пластина для штриховки может содержать колонии, происходящие из клеток разных видов бактерий или клеток с различным генетическим составом, в зависимости от чистоты образца.Посредством последующего выделения одной колонии, где все единицы получены из общей материнской клетки, вторая процедура штриховки генерирует относительно клональную бактериальную популяцию, подходящую для дальнейшей характеристики или инокуляции в бульон.

Frontiers | Метод скрининга для выделения бактерий, способных разрушать токсичные стероидные гликоалкалоиды, присутствующие в картофеле

Введение

Во всем мире крахмал растительного происхождения является доминирующим источником питательных веществ для миллионов людей, и среди наиболее важных растений, производящих крахмал, является картофель (Ellis et al., 1999; Burrell, 2003; Jobling, 2004; Sonnewald and Kossmann, 2012) . Картофельный крахмал не только является основным источником питательных веществ, но и является важным промышленным пищевым ингредиентом.Побочным продуктом производства картофельного крахмала является фруктовый сок картофеля (PFJ), который содержит белки, аминокислоты и пептиды (Zhang et al., 2017). Хотя PFJ имеет высокую питательную ценность, растительные белки, в том числе картофель, содержат много антипитательных компонентов и, следовательно, должны быть очищены перед употреблением в пищу человеком (Steinhof et al., 2005). В случае картофельных белков ценность снижается из-за присутствия токсичных стероидных гликоалкалоидов (GA), полифенолов и фермента полифенолоксидазы (PPO), ответственных за изменение цвета, в результате чего конечные продукты приобретают коричневый оттенок и, следовательно, негативно влияют на как растворимость, так и усвояемость (Prigent et al., 2007). ГК являются частью естественной защиты растений картофеля, и было показано, что они обладают токсическим действием на людей, вызывая среди прочего желудочно-кишечные и неврологические расстройства (например, рвоту, диарею, головную боль и галлюцинации) (Grunenfelder et al., 2006). Кроме того, ГК придают продуктам на основе картофельного белка нежелательную горечь (Sinden et al., 1976). Следовательно, эти компоненты должны быть удалены из белковой фракции картофеля, прежде чем она станет пригодной для употребления в пищу человеком. Ферментативное удаление углеводной части может обеспечить более устойчивый и экологически безопасный процесс детоксикации PFJ.Недавнее исследование Koffi et al. (2017) продемонстрировали, что химико-ферментативная обработка ГА с использованием частичного кислотного гидролиза в сочетании с ферментативной обработкой позволяет эффективно преобразовывать α-чаконин в соланидин. Соланидин также является ценным продуктом, который может служить прекурсором для синтеза гормонов и других фармакологически активных соединений (Vronen et al., 2003; Koffi et al., 2017). В качестве фермента в исследовании использовалась β-гликозидаза таракана Periplaneta americana (Koffi et al., 2017). С этой целью мы хотели идентифицировать бактериальные изоляты, способные продуцировать специфические ферменты, способные разлагать токсичные ГК картофеля до соланидина.

Ранее было установлено, что экстракты как картофельных, так и грибковых патогенов обладают активностью по разложению GA (Weltring et al., 1997; Oda et al., 2002; Nikolic et al., 2005; Dahlin et al., 2017). Некоторые из этих ферментов, по-видимому, действуют путем последовательной деградации углеводной части, что указывает на то, что для полного дегликозилирования алкалоида может потребоваться несколько ферментов.Кроме того, ферменты, которые могут разлагать алкалоиды, могут быть специфичными только для одного из двух основных ГА, продуцируемых в картофеле, α-чаконина и α-соланина. Эти соединения обнаруживаются во всех частях растения и обычно производятся растениями в качестве биопестицидов или при повреждении растения. Картофельные ГА состоят из соланидинового агликона с углеводной боковой цепью, которая важна для опосредования взаимодействий с клеточными мембранами (Koffi et al., 2017). Было высказано предположение, что для детоксикации α-чаконина и α-соланина первым шагом является удаление трисахарида для высвобождения соланидина.Однако недавнее исследование показало, что соланидин оказывает большое влияние на физиологию фитопатогена Phytophthora infestans по сравнению с его гликозилированной формой (Dahlin et al., 2017). Лишь скудная информация и несколько статей в настоящее время описывают микробы и ферменты, участвующие в деградации ГК картофеля, и поэтому срочно необходимы новые знания. Чтобы заполнить этот информационный пробел, мы опишем здесь серию методов идентификации бактерий, разлагающих GA.

