• Выделение днк из биологического материала


    Методы выделения ДНК и РНК из биологического материала

    Методы выделения ДНК из биологического материала


    Выделение ДНК и РНК — важный шаг подготовки проб перед биохимическими и диагностическими процессами. Амплификация, проведение обратной транскрипции, детектирование накопления продуктов амплификации методом ПЦР в реальном времени, клонирование, секвенс, гибридизация, синтез ДНК и т. д., не могут быть выполнены непосредственно на биологических образцах без предварительного выделения (экстракции) нуклеиновых кислот (НК) и их последующей очистки.

    Почему так важно получить высококачественную ДНК?

    Так как в ветеринарной клинической практике наиболее используемым методом является ПЦР в реальном времени (или, в некоторых случаях, классическая ПЦР), рассмотрим методы выделения НК и их особенности будут рассмотрены именно с точки зрения данного вида анализа.

    Механизм ПЦР.

    Как известно, ПЦР (полимеразная цепная реакция) представляет собой реакцию синтеза комплементарной цепочки ДНК на ДНК матрице, катализируемую ферментом ДНК-зависимой ДНК-полимеразой. Фермент термостабильный – он может выдерживать высокие температуры, необходимые на этапе денатурации. Оптимум работы полимеразы составляет около 72°C. Для создания оптимальных условий синтеза образец ДНК помещается в так называемую реакционную смесь (РС).

    Реакционная смесь состоит:

    1. Буфер для ПЦР. Это буферный раствор с определенным значением pH и концентрацией различных солей и кофакторов, необходимых для работы полимеразы. В наше время компании-производители реактивов для ПЦР предлагают к своим полимеразам фирменные буферы.
    2. ДНК-зависимая ДНК-полимераза. Катализатор реакции, чаще всего выделяется из термофильной бактерии Thermus aquaticus (Taq-полимераза).
    3. Нуклеотидтрифосфаты (dNTPs). Раствор мононуклеотидтрифосфатов (dATP, dCTP, dTTP, dGTP) в свободном виде, которые служат «строительным материалом» для синтеза ампликонов.
    4. Праймеры. Короткие синтезированные последовательности ДНК (олигонуклеотиды), фланкирующие исследуемые участки ДНК – от них полимераза начинает свою работу.
    5. MQ вода. Дистиллированная и деионизированная вода, пригодная для молекулярно-генетических исследований. Используется для доведения реакционной смеси до рабочей концентрации.
    6. ДНК. Собственно, сам образец ДНК, который необходимо исследовать.

    При должном качестве всех компонентов реакционной смеси реакция может ингибироваться только из-за плохой очистки ДНК. Ингибиторы ПЦР представляют собой вещества, способные повлиять на конформацию фермента и уменьшить его активность, вплоть до полной деактивации. Эти примеси могут оказаться в растворе ДНК по двум причинам:

    1.  Плохая очистка образца от остатков веществ, которые содержались в материале, из которого производилось выделение. Ингибировать ПЦР могут остатки жиров, белков, углеводов, пигментов (для растительных клеток – хлорофиллы, каратиноиды, антоцианы, для животных – гемоглобин и др.). Сюда же относятся и вещества, которые были использованы в качестве транспортной или консервационной среды для образца (ЭДТА, гепарин, формальдегид).
    2. Плохая очистка образца от реагентов, которые были использованы в процессе выделения. Сильно ингибируют ПЦР детергенты (ПАВ) и денатуранты, такие как SDS (додецилсульфат натрия) и мочевина; спирты и другие неполярные растворители, которые содержатся в экстрагентах и отмывочных буферах (этанол, изопропанол, фенол и др.).

    Список некоторых веществ, которые могут негативно повлиять на эффективность ПЦР, показан в таблице 1.

    Таблица 1. Некоторые ингибиторы процесса ПЦР

    Ингибитор Концентрация ингибитора
    SDS > 0.005%
    Фенол > 0.2%
    Этанол > 1%
    Изопропанол > 1%
    Ацетат натрия > 5 mМ
    Хлористый натрий > 25 mМ
    EDTA > 0.5 mМ
    Гемоглобин > 1  мг/мл
    Гепарин > 0.15 i.m/мл
    Мочевина > 20 mМ
    Агароза (при выделении ДНК из геля) > 1%
    РНК > 0,5 мкг/20мкл
    Реакционная смесь > 15%

     

    Из этого можно сделать вывод, что ключевыми факторами успешного выделения НК является грамотная подготовка материала, правильный выбор метода экстракции и точное соблюдение требований протокола выделения.

    Какие требования предъявляются к материалу для выделения нуклеиновых кислот?

    Прежде всего, биологические образцы должны быть взяты в достаточном количестве для проведения анализа, кроме того, образца должно хватить для проведения повторного анализа. При этом необходимо учитывать вариации содержания НК в различных органах и тканях, а также уменьшение содержания НК из-за деградации, если образец был взят через большой промежуток времени после смерти животного.

    Экстракцию нуклеиновых кислот следует начинать как можно скорее после отбора свежих тканей. Ткань может храниться в условиях низкой температуры в холодильнике в течение нескольких дней без риска деградации НК. Однако, если выделение невозможно в ближайшее время, образец должен быть заморожен до температуры от -20°C до -80°C. При этом целесообразно использовать для хранения и перевозки образцов одноразовую пластиковую пробирку или другие плотно закрывающиеся емкости.

    После экстракции целесообразно проверить качество выделенной НК, например, измерить концентрацию с помощью флюориметра/спектрофотометра, провести гель-электрофорез или ПЦР со специальными праймерами – факторами элонгации.

    Обзор методов выделения НК

    Выделение нуклеиновых кислот – один из базовых методов молекулярной биологии. В прошлом процесс выделения и очистки НК был сложным, времязатратным, трудоемким и имел ограничения с точки зрения скорости обработки образцов. На сегодняшний день имеется множество специализированных методик, которые могут использоваться для выделения нуклеиновых кислот с высокой степенью очистки. Их можно условно разделить на две группы: осаждение НК на суспензионный носитель и выделение на колонках. Безусловно, традиционные методы выделения являются надежными и прошли испытание временем, но сейчас на рынке имеется широкий ассортимент товаров, включая полные наборы, содержащие большинство реагентов, необходимых для выделения нуклеиновых кислот. Однако, большинство из них все же требует многократных этапов центрифугирования, которые сопровождаются удалением супернатанта (прим. фаза дисперсионной системы, которая располагается сверху от границы раздела фаз).
    В последний годы повысился спрос на автоматические системы. Разработанные для средних и крупных лабораторий, они являются альтернативой трудоемкому ручному методу. Данная технология значительно повышает производительность лаборатории. При этом выход НК и чистота материала, воспроизводимость и прогностичность эксперимента будут максимальными (так же как скорость, точность и надежность анализа в целом), а риск кросс-контаминации (перекрестного заражения) минимизируется.

    Фенол-хлороформная экстракция (Guanidinium Thiocyanate-Phenol-Chloroform Extraction).

    Обычно протокол выделения нуклеиновых кислот включает следующие этапы: 1.) клеточный лизис, в результате которого разрушаются клеточные структуры и образуется лизат, 2.) инактивацию нуклеаз клетки, таких как ДНКаза и РНКаза, 3.) выделение искомой нуклеиновой кислоты из клеточного дербиса. Экстракция с помощью смеси фенол-хлороформ – один из наиболее старых, но, тем не менее, широко используемых методов выделения нуклеиновых кислот.
    Несмотря на то, что фенол – легковоспламеняющееся, коррозионное и токсичное для человека вещество, он способен очень активно денатурировать белки, но не полностью инактивирует РНКазы. Эту проблему можно решить, используя смесь фенол : хлороформ : изоамиловый спирт (в пропорции 25:24:1).
    При смешивании фенола и хлороформа образуется двухфазная эмульсия. После центрифугирования гидрофобный слой эмульсии, в котором собираются белки, липиды и углеводы, оседает на дно, а гидрофильный остается сверху. Отбирается верхняя фаза, содержащая ДНК, после чего ДНК осаждают из супернатанта путем добавления этанола или изопропанола в соотношении 2:1 или 1:1 на фоне высокой концентрации солей в лизате. Соли – обычные примеси в образцах нуклеиновых кислот, поэтому их всегда необходимо удалять из образца перед любыми последующими процессами и планируемыми анализами. Следовательно, для обессоливания образца, содержащего нуклеиновую кислоту, требуется одна или несколько стадий отмывки.
    Осажденную ДНК выделяют путем повторного центрифугирования, причем избыток солей вымывается с помощью 70%-го этилового спирта, а центрифугирование необходимо для удаления супернатанта – этанола. Затем осажденную ДНК растворяют с помощью ТЕ-буфера или MQ-воды.

    FTA-карты.

    В данной методике нуклеиновые кислоты выделяются прямо на специальной бумаге, пропитанной смесью реагентов, связывающих ДНК. Для выделения достаточно нанести каплю образца на карту, после чего нанести на нее буфер для выделения и высушить. В дальнейшем, карту можно разрезать на фрагменты и загружать прямо в пробирку для ПЦР. Данный метод подходит только для жидких образцов и не пригоден для ПЦР в реальном времени, однако по времени анализа ему нет равных.

    С помощью коммерческих наборов (KITs)

    Для выделения НК возможно подготовить высококачественные образцы для анализа прямо «из коробки». По сравнению с традиционными методами они обеспечивают более быстрое и менее трудоемкое выделение. Многие затруднения, свойственные фенол-хлороформной экстракции, например, неполное разделение фаз, в данном случае исключены. В процессе выделения твердая фаза системы (сорбент) адсорбирует на себя нуклеиновые кислоты в зависимости от pH и ионной силы буфера. Процесс адсорбции основывается на следующих принципах: образование водородных связей с гидрофильной матрицей в хаотропных условиях, с последующим ионным обменом в жидкой среде с помощью анионообменника посредством отбора молекул по их афинности и размеру. В большинстве случаев твердофазная экстракция осуществляется с использованием колонки для очистки ДНК (spin column), через которую проходит лизат под воздействием центробежной силы. По сравнению с традиционными способами очистки данный метод имеет преимущество в скорости работы. В качестве носителя используются силикатные носители (силика), стеклянные частицы, диатомит и анионообменные носители.

