-
Выделение днк из крови
Методы выделения ДНК и РНК из биологического материала
Методы выделения нуклеиновых кислот
Практически все научные исследования в области молекулярной биологии на той или иной стадии включают этап выделения нуклеиновых кислот. Выделенные нуклеиновые кислоты затем используют в ПЦР (ОТ-ПЦР), секвенировании и для множества других задач, причем технологии выделения различаются не только по принципу своего действия, но и в зависимости от типа биоматериала и последующего применения экстракта.Впервые нуклеиновые кислоты пытались выделить в середине XIX века, когда ещё практически ничего не было известно об этих молекулах. Однако с момента открытия структуры и свойств ДНК технологии её выделения непрерывно модифицируются и совершенствуются. Рассмотрим самые распространенные и прогрессивные методики, используемые для экстракции нуклеиновых кислот.
Выделение фенол-хлороформом
Первое упоминание об использовании этого метода встречается в статьях с 1967 года, и с тех пор эта технология является одним из самых распространённых способов выделения нуклеиновых кислот в большинстве исследовательских лабораторий.
Суть методики заключается в смешивании клеточного лизата с фенолом, хлороформом и изоамиловым спиртом в определенных пропорциях и последующем перемешивании и центрифугировании смеси.
При выделении нуклеиновых кислот из сложных исходных образцов, таких как кровь или ткани, включают в себя лизис биологического материала детергентами или хаотропными агентами иногда в присутствии разрушающих белки ферментов. После этого этапа следуют несколько стадий, в которых используются органические растворители, такие как Фенол/Хлороформ или Тризолом с последующим осаждением в Изопропиловом спирте. Полное отделение белков от нуклеиновых кислот может быть достигнуто добавлением перхлората натрия.
При перемешивании клеточного лизата и фенола формируются две фазы: водная и органическая, причем все липиды и жиры находятся в органической (нижней) фазе, белки — на границе фаз, а нуклеиновые кислоты — в водной (верхней) фазе. Для повышения чистоты экстракта эти действия повторяют несколько раз. Если раствор будет иметь низкий pH, то ДНК перейдёт в органическую фазу, а РНК останется в водной фазе, что позволяет выделять РНК отдельно от ДНК. Дополнительно можно попробовать селективное инкубирование с хлоридом лития или специфичное безнуклеазное изолирование с гуанидин хлоридом или гуанидин тиоцианатом, скомбинированное с фенольной экстракцией или этанольной преципитацией. Стандартная методика получения чистого препарата основана на том, что ДНК является полярной молекулой и не растворяется в органических растворителях.
Данный метод используется повсеместно, поскольку он не требует дополнительного сложного оборудования и имеет невысокую стоимость. Однако этот метод ориентирован на работу с такими агрессивными веществами, как фенол и хлороформ, и присутствуют стадии центрифугирования и жидкостной экстракции, которые нельзя автоматизировать. Также весь протокол занимает достаточно много времени.
Сорбционная экстракция на поверхности silica и silica-spin колонках.
Сорбционная экстракция – методика, в основе которой лежит избирательная сорбция на поверхности silica в присутствие хаотропной соли. Ингибиторы и другие компоненты клинического материала остаются в растворе. С помощью центрифугирования силика с НК осаждается, а супернатант c ингибиторами ПЦР удаляется. Серия последующих отмывок обеспечивает получение высокоочищенного препарата НК.
Технология выделения на silica-spin колонках — это усовершенствованный метод экстракции на частичках silica, предложенный американскими учёными в 1979 году. Метод колоночного выделения использует то же свойство нуклеиновых кислот адгезироваться на поверхности материала silica в присутствии хаотропных ионов, и легко смываться в их отсутствии. Данный метод пришел из органической химии, где на первых этапах набивались стеклянные колонки различными материалами, в том числе silica, потом ДНК и РНК смывались, и далее колонка разбиралась и набивалась заново. Чтобы исключить эти трудоемкие этапы, было предложено использовать одноразовые пластиковые колонки, уже с прослойкой silica-мембраны, которые идеально подходят по размеру к обычным пробиркам эппендорф на 1,5 и 2 мл. Спин-колонки сконструированы таким образом, что при нанесении клеточного лизата на колонку и последующем центрифугировании ДНК остаётся на колонке, а всё лишнее проходит сквозь неё. Затем ДНК промывают несколько раз и элюируют в пробирку для сбора образца.
Чаще всего для лизиса используются хаотропные агенты, например гуанидин тиоцианат, которые дестабилизируют водородные связи, ван-дер-ваальсовы и гидрофобные взаимодействия. В таких условиях растворимость ДНК/РНК в воде снижается, а белки денатурируют. Кроме хаотропных солей в лизирующем буфере чаще всего присутствуют детергенты, которые способствуют растворению и лизису белков.
Хаотропная соль необходима не только для лизиса, но и для процесса сорбции нуклеиновых кислот. Также для усиления процесса сорбции в некоторых протоколах рекомендуют добавлять спирт. Нужно отметить, что сорбция ДНК на силике под действием хаотропных солей – процесс, который по-прежнему вызывает много споров. Однако среди всех существующих точек зрения на процесс взаимодействия ДНК с силикой можно выделить несколько основных.