В данном исследовании мы стремились разработать систему для выделения, скрининга и отбора бактерий, способных разлагать α-чаконин и α-соланин.Были созданы накопительные культуры для выделения штаммов бактерий, способных выдерживать высокие концентрации ГА или использовать их в качестве единственного источника углерода. Используя сочетание низкотехнологичных [обогащение культур, тонкослойной хроматографии (ТСХ)] и высоких технологий [жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии (ЖХ-МС)], мы успешно изолировали и проверили бактериальные штаммы, способные разлагать ГА, продемонстрировав полезность этого трубопровод как отправная точка для открытия ферментов. Насколько нам известно, это первый отчет, в котором описаны бактерии, способные разрушать ГК картофеля.

Материалы и методы

Экстракция α-чаконина и α-соланина и подготовка стандартов

Неочищенную экстракцию (GA) из картофельного белка, поставляемого Kartoffelmelcentralen (KMC), Amba, проводили следующим образом: 0,5 г картофельного белка добавляли к 5 мл метанол-вода-уксусная кислота (в соотношении 80: 9,5: 0,5). в пробирку на 50 мл и энергично встряхивают в течение 10 мин. Пробирку центрифугировали 10 мин при 4 ° C и верхнюю фазу осторожно декантировали в свежую пробирку на 50 мл. Экстракты объединяли и сушили в вакуумной центрифуге перед ресуспендированием в 1.5 мл стерилизованного фильтрованием калий-фосфатного буфера при pH 7,5. Чтобы улучшить растворимость ГА, добавляли 1,5 мкл уксусной кислоты. Неочищенный экстракт стерилизовали фильтрованием с использованием фильтра 0,45 мкм, после чего очищенные ГА были обнаружены и идентифицированы с помощью анализа ВЭЖХ (см. Ниже).

Чистый α-чаконин был получен от PhytoLabs (Вестенбергсгройт, Германия), а α-соланин был приобретен либо от PhytoLabs, либо от Sigma-Aldrich (Brøndby, Дания).

Выделение и очистка бактериальных штаммов из экстрактов почвы картофеля

Бактерии выделяли на картофельном агаре с декстрозой пятой силы (PDA 1/5) путем инокуляции материала из зеленого картофеля и окружающей почвы.В качестве альтернативы, минимальная среда, описанная Nan and Edens, 1998, была дополнена чистой или сырой экстракцией GA (дополнительный рисунок S1), использованной для выделения бактерий. Планшеты инкубировали при 15 ° C в течение недели и бактериальные колонии выделяли для очистки. После трех раундов выделения для получения чистых культур отобранные штаммы обычно культивировали либо в бульоне Lysogeny (LB), либо на агаре LB при 20 ° C в течение 1-2 дней, в зависимости от штамма.

Скрининг бактерий, способных использовать альфа-чаконин или альфа-соланин в качестве единственного источника углерода

Чтобы определить, могут ли бактериальные изоляты использовать ГА в качестве единственного источника углерода, штаммы выращивали в течение ночи в LB при 20 ° C и высевали 5 мкл культуры на чашки Петри, содержащие минимальную среду, как описано выше, обогащенную α-чаконином или α -золанин как единственный источник углерода.Штаммы с положительной оценкой роста были отобраны для дальнейшей характеристики.