    Протокол твердофазной экстракции включает четыре ключевых шага: клеточный лизис; адсорбцию нуклеиновых кислот, отмывку и десорбцию (элюцию). Исходным этапом является установка колонки для адсорбции образца. Подготовка колонки производится с использованием буфера с определенным pH – для того, чтобы придать поверхностным структурам (или функциональным группам) сорбента необходимые свойства – только в таком случае ДНК или РНК будут «налипать» на носитель. Следующий шаг – образец, расщепленный с помощью лизирующего буфера, помещают на колонку. Искомая нуклеиновая кислота адсорбируется на колонке за счет высокого pH и концентрации солей в связывающем растворе (binding solution). Прочие составляющие, такие как белки, также могут образовывать прочные специфические соединения с поверхностью колонки. Эти нежелательные примеси можно удалить на стадии промывания, используя промывочный буфер (wash buffer), который содержит вещества, не дающие им адсорбироваться. Для того, чтобы высвободить нуклеиновую кислоту с колонки на стадии десорбции, используется ТЕ-буфер или MQ-вода.
    Так называемые селективные носители (mixed-bed solid phases) представляют собой смесь по крайней мере двух различных сорбентов, которые могут быть твердыми или полутвердыми, пористыми или непористыми. Каждый из них способен связываться с целевой нуклеиновой кислотой при определенных условиях.

    Силикатные носители (Силика, Silica Matrices).

    Основой для большинства наборов для выделения и очистки нуклеиновых кислот, являются уникальные свойства силиконовых носителей для селективного связывания НК. К таким относятся стеклянные шарики и микроволокна, силикатные частицы, а также диатомовая земля (диатомит).
    Сюда же можно отнести носители из гидроокиси кремния (hydrated silica matrix), которые изготовливают путем нагревания смеси из диоксида кремния и гидроксида натрия (либо гидроксида калия) в молярном соотношении от 2:1 до 10:1 в течение 48 часов. ДНК связывается с неорганическим носителем и высвобождается при элюции. Принцип очистки нуклеиновых кислот с помощью силикатных носителей базируется на высокой афинности отрицательно заряженного остова ДНК к положительно заряженным силикатным частицам. Натрий играет роль катионного мостика, который притягивает отрицательно заряженный кислород в фосфатном «скелете» нуклеиновой кислоты. В условиях высокой ионной силы (pH ≤ 7) катионы натрия разрушают водородные связи между водородом воды и отрицательно заряженными ионами кислорода в силикатном материале. В этих условиях ДНК тесно связывается с носителем, а интенсивное промывание позволяет удалить все нежелательные примеси. Очищенные молекулы ДНК могут быть десорбированы позже, уже при низкой ионной силе раствора (pH ≥ 7), с использованием ТЕ-буфера или MQ-воды.
    Кроме силикатных носителей, связывать нуклеиновые кислоты способны также нитроцеллюлоза и полиамидные мембраны (polyamide membranes) (например, нейлоновые матрицы), однако они имеют меньшую специфичность.
    Вышеперечисленные материалы используются в качестве транспортировочных и гибридизационных носителей для твердофазной экстракции НК. Полиамидные носители более долговечны, чем целлюлозные, и способны необратимо связывать нуклеиновые кислоты. Нуклеиновые кислоты могут быть иммобилизованы на полиамидных сорбентах при низкой ионной силе буферного раствора.

    Стеклянные носители (Glass Particle).

    Для очистки нуклеиновых кислот используются частицы стекла, стеклянный порошок и стеклянные шарики. Адсорбция нуклеиновых кислот на стеклянный субстрат базируется на тех же принципах, что адсорбционная хроматография.
    Очистка нуклеиновых кислот также может осуществляться на силикагеле и стеклянной суспензии в присутствии раствора хаотропных солей.

    Диатомит.

    Диатомовая земля, известная также как кизельгур или диатомит, содержит до 94% кремния. Применяемая для фильтрации и в хроматографии, она подходит и для очистки плазмидной и ядерной ДНК. Впоследствии ДНК, связанная с диатомитом, вымывается с помощью спиртосодержащего буфера. Потом буфер сливается, а ДНК элюируется.

    Очистка нуклеиновых кислот с использованием магнитных микроносителей (Magnetic Bead Based Nucleic Acid Purification).

    Магнитная сепарация – современный, простой и эффективный способ очистки нуклеиновых кислот. Удобство данного метода заключается в том, что, намагниченные частицы могут быть удалены с помощью постоянного магнита. К стенке пробирки прикладывают магнит, благодаря чему происходит агрегация частиц вблизи него, после чего оставшуюся часть образца выливают. То есть не требуется ни органических растворителей, ни многократного центрифугирования, вакуумной фильтрации или осаждения на колонках. Часто для процесса выделения используют магнитные носители с иммобилизованными аффинными лигандами или носители, полученные из биополимера с аффинностью к целевой нуклеиновой кислоте. К таким относятся магнитные частицы, полученные из различных синтетических полимеров, биополимеров, пористого стекла или на основе неорганических магнитных материалов (например, поверхностно-модифицированный оксид железа).
    Для более эффективного связывания нуклеиновых кислот предпочтительно использовать материалы с большой суммарной площадью поверхности. Магнитные материалы в виде шариков (beads) более предпочтительны из-за их большей связывающей способности, так как НК буквально «оборачиваются» вокруг круглых частиц.
    Существует метод выделения НК с помощью инкапсулированных в полимер магнитных частиц. Чаще всего для этих целей используют целлюлозу, а в качестве магнитного компонента – оксиды железа или никеля. Особенность данного метода заключается в том, что нуклеиновые кислоты малого размера требуют более высоких концентраций солей для прочного связывания с модифицированными магнитными частицами. Следовательно, концентрацию соли можно избирательно изменять, чтобы высвободить связанную нуклеиновую кислоту нужного размера.

    Анионообменные смолы.

    Анионообменные смолы – класс носителей, в которых используется принцип анионного обмена. Он основан на взаимодействии между положительно заряженными группами диэтиламиноэтилцеллюлозы (DEAE) на поверхности смолы и отрицательно заряженными фосфатными группами ДНК-скелета. Анионообменная смола состоит из силикатных гранул с большим размером пор и гидрофильного поверхностного слоя. Большая суммарная площадь поверхности смолы обеспечивает плотное соединение DEAE-групп с НК. Смола работает в широком диапазоне рН (рН=6-9) и/или концентрации солей (0,1-1,6 М). Благодаря этому такие примеси, как белок и РНК вымываются из смолы с при использованием буферов со средней ионной силой, в то время как ДНК остается связанной с ней до этапа элюирования буфером с высокой ионной силой.

    Подводя итог, можно заключить, что современный рынок материалов для выделения нуклеиновых кислот характеризуется большим разнообразием. Все методики позволяют получать высококачественные образцы, пригодные для клинических исследований, однако следует учитывать условия работы лаборатории (вид анализов, количество образцов, цены на услуги лаборатории и т.д.), и тогда практический и экономический эффект выбранного метода будет максимальным.

    Методы выделения ДНК и РНК из биологического материала

    Методы выделения нуклеиновых кислот

    Практически все научные исследования в области молекулярной биологии на той или иной стадии включают этап выделения нуклеиновых кислот. Выделенные нуклеиновые кислоты затем используют в ПЦР (ОТ-ПЦР), секвенировании и для множества других задач, причем технологии выделения различаются не только по принципу своего действия, но и в зависимости от типа биоматериала и последующего применения экстракта.

    Впервые нуклеиновые кислоты пытались выделить в середине XIX века, когда ещё практически ничего не было известно об этих молекулах. Однако с момента открытия структуры и свойств ДНК технологии её выделения непрерывно модифицируются и совершенствуются. Рассмотрим самые распространенные и прогрессивные методики, используемые для экстракции нуклеиновых кислот.

    Выделение фенол-хлороформом

    Первое упоминание об использовании этого метода встречается в статьях с 1967 года, и с тех пор эта технология является одним из самых распространённых способов выделения нуклеиновых кислот в большинстве исследовательских лабораторий.

    Суть методики заключается в смешивании клеточного лизата с фенолом, хлороформом и изоамиловым спиртом в определенных пропорциях и последующем перемешивании и центрифугировании смеси.

    При выделении нуклеиновых кислот из сложных исходных образцов, таких как кровь или ткани, включают в себя лизис биологического материала детергентами или хаотропными агентами иногда в присутствии разрушающих белки ферментов. После этого этапа следуют несколько стадий, в которых используются органические растворители, такие как Фенол/Хлороформ или Тризолом с последующим осаждением в Изопропиловом спирте. Полное отделение белков от нуклеиновых кислот может быть достигнуто добавлением перхлората натрия.

    При перемешивании клеточного лизата и фенола формируются две фазы: водная и органическая, причем все липиды и жиры находятся в органической (нижней) фазе, белки — на границе фаз, а нуклеиновые кислоты — в водной (верхней) фазе. Для повышения чистоты экстракта эти действия повторяют несколько раз. Если раствор будет иметь низкий pH, то ДНК перейдёт в органическую фазу, а РНК останется в водной фазе, что позволяет выделять РНК отдельно от ДНК. Дополнительно можно попробовать селективное инкубирование с хлоридом лития или специфичное безнуклеазное изолирование с гуанидин хлоридом или гуанидин тиоцианатом, скомбинированное с фенольной экстракцией или этанольной преципитацией. Стандартная методика получения чистого препарата основана на том, что ДНК является полярной молекулой и не растворяется в органических растворителях.

    Данный метод используется повсеместно, поскольку он не требует дополнительного сложного оборудования и имеет невысокую стоимость. Однако этот метод ориентирован на работу с такими агрессивными веществами, как фенол и хлороформ, и присутствуют стадии центрифугирования и жидкостной экстракции, которые нельзя автоматизировать. Также весь протокол занимает достаточно много времени.

    Сорбционная экстракция на поверхности silica и silica-spin колонках.

    Сорбционная экстракция – методика, в основе которой лежит избирательная сорбция на поверхности silica в присутствие хаотропной соли. Ингибиторы и другие компоненты клинического материала остаются в растворе. С помощью центрифугирования силика с НК осаждается, а супернатант c ингибиторами ПЦР удаляется. Серия последующих отмывок обеспечивает получение высокоочищенного препарата НК.

    Технология выделения на silica-spin колонках — это усовершенствованный метод экстракции на частичках silica, предложенный американскими учёными в 1979 году. Метод колоночного выделения использует то же свойство нуклеиновых кислот адгезироваться на поверхности материала silica в присутствии хаотропных ионов, и легко смываться в их отсутствии. Данный метод пришел из органической химии, где на первых этапах набивались стеклянные колонки различными материалами, в том числе silica, потом ДНК и РНК смывались, и далее колонка разбиралась и набивалась заново. Чтобы исключить эти трудоемкие этапы, было предложено использовать одноразовые пластиковые колонки, уже с прослойкой silica-мембраны, которые идеально подходят по размеру к обычным пробиркам эппендорф на 1,5 и 2 мл. Спин-колонки сконструированы таким образом, что при нанесении клеточного лизата на колонку и последующем центрифугировании ДНК остаётся на колонке, а всё лишнее проходит сквозь неё. Затем ДНК промывают несколько раз и элюируют в пробирку для сбора образца.

    Чаще всего для лизиса используются хаотропные агенты, например гуанидин тиоцианат, которые дестабилизируют водородные связи, ван-дер-ваальсовы и гидрофобные взаимодействия. В таких условиях растворимость ДНК/РНК в воде снижается, а белки денатурируют. Кроме хаотропных солей в лизирующем буфере чаще всего присутствуют детергенты, которые способствуют растворению и лизису белков.

    Хаотропная соль необходима не только для лизиса, но и для процесса сорбции нуклеиновых кислот. Также для усиления процесса сорбции в некоторых протоколах рекомендуют добавлять спирт. Нужно отметить, что сорбция ДНК на силике под действием хаотропных солей – процесс, который по-прежнему вызывает много споров. Однако среди всех существующих точек зрения на процесс взаимодействия ДНК с силикой можно выделить несколько основных.

    Первая точка зрения состоит в том, что сорбция ДНК на силике происходит за счёт образования катионных мостиков между силанольными группами, расположенными на поверхности силики и фосфатными группами ДНК. Известно, что в растворе при рН 6 – 8 поверхность силики отрицательно заряжена, как и фосфатные группы НК. Из-за электростатического отталкивания взаимодействие между ними невозможно. Однако при добавлении хаотропной соли отрицательный заряд экранируется. В таких условиях молекулы НК сорбируются на поверхности силики за счет ван-дер-ваальсовых взаимодействий.

    Вторая точка зрения опирается на свойства хаотропных агентов. Известно, что молекула НК в растворе покрыта гидратной оболочкой. Попадая в раствор, молекулы хаотропной соли активно разрушают водородные связи, присоединяя к себе воду. В итоге молекула ДНК, лишённая своей гидратной оболочки, становится гидрофобной. То же самое происходит с поверхностью силики. В итоге между ДНК и силикой возникают гидрофобные взаимодействия, и идёт процесс сорбции.

    Согласно еще одной точке зрения основным механизм взаимодействия ДНК и силики является образование водородных связей между водой и молекулами НК. Подобные выводы были сделаны после выявления зависимости между количеством адсорбированной ДНК и диаметром пор силики.

    Предполагается, что сорбция происходит за счет взаимодействия гидратных оболочек образованных поверхностью поры и молекул НК. Авторы подчеркивают, что НК лишь частично включается в поры, а основная часть молекул торчит на поверхности. В данной теории не ясным остаётся роль хаотропных солей, присутствующих в растворе. Вследствие этого наиболее вероятными вариантами механизма сорбции представляются первые два, которые являются взаимодополняющими.

    Необходимо также отметить, что процесс сорбции лучше всего идет при высокой ионной силе раствора, показателях рН 3,5-6,5 (оптимум рН 5) и температуре выше 37 °С.

    Преимущества такого метода заключаются в повышенной чистоте и хорошем качестве выделенных нуклеиновых кислот, высокой воспроизводимости и простоте по сравнению с выделением фенол-хлороформом. Однако также большое количество манипуляций может привести к контаминации, а выделение коротких фрагментов ДНК на спин-колонках может быть затруднено.

    Экстракция на спин-колонках может занять от 20 минут в зависимости от биоматериала и сложности его лизиса. Стоимость одного выделения здесь значительно выше, чем у предыдущего метода, поскольку на каждую реакцию необходима своя колонка, несколько пробирок для сбора фильтрата и элюата и, конечно, реагенты.

    Спиртовое осаждение нуклеиновых кислот

    После осаждения спиртом нуклеиновые кислоты отделяется от раствора центрифугированием. Осадок, содержащий целевую НК, отмывается 70% этиловым спиртом с последующим центрифугированием. После удаления супернатанта осадок подсушивается и растворяется в водном буфере. Роль соли в протоколе экстракции состоит в том, что её положительно заряженные ионы нейтрализуют отрицательный заряд на сахаро-фосфатном скелете НК, приводя к снижению растворимости последних в воде. В водном растворе электростатическое притяжение положительно заряженных ионов и отрицательно заряженных фосфатных групп подчиняется закону Кулона и зависит от диэлектрической константы раствора. Вода имеет большую диэлектрическую константу, что затрудняет взаимодействие ионов, тогда как этанол с гораздо более низкой диэлектрической константой способствует взаимодействию положительно заряженного иона и фосфатной группы, что приводит к выпадению НК в осадок. Нужно отметить, что НК менее растворима в изопропаноле, чем в этаноле, соответственно для ее осаждения требуются меньшая концентрации изопропанола (для выпадения НК в осадок достаточно присутствия 35 % изопропанола и 0,5 М соли, в то время как этанола требуется около 75% при той же концентрации соли). Таким образом, к образцу изопропанола необходимо добавлять 0,7-1 объема образца, а этанола 2,-2,5 объема. Следовательно, изопропанол предпочтительнее использовать, если есть ограничения по объему используемого пластика (например, есть возможность добавить только один объем образца). В ряде протоколов экстракции предлагается проводить осаждение (преципитацию) НК при пониженной температуре (-20°С). Однако, есть исследователи не согласные с этой теорией; по результатам их экспериментов температура инкубации со спиртом не имеет значительного влияния на выход продукта. Главенствующая роль, по их мнению, должна быть отведена продолжительности центрифугирования.

    При выделении малых количеств НК (менее 100 нг) для визуализации осадка и улучшения процесса преципитации рекомендуется использовать соосадители, такие как гликоген, линейный полиакриломид или декстран. В некоторых протоколах экстракции предлагается добавлять соосадители непосредственно к осадителю (этанолу или изопропанолу). Делать этого, однако, не следует, так как соосадитель, попадая непосредственно в спирт, начинает образовывать центры нуклеации в отсутствие НК и, соответственно, при последующем смешивании с образцом в меньшей степени способствует агрегации НК. Соосадитель, таким образом, следует добавлять непосредственно в лизирующий буфер или к образцу.

    На предпоследнем этапе выделения ДНК проводится добавление 70% этанола для отмывки осадка от остатков солей. Важно, чтобы отмывка проводилась именно водным раствором спирта, так как соли хорошо растворяются в воде и в гораздо меньшей степени в спирте. Кроме того, использование 70% этанола препятствует переходу НК в водную фазу.

    На завершающем этапе процедуры происходит растворение НК в водном буфере обычно при температуре 56-65°С и вортексировании, что необходимо для лучшего растворения осадка.

    Выделение на магнитных частицах

    Спустя 20 лет после появления метода выделения на спин-колонках начинает набирать популярность более быстрый способ выделения на магнитных частицах 6. Технология этого способа выделения основана на связывании нуклеиновой кислоты с веществом, покрывающим магнитные частицы (целлюлоза, сефадекс, сефакрил, dT-олигонуклеотиды, специфичные олигонуклеотиды и др.). К клеточному лизату добавляют такие магнитные частицы и перемешивают для связывания ДНК с ними. После этого пробирку ставят в магнитный штатив или подносят к магниту, фиксируя таким образом твердую фазу. После отбора супернатанта нуклеиновые кислоты на частицах промывают и элюируют.

    Этот метод имеет те же преимущества, что и выделение на спин-колонках, но для экстракции на магнитных частицах не требуется сложное лабораторное оборудование (например, центрифуга). Более того, процесс выделения на магнитных частицах легко автоматизировать, и многие автоматические станции выделения основаны именно на этой методике 3. Однако здесь также присутствует риск контаминации и потерь образца.

    Данный протокол выделения займет немного меньше времени благодаря отсутствию этапов центрифугирования, но количество манипуляций будет примерно таким же. Также стоимость одной реакции обычно выше, чем при выделении на колонках, а панели наборов предоставляют Qiagen, Analytik Jena,  ThermoFisher и другие.

    Ферментативное температурно-зависимое выделение

    Все вышеперечисленные методики имеют общую лимитирующую стадию — этап лизиса. Во всех технологиях используется SDS и протеиназа K для разрушения клеточных стенок и высвобождения нуклеиновых кислот. SDS является ингибитором ПЦР, именно поэтому необходимы множественные стадии промывки, которые повышают риск контаминации и приводят к потерям образца. Также более сложные для лизиса образцы могут требовать дополнительную долгую и трудозатратную пробоподготовку.

    Клинический образец помещается в пробирку с лизирующим буфером, затем подвергается термической обработке, в процессе которой происходит деструкция клеточных мембран, вирусных оболочек и других биополимерных комплексов и высвобождение НК. С помощью последующего центрифугирования нерастворимые компоненты осаждаются на дне пробирки, а надосадочная жидкость (супернатант), содержащая ДНК, используется для проведения ПЦР.

    Данная технология оптимальна для работы с малым количеством биоматериала, поскольку нет потерь нуклеиновых кислот. Также эту методику легко автоматизировать, она самая быстрая среди всех упомянутых способов выделения (от 7 минут) и включает меньше всего манипуляций. Стоимость одной реакции невысока, поскольку кроме реагентов не требуется никаких специальных расходных материалов.

    Разработки наборов для выделения нашей компании.