Экстракция ДНК и определение последовательностей рибосомной РНК 16S

Экстракцию неочищенной ДНК из выделенных бактериальных культур проводили следующим образом. Бактериальные клетки соскабливали с чашки Петри и ресуспендировали в 1 мл стерильного фосфатно-солевого буфера (1 × PBS) в стерильной пробирке Эппендорфа. Клетки концентрировали центрифугированием в течение 5 минут при 10,000 × g , после чего супернатант удаляли.Для экстракции ДНК осадок ресуспендировали в 100 мкл стерильной воды, кипятили 10 мин и сразу же помещали на лед перед добавлением 900 мкл ледяной стерильной воды. Клеточный дебрис осаждали центрифугированием в течение 5 мин при 10000 × g . Супернатант, содержащий ДНК, переносили в чистую пробирку, готовую для ПЦР-анализа или хранения при -20 ° C. Последовательность гена 16S рРНК определяли с помощью ПЦР с использованием универсальных бактериальных праймеров 16S рРНК: 16S-27F (5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3 ') и 16S-1492R (5'-CGG TTA CCT TGT TAC GAC TT -3 ′) (Webster et al., 2006). Секвенирование по Сэнгеру гена 16S рРНК было выполнено GATC-Biotech, Констанц, Германия, для идентификации отобранных штаммов.

Ферментные анализы

Для предварительного скрининга штаммы выращивали в течение ночи в 5 мл LB, встряхивая при 200 об / мин при 20 ° C, а затем разбавляли 1: 100 в среде LB либо водой (контроль), либо 10 мкг мл. ^-1 конечная концентрация α-чаконина или α-соланина и инкубировали 20 ч в тех же условиях. Для получения сырых внеклеточных экстрактов культуры центрифугировали при 20 ° C в течение 30 мин при 4000 × g и либо использовали напрямую, либо замораживали при -20 ° C.Готовили ферментные реакции, состоящие из 10 мкл 50 мМ натрий-ацетатного буфера, pH 5,5, 40 мкл субстрата (0,2 мМ GA в 100 мМ натрий-ацетатном буфере, pH 5,0) и 45 мкл неочищенного экстракта, и инкубировали 24 часа при 20 ° C. Ферментные реакции прекращали нагреванием в течение 10 мин при 90 ° C. После центрифугирования или 10 мин при 17000 × g супернатант переносили в свежую пробирку на 1,5 мл и сушили в вакууме для дальнейшего анализа. Осадки ресуспендировали в 20 мкл метанола и 8 мкл наносили на планшеты для ТСХ для анализа или 10 мкл характеризовали анализом ВЭЖХ.

Для отбора штаммов для дальнейшей характеристики штаммы выращивали в течение ночи в 5 мл LB при встряхивании 200 об / мин 20 ° C, а затем промывали 0,9% NaCl и стандартизировали до OD _{600 нм} 1,0. Во встряхиваемую колбу на 100 мл 1 мл бактериальной культуры (конечная OD _{600 нм} 0,1) был добавлен к 9 мл LB с добавлением кислого фосфатного буфера (контроль) или гликоалкалоидной смеси (5 мкг мл ^-1 каждого из α- чаконин, α-соланин и α-томатин) и выращивали при встряхивании 200 об / мин при 20 ° C в течение 20 часов.Для получения сырых внеклеточных экстрактов культуры центрифугировали при 20 ° C в течение 20 мин при 4000 × g и использовали непосредственно для анализа активности ферментов. Были подготовлены ферментные анализы, состоящие из 10 мкл 50 мМ натрийацетатного буфера с pH 5,5, 40 мкл субстрата (0,2 мМ α-чаконина и 0,2 мМ α-соланина) в 100 мМ буфере ацетата натрия с pH 5,0 и 45 мкл неочищенного экстракта. инкубируют при 20 ° C в течение 35 часов. Ферментные реакции останавливали нагреванием в течение 10 минут при 90 ° C, а затем центрифугировали в течение 10 минут при 17000 × g перед переносом супернатанта либо во флакон для ВЭЖХ (60 мкл) для полуколичественного анализа, либо в свежий 1.Пробирка 5 мл (30 мкл) для качественного анализа ТСХ. Для анализа методом ТСХ 30 мкл экстракта сушили 1 час на вакуумной центрифуге и ресуспендировали в 7 мкл холодного метанола. Образцы ненадолго центрифугировали и 5 мкл наносили на пластину для ТСХ. Планшеты для ТСХ запускали дважды в системе растворителей n -бутанол-уксусная кислота-вода (2: 1: 1), опрыскивали 50% об. ^-1 H ₂ SO ₄ и нагревали в течение 10 мин при 85 ° C. ° C. Для анализа ВЭЖХ вводили образец объемом 25 мкл и условия анализа были такими, как описано ниже.Для анализа промежуточных метаболитов, образующихся во время разложения или обнаружения соланидина, 30 мкл образца анализировали с помощью ЖХ-МС.

Тонкослойная хроматография (ТСХ)

ТСХ выполняли на силикагелях 60 F254 (Merck) с использованием n -бутанол-уксусная кислота-вода (2: 1: 1) в качестве рабочего растворителя, и пластины проявляли на горячей плите после распыления 50% об. ^{- 1} H ₂ SO ₄ .

Анализ с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)

Количественное определение и идентификация α-чаконина и α-соланина выполняли с использованием системы Waters 2695 Alliance с детектором двойного поглощения Waters 2487 при 202 нм.Колонка представляла собой Waters Nova-Pak C ₁₈ с размером частиц 4 мкм, работала при 40 ° C. Растворителем был 60% ацетонитрил и 40% фосфатный буфер при pH 7,6 (смесь K ₂ HPO ₄ и KH ₂ PO ₄ для получения правильного значения pH) при скорости потока 1,5 мл / мин.

Жидкостная хроматография, масс-спектрометрия (ЖХ-МС) Анализ

Количественное определение и идентификация α-чаконина и α-соланина основывались на интенсивности ионов однозарядной моноизотопной массы (α-чаконин, m / z 852.51; α-соланин, m / z 868,51). Присутствие соланидина контролировали при m / z 398,34. Интенсивности ионов нормализовали к уровню в необработанной среде LB. Образцы анализировали на установке ЖХ-МС с системой exigent nanoLC 415 (Sciex), подключенной к масс-спектрометру TripleTOF 6600 (Sciex), снабженному источником NanoSpray III (AB Sciex). Ионно-интенсивность была извлечена в Pekaview 1.2 (Sciex).

Результаты и обсуждение

Предыдущее исследование продемонстрировало быструю смену картофеля (ГА) в верхних слоях почвы датских картофельных полей, предположительно из-за микробного метаболизма (Jensen et al., 2009). Следовательно, вполне вероятно, что в такой среде присутствуют бактерии, продуцирующие ферменты, разлагающие GA. Кроме того, кожура зеленого картофеля, как известно, содержит значительно большее количество токсичных ГА (Omayio et al., 2016). На основании этих наблюдений была разработана стратегия скрининга бактерий, разлагающих GA, как показано на рисунке 1. Картофельные экстракты из кожуры зеленого картофеля и окружающей почвы были использованы в качестве потенциального источника бактерий, разлагающих GA. Для отбора таких бактерий была создана серия обогащающих культур с использованием коммерчески очищенных ГА или неочищенного экстракта, полученного из картофельного порошка (дополнительный рисунок S1).Неочищенный препарат ГА был получен, поскольку чистый α-чаконин и α-соланин являются дорогостоящими продуктами. Следовательно, при использовании чистых соединений использовались маленькие чашки Петри с небольшим объемом среды. Всего из этих накопительных культур было получено 85 изолятов, которые использовали для дальнейшего анализа. Чтобы определить, могут ли выделенные штаммы использовать GA в качестве единственного источника углерода, культуры, выращенные в течение ночи, переносили в чашки Петри с минимальной средой и добавляли либо -чаконин, либо -соланин в качестве единственного источника углерода.В общей сложности 14 штаммов, которые росли на среде, обогащенной GA, переносили в жидкую среду, содержащую либо смесь GA, либо не содержащую GA, и культивировали в течение ночи. Неочищенные бактериальные экстракты были проверены на деградацию GA с использованием оптимизированного и быстрого метода ТСХ для обнаружения как α-чаконина, так и α-соланина (рисунок 2 и дополнительный рисунок S2). Помимо этих двух соединений, в анализ ТСХ был включен агликон-соланидин, который образуется при удалении углеводной части двух соединений (рис. 2).Параллельно с анализом ТСХ, деградация GA также была подтверждена с помощью анализа ВЭЖХ и ЖХ-МС, соответственно (фиг. 3 и дополнительные рисунки S3, S4). Интересно, что в образцах, где бактериальные экстракты инкубировали с ГА, соланидин не обнаружен, что указывает на то, что изоляты могут быть способны к полному гидролизу и метаболизму ГА и продуктов их разложения. Единственным промежуточным продуктом, связанным с ГА, обнаруженным с помощью ЖХ-МС, был вариант ГА 705,5 Да, соответствующий либо α-чаконину, либо α-соланину, где самый внешний сахарид был удален гидролизом, в результате чего соланидин был модифицирован дисахаридом (дополнительный рисунок S4).