    На данный момент в нашей компании ВМТ разрабатываются наборы для пробоподготовки на основе всех трех подходов к экстракции НК:

    • Набор на основе сорбционной экстракции. Эту надежную, проверенную, хорошо работающую методику, нашедшую широкое применение в клинической практике мы адаптировали для выделения геномной ДНК из цельной крови и сыворотки.
    • Набор на основе спиртового осаждения. Эту надежную, проверенную, хорошо работающую методику, нашедшую широкое применение в клинической практике мы адаптировали для выделения геномной ДНК из цельной крови и сыворотки.
    • Набор для выделения нуклеиновых кислот методом сорбции на silica-spin колонках – наиболее интересная и перспективная разработка.

     

    Топ-5 современных методик выделения нуклеиновых кислот

    Впервые нуклеиновые кислоты пытались выделить в середине XIX века, когда ещё практически ничего не было известно об этих молекулах. Однако с момента открытия структуры и свойств ДНК технологии её выделения непрерывно модифицируются и совершенствуются. В данной статье рассматриваются самые распространенные и прогрессивные методики, используемые для экстракции нуклеиновых кислот.

    Выделение фенол-хлороформом

    Рис.1. Схема протокола выделения фенол-хлороформным методом.

    Первое упоминание об использовании этого метода встречается в статье 1967 года 1, и с тех пор эта технология является одним из самых распространённых способов выделения нуклеиновых кислот.

    Суть методики заключается в смешивании клеточного лизата с фенолом, хлороформом и изоамиловым спиртом в пропорции 25:24:1 и последующем перемешивании и центрифугировании смеси. После проведения этих манипуляций получается раствор с двумя фазами: водной и органической, причем все липиды и жиры находятся в органической (нижней) фазе, белки — на границе фаз, а нуклеиновые кислоты — в водной (верхней) фазе 2 (Рис.1). Для повышения чистоты экстракта эти действия повторяют несколько раз. Если раствор будет иметь низкий pH, то ДНК перейдёт в органическую фазу, а РНК останется в водной фазе, что позволяет выделять РНК отдельно от ДНК.

    Данный метод используется повсеместно, поскольку он не требует дополнительного сложного оборудования и имеет невысокую стоимость. Однако нуклеиновые кислоты, полученные таким образом, обладают невысоким качеством и зачастую требуют дополнительной очистки. Также эта технология имеет существенно меньший выход нуклеиновых кислот в сравнении с другими методиками.

    Помимо качества экстракта, этот метод обладает ещё несколькими недостатками: он требует сложных манипуляций, которые могут привести к контаминации и потере образца, а сам процесс трудно автоматизировать. Также весь протокол занимает достаточно много времени 3

    Выделение на спин-колонках

     

    Рис.2. Схема протокола выделения на спин-колонках.

    Технология выделения на спин-колонках — это усовершенствованный метод экстракции на частичках силики, предложенный американскими учёными в 1979 году 4. Они продемонстрировали, что в щелочных условиях и при повышенных концентрациях соли ДНК связывается с силикатами, и это позволяет отделить все остальные компоненты клетки от частиц силики со связанной ДНК. Спин-колонки сконструированы таким образом, что при нанесении клеточного лизата на колонку и последующем центрифугировании ДНК остаётся на колонке, а всё лишнее проходит сквозь неё (Рис.2). Затем ДНК промывают несколько раз и элюируют в пробирку для сбора образца.

    Преимущества такого метода заключаются в повышенной чистоте и хорошем качестве выделенных нуклеиновых кислот, высокой воспроизводимости и простоте по сравнению с выделением фенол-хлороформом. Однако также большое количество манипуляций может привести к контаминации, а выделение коротких фрагментов ДНК на спин-колонках может быть затруднено 5.

    Экстракция на спин-колонках может занять от 20 минут в зависимости от биоматериала и сложности его лизиса. 

    На рынке этот метод представлен большим разнообразием наборов от таких производителей, как Qiagen, Analytik Jena, NEB, ThermoFisher и других. Стоимость одного выделения здесь значительно выше, чем у предыдущего метода, поскольку на каждую реакцию необходима своя колонка, несколько пробирок для сбора фильтрата и элюата и, конечно, реагенты.

    Выделение на магнитных частицах

     

    Рис.3. Схема протокола выделения на магнитных частицах.

    Спустя 20 лет после появления метода выделения на спин-колонках начинает набирать популярность более быстрый способ выделения на магнитных частицах 6. Технология этого способа выделения основана на связывании нуклеиновой кислоты с веществом, покрывающим магнитные частицы (целлюлоза, сефадекс, сефакрил, dT-олигонуклеотиды, специфичные олигонуклеотиды и др.). К клеточному лизату добавляют такие магнитные частицы и перемешивают для связывания ДНК с ними. После этого пробирку ставят в магнитный штатив или подносят к магниту, фиксируя таким образом твердую фазу. После отбора супернатанта нуклеиновые кислоты на частицах промывают и элюируют 7 (Рис.3).

    Этот метод имеет те же преимущества, что и выделение на спин-колонках, но для экстракции на магнитных частицах не требуется сложное лабораторное оборудование (например, центрифуга). Более того, процесс выделения на магнитных частицах легко автоматизировать, и многие автоматические станции выделения основаны именно на этой методике 3. Однако здесь также присутствует риск контаминации и потерь образца.

    Данный протокол выделения займет немного меньше времени благодаря отсутствию этапов центрифугирования, но количество манипуляций будет примерно таким же. Также стоимость одной реакции обычно выше, чем при выделении на колонках, а панели наборов предоставляют Qiagen, Analytik Jena,  ThermoFisher и другие.

    Умное выделение (Smart Extraction)

    Рис.4. Схема протокола умного выделения. Протокол основан на принципе работы наборов для выделения компании Analytik Jena.

    Методики выделения нуклеиновых кислот не перестают совершенствоваться: в 2005 году специалисты из компании Analytik Jena доказали, что для связывания нуклеиновых кислот с неорганической твёрдой фазой можно использовать не только хаотропные соли, но и смесь из хаотропных и нехаотропных солей с низкой ионной силой, эту технологию они назвали Dual Chemistry 8.

    Позднее они усовершенствовали технологию Dual Chemistry при помощи немагнитных частиц с «умной» поверхностью 9. Для выделения используются специальные наконечники с этими частицами, которые надеваются на дозатор. При заборе клеточного лизата в наконечник нуклеиновая кислота из раствора связывается с частицами, затем следуют этапы промывки и элюции, в результате чего получается очищенная нуклеиновая кислота высокого качества (Рис.4).

    Эта технология значительно ускоряет процесс выделения, а благодаря особенностям «умной» поверхности выход и качество нуклеиновых кислот значительно превосходит все предыдущие методы. Данный способ экстракции очень легко автоматизировать, ведь носики со связывающими частицами подходят как для обычных лабораторных дозаторов, так и для различных автоматических станций выделения нуклеиновых кислот.

    Ферментативное температурно-зависимое выделение

     

    Рис.5. Схема протокола ферментативного температурно-зависимого выделения. Протокол основан на принципе работы наборов для выделения компании MicroGEM. * — несмотря на невысокую степень очистки, образец отлично подходит для дальнейшего использования в ПЦР, секвенировании и STR.

    Все вышеперечисленные методики имеют общую лимитирующую стадию — этап лизиса. Во всех технологиях используется SDS и протеиназа K для разрушения клеточных стенок и высвобождения нуклеиновых кислот. SDS является ингибитором ПЦР, именно поэтому необходимы множественные стадии промывки, которые повышают риск контаминации и приводят к потерям образца. Также более сложные для лизиса образцы могут требовать дополнительную долгую и трудозатратную пробоподготовку.

    Специалисты из новозеландской компании MicroGEM ликвидировали проблемы, связанные с длительным и сложным лизисом и использованием вредных химикатов, благодаря применению очень эффективной термофильной протеиназы EA1 вместе с мезофильными гидролазами 10.

    Процесс ферментативного температурно-зависимого выделения начинается со смешивания буфера и ферментов с образцом. При последующей инкубации при комнатной температуре гидролазы деградируют клеточные стенки. После этого пробирку нагревают до 75°C, что активирует работу протеиназы EA1, которая разрушает все белки и высвобождает нуклеиновые кислоты. Последующее нагревание до 95°C дезактивирует EA1, и после этого образец готов для дальнейшего исследования (Рис.5). Для особо загрязненных образцов вроде почвы или растений можно добавить этап очистки на колонке для избавления от ингибиторов.

    Данная технология оптимальна для работы с малым количеством биоматериала, поскольку нет потерь нуклеиновых кислот. Также эту методику легко автоматизировать, она самая быстрая среди всех упомянутых способов выделения (от 7 минут) и включает меньше всего манипуляций. Стоимость одной реакции невысока, поскольку кроме реагентов не требуется никаких специальных расходных материалов.

    Обзор подготовлен при поддержке компании SkyGen — официального дистрибьютора продукции Analytik Jena, MicroGEM, Qiagen, NEB и других производителей.

    Источники

    1. Rae, P. M. M., Barnett, T. R. & Babbitt, D. G. Factors influencing the yield of satellite DNA in extractions from Drosophila virilis and Drosophila melanogaster adults and embryos. BBA Sect. Nucleic Acids Protein Synth. (1976) doi:10.1016/0005-2787(76)90157-X.

    2. Patrinos, G. P., Danielson, P. B. & Ansorge, W. J. Molecular Diagnostics: Past, Present, and Future. in Molecular Diagnostics: Third Edition (2016). doi:10.1016/B978-0-12-802971-8.00001-8.

    3. Ali, N., Rampazzo, R. D. C. P., Costa, A. Di. T. & Krieger, M. A. Current Nucleic Acid Extraction Methods and Their Implications to Point-of-Care Diagnostics. BioMed Research International (2017) doi:10.1155/2017/9306564.

    4. Vogelstein, B. & Gillespie, D. Preparative and analytical purification of DNA from agarose. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. (1979) doi:10.1073/pnas.76.2.615.

    5. Green, M. R. & Sambrook, J. Molecular Cloning, 3-Volume Set : A Laboratory Manual. Cold Spring Harbour Laboratory Press (2012).