РИСУНОК 1. Схема выделения гликоалкалоидных (GA) бактерий.

РИСУНОК 2. Детектирование с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ) очищенного ГА из α-чаконина и α-соланина картофеля. Анализ продуктов гидролиза методом ТСХ был использован для визуализации стандартов (A), α-чаконин (C), α-соланин (S) и соланидин (SD). Разработанный метод ТСХ был использован для визуализации продуктов деградации после гидролиза ГА бактериальными неочищенными экстрактами (штаммы 40, 37, 38, 39, 69, 93, 94 и 102), полученными из чистых культур (B) по сравнению с α-чаконином. (C), α-соланин (S) и α-томатин (T).

РИСУНОК 3. Спектры высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) чистых гликоалкалоидов (GA) α-чаконина и α-соланина из картофеля. Анализ продуктов гидролиза методом ВЭЖХ использовали для количественной оценки деградации GA бактериальными экстрактами чистых культур (A) . Разложение полученных из картофеля гликоалкалоидов α-чаконина (черный) и α-соланина (серый) неочищенными экстрактами, полученными из культур бактериальных клеток (штаммы 17, 40, 41, 56, 74, 106, 120 и In5) по сравнению с контролем (пустой носитель LB) и стандартный (ST) индуцированный (B) или неиндуцированный (C) .

Из 14 штаммов бактерий, разлагающих ГА, выделенных из серии обогащенных культур, четыре штамма S37, S39, S40 и S41 были лучшими в разложении ГА картофеля. Неудивительно, что все четыре штамма были выделены из минимальной среды, отвержденной агаром, содержащим смесь чистого α-чаконина и α-соланина в качестве единственного источника углерода. Обогащение культур, содержащих ГА в качестве единственного источника углерода, было лучшим методом для выделения бактерий, разрушающих ГА.

В то время как микробная деградация ГА известна, лишь немногие исследования сообщают о бактериях, способных разрушать ГА.Например, Clavibacter michiganensis и Streptomyces scabies - это бактерии, которые могут разлагать GA α-томатин томатов, однако, насколько нам известно, ни в одном исследовании не сообщалось о бактериальном разложении GA картофеля (Kaup et al., 2005; Seipke и Лориа, 2008). Во время скрининга коллекции штаммов мы обнаружили, что один штамм, Serratia sp. S40 также проявлял противогрибковую активность. Чтобы выяснить, могут ли другие биоконтролирующие бактерии разрушать ГА, мы проверили способность хорошо описанного противогрибкового штамма Pseudomonas fluorescens In5, выделенного из картофельного поля в южной Гренландии (Michelsen and Stougaard, 2011; Hennessy et al., 2017). Мы наблюдали, что P. fluorescens In5 был способен разлагать как α-чаконин, так и α-соланин и, как и GA-деградеры, описанные в этом исследовании, оказался способным к полному разложению и метаболизму обоих соединений, поскольку соланидин не был обнаружен после гидролиза ГА сырым ферментным экстрактом из P. fluorescens In5. Потребуются дальнейшие исследования, изучающие механизмы, с помощью которых эти бактерии разлагают GA.