    6. Trevor Hawkins. DNA PURIFICATION AND ISOLATION USNG MAGNETIC PARTICLES. United States Pat. (#5,705,628 ) 9, 2989–2997 (1998).

    7. Tan, S. C. & Yiap, B. C. DNA, RNA, and protein extraction: The past and the present. Journal of Biomedicine and Biotechnology (2009) doi:10.1155/2009/574398.

    8. http://www.dual-chemistry.com/

    9. https://www.analytik-jena.com/products/kits-assays-reagents/extraction-technology/

    10. https://microgembio.com/pdqex/

    Как работают наборы для выделения ДНК

    В наши дни большинство лабораторий используют коммерческие наборы для выделения ДНК, в которых используются спин-колонки, для выделения ДНК и РНК, которые содержат кремнеземную смолу, избирательно связывающую нуклеиновые кислоты, в зависимости от факторов, влияющих на метод экстракции. Наборы для выделения ДНК делают весь процесс намного проще и быстрее, чем старые методы, но недостатком их использования является то, что если вы не понимаете, что находится в черном ящике набора, он делает поиск проблем и ошибок намного сложнее.

    Итак, в этой статье я подробно объясню, как работают наборы для извлечения НК и что происходит на каждом этапе, а также о некоторых типичных проблемах, связанных с использованием колонок с силикагелем в экстракции ДНК, которые можно преодолеть или избежать, лишь немного разобравшись.

    Первый шаг в экстракции РНК и ДНК: лизис

    Лизирующий буфер Invitrogen ProcartaPlex

    Формулы лизиса могут варьироваться в зависимости от того, хотите ли вы извлечь ДНК или РНК, но общим знаменателем является лизирующий буфер, содержащий высокую концентрацию хаотропной соли. Хаотропы дестабилизируют водородные связи, силы Ван-дер-Ваальса и гидрофобные взаимодействия. Белки дестабилизируются, в том числе нуклеазы, нарушается связь нуклеиновых кислот с водой, что создает условия для перехода к кремнию. Хаотропные соли включают гуанидин HCl, гуанидинтиоцианат, мочевину и перхлорат лития.

    Помимо хаотропов, в буфере для лизиса обычно есть детергенты, которые улучшают солюбилизациею и лизис белка. Также могут быть ферменты, используемые для лизиса, в зависимости от типа образцов. Протеиназа К является одним из них и на самом деле очень хорошо работает в этих денатурирующих буферах; чем больше денатурирован белок, тем лучше работает протеиназа К. Лизоцим не работает при денатурировании, и поэтому обработку лизоцимом обычно проводят перед добавлением денатурирующих солей.

    Один комментарий о плазмидных препаратах: лизис сильно отличается от экстракции для выделения РНК или геномной ДНК, потому что плазмида должна быть сначала отделена от геномной ДНК, и если вы добавите хаотропы, вы высвободите все сразу и не будете иметь возможность отделить маленькую кольцевую ДНК от высокомолекулярной хромосомы. Таким образом, в плазмидных препаратах хаотропы не добавляются до тех пор, пока не происходит лизис, и соли не используются для связывания.

    После извлечения ДНК происходит очистка: связывание ДНК с колонкой

    Хаотропные соли имеют решающее значение для лизиса, а также для связывания нуклеиновых кислот с колонкой. Кроме того, для усиления и влияния на связывание нуклеиновых кислот с диоксидом кремния также добавляют спирт. В большинстве случаев это этанол, реже — изопропанол. Процент этанола и объем имеет большое значение.  Слишком много, и вы получите много разложившихся нуклеиновых кислот и мелких частиц, которые будут влиять на показания поглощения света и снижать выход эксперимента. Слишком мало – возникнут при смывании всей соли с мембраны. Важным моментом здесь является то, что этанол влияет на связывание, и добавленное количество оптимизируется для любого набора, который вы используете. Изменение этого шага может помочь изменить то, что вы восстанавливаете, поэтому, если у вас возникли проблемы и вы хотите устранить неполадки восстановления, это может быть шагом для дальнейшей оценки.

    Еще один способ диагностики проблем — сохранить поток после связывания и ускорить его, чтобы увидеть, можете ли вы найти искомые нуклеиновые кислоты. Если вы использовали SDS-содержащее моющее средство при лизисе, попробуйте использовать NaCl в качестве осадителя, чтобы избежать загрязнения ДНК или РНК моющим средством.

    Отмывка ДНК (или РНК)

    Набор для выделения геномной ДНК Invitrogen PureLink Pro 96

    Ваш лизат был центрифугирован через силикагелевую мембрану, и теперь ваша экстрагированная ДНК или РНК должна быть связана с колонкой, а примеси, белок и полисахариды должны были пройти. Но мембрана все еще загрязнена остаточными белками и солью. Если образец был взят из растений, на мембране все еще будут присутствовать полисахариды, возможно, некоторые пигменты.

    Этапы промывки служат для удаления этих примесей. Обычно есть две промывки, хотя это может варьироваться в зависимости от типа образца. Первая промывка часто содержит небольшое количество хаотропной соли для удаления белка и цветных загрязнений. За этим всегда следует промывка этанолом для удаления солей. Если в препарате недостаточно белка для начала, (плазмидные препараты или очистка продуктов Полимеразная цепная реакция), тогда необходима только промывка этанолом.

    Удаление хаотропных солей имеет решающее значение для получения высоких выходов и чистоты нуклеиновых кислот. Некоторые наборы даже дважды промывают колонку этанолом. Если соль останется, элюирование нуклеиновой кислоты будет плохим, и показание A230 (поглощение света с длиной волны 230 нм) будет высоким, что приведет к низким отношениям 260/230. Для ДНК и РНК, не содержащих этанол, вам нужна сухая колонка. После промывки этанолом большинство протоколов имеют стадию центрифугирования для высушивания колонки. Это необходимо для удаления этанола и важно для чистого элюента. Когда для элюирования на мембрану наносят 10 мМ Трис-буфера или воду, нуклеиновые кислоты могут гидратироваться и высвобождаться из мембраны. Если в колонке все еще есть этанол, то нуклеиновые кислоты не могут быть полностью регидратированы.

    Пропуск этапа сушки приводит к загрязнению этанолом и низким выходам. Если вы не видете абсорбции этанола на Nanodrop, то он не будет отображаться в ваших показаниях. Основные признаки проблемы состоят в том, что при попытке загрузить образец в агарозный гель ДНК не утонет. Даже при наличии красителя. Другим показателем является то, что если вы поместите образец в -20°C, он не замерзнет.

    Экстракция РНК и ДНК, последний рубеж: элюция

    Последним этапом в протоколе экстракции ДНК является освобождение чистой ДНК или РНК из силикагеля.

    Для приготовления ДНК обычно используют 10 мМ Трис при рН 8-9. ДНК более стабильна при слегка щелочном pH и быстрее растворяется в буфере. И это применимо также для гранул ДНК. Вода имеет тенденцию иметь низкий pH, так как 4-5 и высокомолекулярная ДНК могут не полностью регидратироваться за короткое время, используемое для элюции. Элюция ДНК может быть максимизирована, если позволить буферу сидеть в мембране в течение нескольких минут перед центрифугированием.

    РНК элюируется хорошо при слегка кислом pH, и поэтому вода является предпочтительным разбавителем. РНК легко растворяется в воде.

    Что еще может пойти не так?

    Низкий выход: если выход ДНК/РНК ниже, чем вы ожидали для образца, есть много факторов, которые стоит проанализировать. Обычно это проблема лизиса — неполный лизис является основной причиной низкого выхода. Это также может быть вызвано неправильными условиями связывания. Обязательно используйте свежий высококачественный этанол для разбавления буферов или для добавления на стадии связывания. Возможно, этанол низкого качества или в старые запасы попала вода и они имеют неправильную концентрацию. Если буфер для промывки сделан неправильно, возможно, вы смываете извлеченную ДНК или РНК.

    Низкая чистота: если извлеченная ДНК загрязнена белком (низкое соотношение  260/280), возможно, вы начали с слишком большого количества образца, и белок не был полностью удален или растворен. Если ДНК имеет плохое отношение 260/230, проблема обычно заключается в соли из связующего или промывочного буфера. Убедитесь, что этанол высочайшего качества использовался для приготовления промывочных буферов, и, если проблема не исчезнет, ​​дайте колонке дополнительную промывку.

    Некоторые образцы имеют гораздо больше ингибиторов по сравнению с другими. Образцы окружающей среды особенно подвержены проблемам с чистотой, потому что гуминовые вещества растворяются во время экстракции. Хьюмик ведет себя подобно ДНК и его трудно удалить из колонки с диоксидом кремния. Для этого типа образца  существуют специальные методы для удаления белка и гуминов перед стадией колонки.

    Деградация:  В основном при экстракции РНК деградация происходит из-за неправильного хранения образца или неэффективного лизиса, при условии что вы элюировали водой без РНКазы. Для экстракции ДНК деградация не является большой проблемой, потому что для ПЦР ДНК можно разрезать, и она работает нормально. Но если вы надеялись не иметь слишком много сдвинутой ДНК, возможно, вы использовали слишком сильный метод лизиса.

    Особые замечания по очистке для ПЦР: Очистка продуктов ПЦР сама по себе не является методом выделения ДНК, но это приятный и простой метод, потому что это просто добавление высокой концентрации связывающих солей (обычно между 3-5 объемами соли на объемы реакции) и центрифугирование через колонку. Поэтому, когда наборы для очистки ПЦР выходят из строя, это может быть особенно неприятно. Первый вопрос, который я задаю людям: «Вы проверили результаты ПЦР на геле?», Потому что вы не можете проверить реакцию ПЦР в УФ-свете и получить точные показания. В 260-й реакции ПЦР поглощается слишком много ультрафиолетового излучения: нуклеотиды, детергенты, соли и праймеры. По моему опыту, отказ комплекта для очистки ПЦР работать часто вызван неудачной реакцией. Но если вы знаете, что у вас был сильный продукт ПЦР, Наилучший подход — просто сохранить свою долю потока после связывания. Если ДНК не связывается, вот где она. Вы всегда можете спасти его, а затем очистить снова. А затем позвоните в техподдержку и попросите заменить комплект.

    Как ученые, конечно, мы хотим точно знать, что происходит с нашими экспериментами, и иметь возможность устранять неполадки, не обращаясь в службу технической поддержки.

    Я надеюсь, что эта статья поможет прояснить некоторые научные аспекты метода спин-фильтрации с силикагелем для экстракции РНК и ДНК, чтобы вы могли самостоятельно поставить диагноз и исправить его. Таким образом, когда вы звоните в службу технической поддержки, вы сначала дважды проверили несколько наиболее вероятных причин проблем, и вместо того, чтобы пройти через множество ошибок, вы сможете быстрее найти решение. Даже если это бесплатный набор для замены ДНК!

    #13 Очистка нуклеиновых кислот: многообразие методов и подходов

    25.06.2020

    Одной из базовых методик практически в любом эксперименте является выделение нуклеиновых кислот. Причем, зачастую, от качества выделенной нуклеиновой кислоты зависит успех всего дальнейшего эксперимента, поэтому к подбору реагентов для экстракции НК стоит подходить ответственно. Мы решили рассмотреть различные технологии выделения НК, их особенности, преимущества и недостатки, чтобы вы смогли подобрать идеальное решение для ваших индивидуальных задач.

    Методы выделения НК, применяемые в современных коммерческих наборах

    Впервые нуклеиновые кислоты были выделены швейцарским физиологом Фридрихом Мишером в 1869 году. Он изучал химический состав животных клеток и заметил, что из ядер лейкоцитов можно выделить некое неизвестное ранее вещество – «нуклеин». Позже, благодаря кислотным свойствам этого вещества, его стали называть «нуклеиновая кислота». Технология выделения НК Фридриха Мишера была очень трудоемкой, она включала много сложных этапов и занимала несколько дней.

    Спустя 100 лет после открытия нуклеиновых кислот исследователи по всему миру стали широко использовать технологию фенол-хлороформного выделения.

    Рис.1 Схема протокола выделения НК фенол-хлороформным методом.

    В данной методике образец лизируют, а затем лизат смешивают с фенолом, хлороформом и изоамиловым спиртом. После центрифугирования эта смесь разделяется на две фазы, причем в нижней органической фазе остаются все жиры и липиды, в интерфазе – белки, а в верхней водной фазе – нуклеиновые кислоты (Рис.1). Для повышения чистоты экстракта эти действия повторяют несколько раз и таким образом получают выделенные и очищенные НК.

    Метод фенол-хлороформной экстракции широко распространен благодаря своей дешевизне, но он всё же уступает другим технологиям по качеству и выходу НК, а также требует сложных и длительных манипуляций, которые могут привести к контаминации и потере образца, а сам процесс трудно автоматизировать.

    В 1979 году американские учёные продемонстрировали, что при определённых условиях НК способны связываться с силикатами, что позволяет отделить все остальные компоненты клетки от частиц силики, со связанными НК. Их открытие легло в основу двух технологий: выделения НК на спин-колонках и на магнитных частицах.

    Спин-колонки сконструированы таким образом, что при нанесении лизированного образца на колонку и последующем центрифугировании НК остаются на кремниевой мембране колонки, а все остальные компоненты образца проходят сквозь неё (Рис.2). Затем НК можно промыть и элюировать в пробирку для сбора образца.

    Рис.2 Схема протокола выделения НК на спин-колонках.

    Основные преимущества метода - чистота и высокое качество выделенных нуклеиновых кислот, высокая воспроизводимость и простота по сравнению с выделением фенол-хлороформом. Однако также большое количество манипуляций может привести к контаминации, а выделение коротких фрагментов ДНК на спин-колонках может быть затруднено.

    Спустя 20 лет после появления метода выделения на спин-колонках становится популярным более быстрый способ выделения на магнитных частицах. Технология этого способа экстракции основана на связывании нуклеиновой кислоты с веществом, покрывающим магнитные частицы.

    Рис.3 Схема протокола выделения НК на магнитных частицах.

    К лизированному образцу добавляют такие магнитные частицы и перемешивают для связывания НК с ними. После этого пробирку ставят в магнитный штатив или подносят к магниту, фиксируя таким образом твердую фазу. После отбора супернатанта нуклеиновые кислоты на частицах промывают и элюируют (Рис.3).

    Этот метод так же хорош, как и выделение на спин-колонках, но для экстракции на магнитных частицах не нужно сложное оборудование (например, центрифуга), а сам процесс легко автоматизировать, и многие автоматические станции выделения основаны именно на этой технологии.

    Вы можете найти наборы для выделения НК от SkyGen у следующих брендов:

    Наборы для выделения НК от компании New England Biolabs

    Американская компания New England Biolabs представляет линейку наборов Monarch® для выделения и очистки нуклеиновых кислот:

    T3010 L/S

    Набор Monarch® для выделения геномной ДНК
    (150/50 реакций)

    T1030 L/S

    Набор Monarch® для очистки ДНК-продуктов ПЦР и ферментативных реакций
    (250/50 реакций)

    T1020 L/S

    Набор Monarch® для выделения ДНК из агарозного геля
    (250/50 реакций)

    T1010 L/S

    Набор Monarch® для выделения плазмидной ДНК, 20 мкг
    (150/50 реакций)

    T2030, T2040, T2050 L/S

    Набор Monarch® для очистки РНК-продуктов ферментативных реакций
    (100/10 реакций)

    Все наборы основаны на технологии выделения НК на спин-колонках и позволяют получить экстракт очень высокого качества.

    Основываясь на собственном опыте и отзывах наших клиентов, мы рекомендуем использовать набор Monarch® (Т3010 L/S) для выделения геномной ДНК для дальнейшего секвенирования на платформах Oxford Nanopore Technology (MinION, GridION, PromethION).

    Вы можете узнать подробнее об особенностях и преимуществах этого набора в нашем обзоре.

    В каталог  Продукция на сайте NEB  Линейка Monarch    

    Видеобиблиотека  Брошюра

    Продукция для выделения НК от компании Analytik Jena

    Все наборы для выделения НК от немецкой компании Analytik Jena основаны на технологии двойной химии (Dual Chemistry Technology, DC-Technology), которая была разработана и запатентована в 2005 году. Она основана на использовании буферов с содержанием хаотропных и нехаотропных солей с низкой ионной силой в определенной комбинации. Это позволяет НК прочнее связываться с твердой фазой, а также сокращать время выделения благодаря более эффективному лизису.

    innuPREP и blackPREP - линейки наборов для выделения НК на спин-колонках из широкого спектра образцов. В линейке blackPREP представлены колонки чёрного цвета, других отличий от innuPREP у этой линейки нет.

       

    В данных линейках представлены наборы для выделения НК из следующих типов биологических образцов:

    • Кровь
    • Ткани, клетки и мазки
    • Бактерии
    • Криминалистические образцы
    • Вирусные НК из биологических жидкостей, тканей и мазков
    • Растения
    • Фекалии
    • Образцы пищи
    • Клещи
    • Фрагменты хвостов грызунов
    • Мазки буккального эпителия
    • Парафиновые срезы = FFPE
    • Гели и смеси

    Для использования наборов innuPREP и blackPREP потребуется следующее оборудование:

    • Дозаторы
    • Вортекс
    • Термошейкер
    • Центрифуга до 10.000 g (~ 12.000 rpm)

    innuSPEED – линейка наборов для выделения НК на спин-колонках из сложнолизируемых образцов. Данная панель адаптирована под этап механического лизиса на гомогенизаторе (можно заменить на вортекс) в специальных пробирках с шариками. Такие пробирки со стеклянными, керамическими или стальными шариками различного размера уже входят в состав наборов, а также их можно приобрести отдельно и комбинировать с любыми другими наборами.


    Наборы innuSPEED позволяют выделять НК из следующих образцов:

    • Бактерии и грибы
    • Растения
    • Ткани
    • Почва

    Для использования наборов innuSPEED потребуется следующее оборудование:

    • Дозаторы 
    • Вортекс 
    • Гомогенизатор SpeedMill (или любой другой, а также можно заменить на вортекс) 
    • Термошейкер 
    • Центрифуга до 10.000 g (~ 12.000 rpm)

    Наряду с DC-Technology компания Analytik Jena разработала технологию SmartExtraction, которая основана на связывании НК с частицами с особой смарт-поверхностью. Это обеспечивает более эффективное связывание высокомолекулярной ДНК, а также уменьшение стресс-факторов за счет отсутствия этапов вортексирования и центрифугирования. Методика основана на выделении НК при помощи систем дозирования жидкостей. Для экстракции используют специальные наконечники с «умными» частицами, которые надеваются на дозатор. При заборе лизированного образца в наконечник нуклеиновая кислота из раствора связывается с частицами, затем следуют этапы промывки и элюции, в результате чего получается очищенная нуклеиновая кислота высокого качества (Рис.4).

    Рис.4 Схема протокола выделения НК при помощи технологии SmartExtraction.

    Так выглядит схема автоматической экстракции, но в портфолио Analytik Jena также присутствуют два набора для ручного выделения ДНК на магнитных частицах с такой «умной» поверхностью из крови и клеток и тканей.

    Каталог реагентов

    При больших потоках образцов и для упрощения этапа экстракции НК можно использовать автоматические решения от Analytik Jena:

    InnuPure C16 touch

    CyBio SELMA

    CyBio Felix

    Предназначена для эффективной и воспроизводимой экстракции ДНК/РНК при помощи технологий выделения на магнитных частицах, а также SmartExtraction. Полуавтоматическая компактная дозирующая система для раскапки 96- и 384-луночных планшетов.

    Можно адаптировать для выделения НК.

    Автоматическая дозирующая станция с гибкой модульной системой, которую легко трансформировать под индивидуальные задачи.

    Продукция для выделения НК от компании QIAGEN

    В нашем портфолио есть широкий спектр наборов для выделения НК от компании QIAGEN, причем особенность этих реагентов заключается в том, что можно подобрать набор под очень узкоспециализированную задачу в зависимости от типа выделяемой НК и биологического материала.

    Такие реагенты лучше всего подойдут пользователям с нестандартными задачами, например в каталоге QIAGEN есть наборы для выделения сцДНК, митохондриальной и космидной ДНК или микроРНК.