Идентичность четырех штаммов, которые продуцировали экстракты, разрушающие GA, определяли путем анализа последовательностей гена 16S рРНК (таблица 1).Три изолята (S37, S39 и S41) продемонстрировали более чем 99% идентичность последовательностей с видами рода Arthrobacter , а четвертый изолят (S40) продемонстрировал 98% идентичность последовательностей с видами рода Serratia . Все штаммы были способны разлагать как α-чаконин, так и α-соланин. Опубликованная информация о GA-деградирующих бактериях скудна, но ранее сообщалось, что фермент α-чакониназа, продуцируемый Gibberella pulicaris , индуцируется α-чаконином, α-соланином и гликоалкалоидом α-томатином томата (Becker and Weltring, 1998).Все четыре штамма были способны расщеплять α-чаконин и α-соланин независимо от того, индуцировались ли бактериальные культуры добавлением GA. Теперь необходима дальнейшая характеристика четырех отобранных штаммов для определения их видов и выяснения ферментов, участвующих в деградации GA.

ТАБЛИЦА 1. Последовательности 16S рибосомной РНК изолятов.

Описанный здесь метод выделения позволил идентифицировать четыре штамма, которые продемонстрировали способность метаболизировать и расщеплять полученные из картофеля ГА α-чаконин и α-соланин.Последовательности гена 16S рРНК этих штаммов показали наибольшее сходство со штаммами, принадлежащими к родам Arthrobacter и Serratia . Функциональная геномика идентифицированных штаммов теперь необходима для идентификации генов и метаболических путей, связанных с биодеградацией ГК картофеля.

Заключение

Мы успешно разработали метод скрининга для выделения бактерий, разлагающих GA, из экстрактов картофельной почвы. Это позволит в будущем идентифицировать и охарактеризовать ферменты, участвующие в деградации ГА, чтобы превратить промышленные отходы в ценные пищевые ингредиенты.

Авторские взносы

RH и PS разработали исследование. RH, NJ и CS проводили эксперименты. Все авторы проанализировали и интерпретировали данные, подготовили и утвердили рукопись.

Финансирование

Эта работа была поддержана грантом Датского инновационного фонда 5158-00001A (proPotato: Potato Proteins - Challenges and Industrial Possibility).

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Благодарим Susanne Iversen за квалифицированную техническую помощь.

Дополнительные материалы

Дополнительные материалы к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2018.02648/full#supplementary-material

Список литературы

Беккер П. и Велтринг К. М. (1998). Очистка и характеристика α-чакониназы Gibberella Pulicaris . FEMS Microbiol.Lett. 167, 197–202. DOI: 10.1111 / j.1574-6968.1998.tb13228

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Баррелл М. М. (2003). Крахмал: потребность в улучшении качества или количества - обзор. J. Exp. Бот. 54, 451–456. DOI: 10.1093 / jxb / erg049

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Далин, П., Мюллер, М. К., Экенгрен, С., Макки, Л. С., и Булоне, В. (2017). Влияние стероидных гликоалкалоидов на физиологию Phytophthora infestans , возбудителя фитофтороза картофеля. Мол. Взаимодействие с растительными микробами. 30, 531–542. DOI: 10.1094 / MPMI-09-160186

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Эллис, Р. П., Кокрейн, М. П., Дейл, М. Ф. Б., Даффус, К. М., Линн, А., Моррисон, И. М. и др. (1999). Производство и промышленное использование крахмала. J. Sci. Food Agric. 77, 289–311. DOI: 10.1002 / (SICI) 1097-0010 (199807) 77: 3 <289 :: AID-JSFA38> 3.0.CO; 2-D

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Грюненфельдер, Л.А., Ноулз, Л.О., Хиллер, Л.К., Ноулз, Н.Р. (2006). Развитие гликоалкалоидов при озеленении свежего товарного картофеля ( Solanum tuberosum L.). J. Agric. Food Chem. 54, 584–754. DOI: 10.1021 / jf0607359

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хеннесси, Р. К., Фиппен, К. Б. У., Нильсен, К. Ф., Олссон, С., и Стугаард, П. (2017). Биосинтез антимикробных циклических липопептидов нунамицина и нунапептина P.fluorescens штамм In5 регулируется регулятором транскрипции LuxR-типа NunF. Microbiologyopen 6, 594–595. DOI: 10.1002 / mbo3.516

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Йенсен, П. Х., Педерсен, Р. Б., Свенсмарк, Б., Штробель, Б. В., Якобсен, О. С., и Хансен, Х. С. (2009). Разложение альфа-соланина гликоалкалоида картофеля в трех сельскохозяйственных почвах. Chemosphere 76, 1150–1155. DOI: 10.1016 / j.chemosphere.2009.04.008

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кауп, О., Графен, И., Целлерманн, Э. М., Эйхенлауб, Р., и Гартеман, К. Х. (2005). Идентификация томатиназы в томатно-патогенном актиномицете Clavibacter. michiganensis subsp. michiganensis NCPPB 382. Mol. Взаимодействие с растительными микробами. 18, 1090–1098. DOI: 10.1094 / MPMI-18-1090

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Коффи, Г.Ю., Ремо-Симеон, М., Дью, А. Э., и Комб, Д. (2017). Выделение и химико-ферментативная обработка гликоалкалоидов из зеленого, прорастающего и гниющего картофеля solanum tuberosum для извлечения соланидина. Food Chem. 220, 257–265. DOI: 10.1016 / j.foodchem.2016.10.014

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Michelsen, C.F., и Stougaard, P. (2011). Новый противогрибковый препарат Pseudomonas fluorescens , выделенный из картофельных почв в Гренландии. Curr. Microbiol. 62, 1185–1192. DOI: 10.1007 / s00284-010-9846-4

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Нан, Х. М., и Эденс, Л. (1998). Процесс модификации токсичных соединений и / или соединений с неприятным запахом. Патент США № WO 99/01564.

Google Scholar

Николич, Н. К., Станкович, М. З., и Маркович, Д. З. (2005). Жидкостно-жидкостные системы для кислотного гидролиза гликоалкалоидов из проростков клубней solanum tuberosum L. и экстракции соланидина. Med. Sci. Монит. 11, BR200 – BR205.

PubMed Аннотация | Google Scholar

Ода, Ю., Сайто, К., Охара-Такада, А., и Мори, М. (2002). Гидролиз альфа-чаконина гликоалкалоидов картофеля нитчатыми грибами. J. Biosci. Bioeng. 94, 321–325. DOI: 10.1016 / S1389-1723 (02) 80171-2

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Омайо, Д. Г., Абонг, Г. О., и Окот, М. В. (2016). Обзор встречаемости гликоалкалоидов в картофеле и картофельных продуктах. Curr. Res. Nutr. Food Sci. 4, 538–539. DOI: 10.12944 / CRNFSJ.4.3.05

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Приджент, С. В. Э., Вораген, А. Г. Дж., Виссер, А. Дж., Ван Конингсвельд, Г. А., и Группен, Х. (2007). Ковалентные взаимодействия между белками и продуктами окисления кофеилхиновой кислоты (хлорогеновой кислоты). J. Sci. Food Agri. 87, 2502–2510. DOI: 10.1002 / jsfa.3011