    Также есть наборы для элюции образца в очень малых объемах, для работы с архивными и сложнолизируемыми образцами, для выделения на спин-колонках, магнитных частицах или ферментативной экстракции в одной пробирке.

    Подробнее изучить наборы QIAGEN вы можете в каталоге на официальном сайте.

    В портфолио QIAGEN есть и автоматические станции для выделения НК:


           

    QIAcube Connect

    QIAcube HT

    QIAsymphony

    • Аналог ручного колоночного выделения
    • До 12 образцов одновременно
    • Совместим более чем с 80 наборами для выделения НК
    • Технология сорбции на кремниевой мембране
    • 24-96 образцов одновременно
    • Совместим с 7 наборами для выделения НК
    • Технология сорбции на магнитных частицах
    • 24 - 96 образцов одновременно
    • Совместим с модулем для ПЦР
    • Есть РУ

    Продукция для выделения НК от компании MicroGEM

    Новозеландская компания MicroGEM представляет уникальную технологию ферментативного температурно-зависимого выделения НК в одной пробирке. Она начинается со смешивания буфера и особых ферментов с биологическим образцом. При последующей инкубации при 75°C протеиназы разрушают клетки и высвобождают нуклеиновые кислоты. Дальнейшее нагревание до 95°C дезактивирует протеиназы, и после этого образец готов для дальнейшего исследования (Рис.5).

    Рис.5 Схема протокола ферментативного температурно-зависимого выделения НК.

    Эта технология очень простая и быстрая, и здесь отсутствуют потери НК, что позволяет работать даже с небольшим количеством образца. Однако, от этой технологии стоит отказаться, если для вас важна чистота выделяемой НК.

    Узнать больше о данной технологии вы можете в нашем обзоре.

    Наша команда научной поддержки может помочь с подбором идеального набора для ваших задач, для этого необходимо заполнить форму:

    Подобрать набор


    ДНК-тест по нестандартным образцам (волосы, ногти, ушная сера)

    Самый частый вопрос от клиентов, как сдать тест ДНК и что для этого нужно.

    Анализ ДНК на установление родства может проводится по:

    • стандартным биобразцам;
    • по нестандартным.

    Стандартный образец для теста ДНК.

    Стандартным образцом ДНК принято считать буккальный эпителий - это клетки с внутренней поверхности щеки, в которых содержится ДНК человека.

    Процедуру забора буккального эпителия можно провести самостоятельно в домашних условиях, соблюдая инструкцию, или обратиться в центр, где забор произведет специалист.

    Буккальный эпителий является универсальным материалом для ДНК теста по нескольким причинам:

    1. Процедура сбора простая, безболезненная и не требующая специальных навыков.
    2. Вероятность успешного выделения ДНК из такого образца при соблюдении правил забора - 99 %.
    3. Хранение и транспортировка буккального эпителия не требуют специальных условий, как в случае с кровью.
    4. Материал до 3-х месяцев пригоден для исследования.

    Однако, часто наши клиенты не имеют возможности собрать стандартные образцы ДНК.

    В случае, когда исследование требуется провести с соблюдением полной конфиденциальности, мы рекомендуем использовать нестандартные образцы.

    Виды нестандартных образцов.

    Случаются жизненные ситуации, когда для проведения генетического исследования стандартный образец ДНК невозможно или неудобно взять у одного или нескольких участников теста.

    Однако на помощь в таких ситуациях всегда приходят нестандартный образец ДНК.

    В большинстве случаев такие образцы применяются для анонимных ДНК тестов или если нет доступа к ребенку (или другому участнику теста).

    Почему используют именно такие непривычные образцы?

    В отличие от стандартной пробы, их нетрудно собрать, проверив бытовой мусор, например. Нестандартные образцы - идеальные варианты для проведения анонимного генетического исследования, когда результат теста нужен только для внутреннего семейного круга.

    1 тип — высокая вероятность выделения ДНК.

    Наименование биоматериалаПравила сбора и хранения
    Волосы с луковицамиНеобходимо взять волосы с корешками (не менее 10 штук). Если брать выпавшие волосы с расчески есть риск невыделения ДНК. Срезанные волосы не подходят для исследования!
    НогтиСостриженные ногти с рук или ног. Рекомендуемое количество - 5-6 штук. От новорожденного ребенка-со всех ручек и ножек.
    Окурок1-2 шт. Собирать образцы необходимо пинцетом, либо в перчатках. Хранить материал исключительно в бумажных конвертах.
    Жевательная резинкаЖелательно, чтобы жвачка находилась во рту как можно дольше, без пищи и воды. При сборе жевательной резинки не касайтесь её руками.Хранить материал исключительно в бумажных конвертах.
    Зубная щеткаПредмет личной гигиены должен использоваться продолжительное время одним человеков. При сборе материала - не мойте щетку под горячей водой и какими-либо моющими средствами. Просушите щетку в течение 1,5 часов. Избегайте прямых солнечных лучей и держите образец вдали от любых нагревательных приборов.
    Ушная сераСобирать косметической ватной палочкой из НОВОЙ упаковки . Минимум 2-3 штуки. Используйте только 1 конец ватной палочки для сбора ушной серы, второй ватный конец отрежьте.
    Детская соска-пустышкаНе мойте и не стерилизуйте пустышку, после того, как возьмете у ребенка.
    Сперма на ватной палочкеВ случае самостоятельного сбора спермы из презерватива: обмакните ватную палочку в сперме и положите в бумажный конверт. Высушите образец в течении 60 минут, избегая прямых солнечных лучей и контакта с нагревательными приборами. Рекомендуемое количество - 2-3 ватные палочки, отрезанные с одного конца.
    Лезвие бритвыПри сборе  использованного лезвия, не касайтесь его руками (используйте пинцет или перчатки), не промывайте и не ополаскивайте бритвенный станок.
    Женский гигиенический тампон/прокладкаСредства гигиены после использования, наполненные женскими кровяными выделениями, необходимо высушить. Не кладите тампон в пакет, используйте для хранения только бумажную упаковку
    Жидкая кровьТранспортируется в вакуумной пробирке с соблюдением температурного режима (2-8 градусов) и сроков доставки.
    Биологические пятнаПятна на ткани, марле, ватном диске. Необходимо отметить маркером или другим способом биологическое пятно диаметром не менее 1 см, также необходимо указать вид биологического пятна.
    Использованные носовые платки/салфеткиБиологический материал должен быть от одного человека. Нельзя использовать пакеты для хранения образцов.
    Сухая кровь/спермаБиологические образцы могут находиться на разных материалах (на бумаге, ткани, вате, марле и т.д.) Площадь пропитанной поверхности не менее 1 см.

    2 тип - степень вероятности выделения ДНК средняя, ниже среднего.

    Наименование биоматериалаПравила сбора и хранения
    Абортивный материалДля исследования присылается абортивный материал после прерывания беременности. Правильно упаковать материал могут непосредственно в медицинском учреждении. В случае самостоятельного сбора весь абортивный материал необходимо поместить в стерильный контейнер.  Лучше направлять материал курьерской службой. В связи с тем, что в абортивном материале всегда содержится ДНК матери, необходимо предоставить биологические образцы матери (можно стандартный образец - буккальный эпителий).
    Парафиновые блокиДля исследования берут биологический образец ткани размером не менее 1 кубического сантиметра. По результатам исследования парафиновый блок и ткань в нем будут полностью или частично разрушены.
    Мумифицированная тканьНеобходимо забирать  биологические образцы стерильными перчатками. Успешное выделение ДНК зависит от условий хранения. Для исследования также принимается высохшая отпавшая пуповина.
    ОдеждаДля исследования принимаются фрагменты одежды (футболки, рубашки с засаленными воротничками и манжетами). Старайтесь не прикасаться к местам, где есть выделения, лучше всего собирать в стерильных перчатках.

    Помните, что собранный материал нельзя:

    — трогать голыми руками

    — замораживать или высушивать на батарее

    — подвергать солнечному воздействию

    — упаковывать в полностью герметичные емкости, пластиковые пакеты и файлы.

    ВНИМАНИЕ: Перед сбором нестандартного образца ОБЯЗАТЕЛЬНО свяжитесь со специалистом лаборатории для консультации. Сотрудник лаборатории подробно расскажет о правилах сбора, хранения и транспортировки каждого нестандартного образца.

    % PDF-1.4 % 2090 0 объект > endobj xref 2090 36 0000000016 00000 н. 0000001075 00000 н. 0000001418 00000 н. 0000002505 00000 н. 0000002920 00000 н. 0000003570 00000 н. 0000004374 00000 н. 0000004417 00000 н. 0000004655 00000 н. 0000004887 00000 н. 0000004918 00000 н. 0000004941 00000 н. 0000005633 00000 н. 0000005880 00000 н. 0000006543 00000 н. 0000006566 00000 н. 0000007113 00000 н. 0000007136 00000 н. 0000007690 00000 н. 0000007713 00000 н. 0000008407 00000 н. 0000008430 00000 н. 0000009118 00000 п. 0000009141 00000 п. 0000009786 00000 н. 0000009809 00000 н. 0000010436 00000 п. 0000010459 00000 п. 0000011106 00000 п. 0000042887 00000 п. 0000086451 00000 п. 0000117536 00000 н. 0000117744 00000 н. 0000117824 00000 н. 0000001611 00000 н. 0000002482 00000 н. трейлер ] >> startxref 0 %% EOF 2091 0 объект > >> / LastModified (D: 20030827160157) / MarkInfo> >> endobj 2092 0 объект > endobj 2124 0 объект > поток HSKSQ ^ or6meL * HHtP /: BdlJ ֺ LkŮCk28 RE0U8A @ rRi} tӹ? S

    .

    Экстракция ДНК


    Создано Джорджем Райсом, Государственный университет Монтаны


    Рассел Хилл инструктирует студентов по выделению ДНК на курсе SMaRT 2005 года. (изображение предоставлено Russell Hill, 2005 г.) Что такое экстракция ДНК?

    Проще говоря, экстракция ДНК - это удаление дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) из клеток или вирусов, в которых она обычно находится.

    Для чего это используется?

    Извлечение ДНК часто является ранним этапом многих диагностических процессов, используемых для обнаружения бактерий и вирусов в окружающей среде, а также для диагностики заболеваний и генетических нарушений.Эти методы включают, но не ограничиваются:

    • Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH): FISH - это молекулярный метод, который используется, среди прочего, для идентификации и подсчета конкретных бактериальных групп.
    • Полиморфизм длины конечного рестрикционного фрагмента (T-RFLP): T-RFLP используется для идентификации, характеристики и количественной оценки пространственных и временных закономерностей в сообществах морского бактериопланктона.
    • Секвенирование: могут быть секвенированы части или целые геномы, а также дополнительные хромосомные элементы для сравнения с существующей последовательностью в общедоступной базе данных.


    Как это работает?

    Схема базовой экстракции ДНК -

    1. Взломайте (лизируйте) клетки или вирус, содержащие интересующую ДНК -
      Это часто делается обработкой ультразвуком или взбиванием образца шариками. Перемешивание с фенолом (иногда нагретым) часто эффективно для разрушения прочных клеточных стенок или вирусных капсидов. Добавление детергента, такого как SDS, часто необходимо для удаления липидных мембран.
    2. ДНК-ассоциированные белки, как и другие клеточные белки, могут разрушаться при добавлении протеазы.Осаждению белка способствует добавление соли, такой как ацетат аммония или натрия. Когда образец встряхивают с фенол-хлороформом и центрифугируют, белки остаются в органической фазе, и их можно осторожно отобрать. ДНК будет находиться на границе между двумя фазами.
    3. ДНК
    4. осаждают путем смешивания с холодным этанолом или изопропанолом и последующего центрифугирования. ДНК нерастворима в спирте и выходит из раствора, а спирт служит промывкой для удаления ранее добавленной соли.
    5. Снова промыть полученный осадок ДНК холодным спиртом и центрифугировать для извлечения осадка.
    6. После слива спирта с осадка и сушки ДНК можно повторно суспендировать в буфере, таком как Трис или ТЕ.
    7. Наличие ДНК может быть подтверждено электрофорезом на агарозном геле, содержащем бромид этидия или другой флуоресцентный краситель, который реагирует с ДНК, и проверкой в ​​УФ-свете.

    Изображение вирусной ДНК, подвергнутой электрофорезу в агарозном геле.ДНК экстрагировали из теплового вируса STIV и разрезали тремя отдельными рестрикционными ферментами. (рисунок предоставлен автором)

    Инструменты, используемые для экстракции ДНК - Это устройство для взбивания гранул используется для разрушения или «лизиса» клеток на ранних этапах экстракции, чтобы сделать ДНК доступной. Стеклянные шарики добавляются в пробирку эппендорфа, содержащую интересующий образец, и взбиватель для шариков сильно вибрирует раствор, заставляя стеклянные шарики физически разрушать клетки.Другие методы, используемые для лизиса клеток, включают френч-пресс и устройство для обработки ультразвуком. Центрифуга , такая как эта, может вращаться со скоростью до 15 000 об / мин для облегчения разделения различных фаз экстракции. Он также используется для осаждения ДНК после смывания солей этанолом и / или изопропанолом. Коробка с гелем используется для разделения ДНК в агарозном геле с электрическим зарядом. Когда красный и черный выводы подключены к источнику питания, ДНК мигрирует через гель в сторону положительного заряда из-за чистого отрицательного заряда молекулы.Части ДНК разного размера движутся с разной скоростью, при этом более крупные части движутся медленнее через пористую среду, тем самым создавая разделение по размеру, которое можно различить в геле.

    Ссылки по теме


    • Справочная страница, дающая обзор ДНК и важности этой молекулы в современной молекулярной биологии.

    Преподавательская деятельность


    • Серия лабораторных упражнений с инструкциями по выделению ДНК из нескольких различных исходных материалов.Упражнение рассчитано на учащихся 6–12 классов.
    Следующие ресурсы были первоначально доступны через коллекцию цифровых ресурсов BioSciEd Net (BEN), которая представляет собой путь Национальной научной цифровой библиотеки (NSDL) для образования в области биологических наук. Дополнительные учебные ресурсы можно найти на сайте BEN, чтобы использовать их базу данных с возможностью поиска. BEN можно использовать бесплатно, но требуется регистрация.
    • Выделение ДНК из лука - Эта лаборатория от AccessExcellence позволяет студентам конкретно работать с ДНК, легко выделяя хромосомную ДНК с помощью тех же основных инструментов и методов, которые используют ученые.
    • Извлечение ДНК - этот веб-сайт Science NetLinks предлагает планы уроков, которые развивают понимание ДНК путем моделирования процесса извлечения ДНК.
    • [ссылка https://web.archive.org/web/20190222033127/http://www.apsnet.org/edcenter/K-12/TeachersGuide/DNA_Easy/Pages/default.aspx «Легкий путь ДНК (и Gram Пятно без беспорядка) '] - Этот ресурс Американского фитопатологического общества представляет собой короткое лабораторное упражнение, которое обучает студентов процедурам выделения ДНК из бактериальных клеток.Кроме того, студенты узнают, как определять реакцию бактериальных изолятов окрашиванием по Граму.
    • ДНК-детективы: этот ресурс Access Excellence предоставляет лабораторные занятия, где студенты используют анализ отпечатков пальцев ДНК для определения виновника фиктивного преступления.
    • Используйте ПЦР и один волос для получения отпечатка ДНК - этот ресурс требует, чтобы вы вошли в систему BEN для просмотра (для этого требуется подписка на BEN, которая является бесплатной). Этот PDF-документ предлагает подробное руководство по протоколам и инструктивную информацию для выполнения студентами лабораторных упражнений по молекулярной биологии и ценетике, в которых студенты используют полимеразную цепную реакцию для создания отпечатков пальцев ДНК из своих собственных волос.Он включает в себя конспекты студентов, заметки инструктора и предлагаемые вопросы для лабораторных отчетов.
    .

    % PDF-1.5 % 365 0 объект > endobj xref 365 40 0000000016 00000 н. 0000002165 00000 н. 0000002322 00000 п. 0000002839 00000 н. 0000003260 00000 н. 0000003697 00000 н. 0000003734 00000 н. 0000003905 00000 н. 0000004019 00000 н. 0000004392 00000 п. 0000004875 00000 н. 0000005218 00000 н. 0000005668 00000 н. 0000006554 00000 н. 0000007362 00000 н. 0000008132 00000 н. 0000008733 00000 н. 0000009515 00000 н. 0000010108 00000 п. 0000010896 00000 п. 0000011611 00000 п. 0000014260 00000 п. 0000014335 00000 п. 0000014432 00000 п. 0000014581 00000 п. 0000016826 00000 п. 0000018760 00000 п. 0000018873 00000 п. 0000018948 00000 п. 0000019261 00000 п. 0000019316 00000 п. 0000019432 00000 п. 0000019556 00000 п. 0000019631 00000 п. 0000019944 00000 п. 0000020019 00000 п. 0000020332 00000 п. 0000028203 00000 п. 0000075467 00000 п. 0000001096 00000 н. трейлер ] / Назад 979697 >> startxref 0 %% EOF 404 0 объект > поток hb``b`yh Ā

    .

    ДНК - Протоколы изоляции

    Этот протокол дает высокоочищенный препарат ДНК из биопсии хвоста мыши.

    1. Удалите 0,5 мм хвоста из полипропиленовой микроцентрифужной пробирки (не измельчая). (Пробирки должны иметь плотно прилегающие колпачки, чтобы не было утечек в шагах 3 и 7 ниже.)

    2. Добавьте 0,5 мл буфера для расщепления ДНК с протеиназой К до конечной концентрации 0,5 мг / мл. (0,5 мг / мл - это высокая концентрация и, вероятно, ее можно уменьшить.)

    Буфер для расщепления ДНК:

    • 50 мМ Трис-HCl pH 8.0
    • 100 мМ ЭДТА pH 8,0
    • 100 мМ NaCl
    • 1% SDS

    3. Инкубируйте в течение ночи при 50-55 ° C при легком встряхивании. (На этом этапе механическое перемешивание в значительной степени способствует полному разрушению хвоста.)

    4. Пробирки быстрого вращения для удаления раствора внутри крышки.

    5. Заполните внутреннюю часть крышки пробирки для микроцентрифугирования вакуумной смазкой. (Для дозирования мы используем смазку для высокого вакуума Dow Corning и шприц объемом 10 куб. См.)

    6. Добавьте 0,7 мл нейтрализованного фенола / хлороформа / изоамилового спирта (25: 24: 1).

    7. Достаточно энергично перемешайте. (НЕ вортексировать; мы используем клинический ротатор в течение 1 часа.)

    8. Прокрутите в микроцентрифуге на максимальной скорости 5 минут и перенесите 0,5 мл верхней фазы в новую микроцентрифужную пробирку. (Используйте P1000 для переноса и осторожно протяните водную фазу через наконечник несколько раз после переноса, если ДНК все еще находится в большой студенистой массе.)

    9. Добавьте 1 мл 100% этанола при комнатной температуре и переверните (используя клинический ротатор, если хотите) до образования осадка ДНК. (примерно 1 минута).

    10. Прокрутите в микроцентрифуге 5 минут и осторожно удалите супернатант.

    11. Добавьте 0,5–1 мл 70% этанола (-20 ° C) и несколько раз переверните.

    12. Прокрутите в микроцентрифуге 5 минут и осторожно удалите супернатант.

    13. Пробирки быстрого вращения и удалить последнюю каплю раствора этанола с помощью капиллярной пробирки на 25 мкл.

    14. Высушите на воздухе при комнатной температуре или в эксикаторе (по желанию, на ночь).

    15. Добавьте 100-200 мкл ТЕ буфера и инкубируйте при 65 ° C в течение 15 минут для ресуспендирования ДНК.Проведите ДНК через наконечник P1000 после инкубации при 65 ° C, чтобы помочь суспендировать, если хотите.

    16. Используйте 10-20 мкл для расщепления рестриктазами.

    17. Общий выход составляет примерно 20-50 мкг ДНК, 0,1-0,25 мкг / мкл.

    .

    Смотрите также