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Sinden, S.Л., Деаль К. Л. и Ауленбах Б. Б. (1976). Влияние гликоалкалоидов и фенолов на вкус картофеля. J. Food Sci. 41, 520–523. DOI: 10.1111 / j.1365-2621.1976.tb00661.x

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Стейнхоф, В. А. Р., Лотц, М., Ульбер, Р., Каспер, К., и Шепер, Т. (2005). Оптимизация анализа гликоалкалоидов для использования в переработке промышленного картофельного фруктового сока. Eng. Life Sci. 5, 562–567. DOI: 10.1002./elsc.200520107

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Вронен, П.Дж. Э., Коваль Н., Гроот А. (2003). Синтез 16-дегидропрегненолонацетата (DPA) из гликоалкалоидов картофеля. Arkivoc 2004, 24–50. DOI: 10.3998 / ark.5550190.0005.203

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Вебстер, Г., Паркс, Р. Дж., Крэгг, Б. А., Ньюберри, К. Дж., Вейтман, А. Дж., И Фрай, Дж. К. (2006). Состав прокариотических сообществ и биогеохимические процессы в глубоководных донных отложениях на окраине Перу. FEMS Microbiol. Ecol. 58, 65–85. DOI: 10.1111 / j.1574-6941.2006.00147.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Велтринг, К. М., Весселс, Дж., И Гейер, Р. (1997). Метаболизм сапонинов картофеля альфа-чаконина и альфа-соланина с помощью Gibberella pulicaris . Фитохимия 46, 1005–1009. DOI: 10.1016 / S0031-9422 (97) 00388-9

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Чжан Д., Му Т., Сунь Х., Чен Дж. И Чжан М. (2017).Сравнительное исследование концентратов белков картофеля, экстрагированных сульфатом аммония и изоэлектрическим осаждением. J. Int. Food Prop. 20, 2113–2127. DOI: 10.1080 / 10942912.2016.1230873

CrossRef Полный текст | Google Scholar

% PDF-1.3 % 245 0 объект > endobj xref 245 48 0000000016 00000 н. 0000003091 00000 н. 0000003224 00000 н. 0000003881 00000 п. 0000004340 00000 н. 0000004377 00000 п. 0000004423 00000 н. 0000004537 00000 н. 0000004658 00000 н. 0000004812 00000 н. 0000006333 00000 н. 0000007614 00000 н. 0000008808 00000 н. 0000009972 00000 н. 0000010968 00000 п. 0000012006 00000 п. 0000012531 00000 п. 0000013513 00000 п. 0000015006 00000 п. 0000017656 00000 п. 0000017709 00000 п. 0000017938 00000 п. 0000018326 00000 п. 0000020354 00000 п. 0000020671 00000 п. 0000021059 00000 п. 0000024236 00000 п. 0000024576 00000 п. 0000025017 00000 п. 0000080172 00000 п. 0000080211 00000 п. 0000107986 00000 п. 0000109121 00000 п. 0000110048 00000 н. 0000111136 00000 н. 0000115117 00000 н. 0000120025 00000 н. 0000127590 00000 н. 0000130172 00000 н. 0000150821 00000 н. 0000151807 00000 н. 0000153146 00000 н. 0000154463 00000 н. 0000154698 00000 н. 0000156061 00000 н. 0000157308 00000 н. 0000158355 00000 н. 0000001256 00000 н. трейлер ] / Назад 1113218 >> startxref 0 %% EOF 292 0 объект > поток h ެ V {TG% | Д7нк4-

Смотрите также

• 
  Выделения густые кремообразные
• 
  Болит низ живота у женщины и выделения белые
• 
  При цистите выделение крови
• 
  Белые выделения изо рта
• 
  Для выделения объекта используется
• 
  Слизистые выделения у женщин как сопли после месячных
• 
  Уреаплазма выделения у женщин
• 
  Правила обработки белья загрязненного выделениями больного
• 
  Клотримазол выделения розовые
• 
  Как меняются выделения после зачатия
• 
  Серозные выделения как выглядят