Первая точка зрения состоит в том, что сорбция ДНК на силике происходит за счёт образования катионных мостиков между силанольными группами, расположенными на поверхности силики и фосфатными группами ДНК. Известно, что в растворе при рН 6 – 8 поверхность силики отрицательно заряжена, как и фосфатные группы НК. Из-за электростатического отталкивания взаимодействие между ними невозможно. Однако при добавлении хаотропной соли отрицательный заряд экранируется. В таких условиях молекулы НК сорбируются на поверхности силики за счет ван-дер-ваальсовых взаимодействий.
Вторая точка зрения опирается на свойства хаотропных агентов. Известно, что молекула НК в растворе покрыта гидратной оболочкой. Попадая в раствор, молекулы хаотропной соли активно разрушают водородные связи, присоединяя к себе воду. В итоге молекула ДНК, лишённая своей гидратной оболочки, становится гидрофобной. То же самое происходит с поверхностью силики. В итоге между ДНК и силикой возникают гидрофобные взаимодействия, и идёт процесс сорбции.
Согласно еще одной точке зрения основным механизм взаимодействия ДНК и силики является образование водородных связей между водой и молекулами НК. Подобные выводы были сделаны после выявления зависимости между количеством адсорбированной ДНК и диаметром пор силики.
Предполагается, что сорбция происходит за счет взаимодействия гидратных оболочек образованных поверхностью поры и молекул НК. Авторы подчеркивают, что НК лишь частично включается в поры, а основная часть молекул торчит на поверхности. В данной теории не ясным остаётся роль хаотропных солей, присутствующих в растворе. Вследствие этого наиболее вероятными вариантами механизма сорбции представляются первые два, которые являются взаимодополняющими.
Необходимо также отметить, что процесс сорбции лучше всего идет при высокой ионной силе раствора, показателях рН 3,5-6,5 (оптимум рН 5) и температуре выше 37 °С.
Преимущества такого метода заключаются в повышенной чистоте и хорошем качестве выделенных нуклеиновых кислот, высокой воспроизводимости и простоте по сравнению с выделением фенол-хлороформом. Однако также большое количество манипуляций может привести к контаминации, а выделение коротких фрагментов ДНК на спин-колонках может быть затруднено.
Экстракция на спин-колонках может занять от 20 минут в зависимости от биоматериала и сложности его лизиса. Стоимость одного выделения здесь значительно выше, чем у предыдущего метода, поскольку на каждую реакцию необходима своя колонка, несколько пробирок для сбора фильтрата и элюата и, конечно, реагенты.
Спиртовое осаждение нуклеиновых кислот
После осаждения спиртом нуклеиновые кислоты отделяется от раствора центрифугированием. Осадок, содержащий целевую НК, отмывается 70% этиловым спиртом с последующим центрифугированием. После удаления супернатанта осадок подсушивается и растворяется в водном буфере. Роль соли в протоколе экстракции состоит в том, что её положительно заряженные ионы нейтрализуют отрицательный заряд на сахаро-фосфатном скелете НК, приводя к снижению растворимости последних в воде. В водном растворе электростатическое притяжение положительно заряженных ионов и отрицательно заряженных фосфатных групп подчиняется закону Кулона и зависит от диэлектрической константы раствора. Вода имеет большую диэлектрическую константу, что затрудняет взаимодействие ионов, тогда как этанол с гораздо более низкой диэлектрической константой способствует взаимодействию положительно заряженного иона и фосфатной группы, что приводит к выпадению НК в осадок. Нужно отметить, что НК менее растворима в изопропаноле, чем в этаноле, соответственно для ее осаждения требуются меньшая концентрации изопропанола (для выпадения НК в осадок достаточно присутствия 35 % изопропанола и 0,5 М соли, в то время как этанола требуется около 75% при той же концентрации соли). Таким образом, к образцу изопропанола необходимо добавлять 0,7-1 объема образца, а этанола 2,-2,5 объема. Следовательно, изопропанол предпочтительнее использовать, если есть ограничения по объему используемого пластика (например, есть возможность добавить только один объем образца). В ряде протоколов экстракции предлагается проводить осаждение (преципитацию) НК при пониженной температуре (-20°С). Однако, есть исследователи не согласные с этой теорией; по результатам их экспериментов температура инкубации со спиртом не имеет значительного влияния на выход продукта. Главенствующая роль, по их мнению, должна быть отведена продолжительности центрифугирования.
При выделении малых количеств НК (менее 100 нг) для визуализации осадка и улучшения процесса преципитации рекомендуется использовать соосадители, такие как гликоген, линейный полиакриломид или декстран. В некоторых протоколах экстракции предлагается добавлять соосадители непосредственно к осадителю (этанолу или изопропанолу). Делать этого, однако, не следует, так как соосадитель, попадая непосредственно в спирт, начинает образовывать центры нуклеации в отсутствие НК и, соответственно, при последующем смешивании с образцом в меньшей степени способствует агрегации НК. Соосадитель, таким образом, следует добавлять непосредственно в лизирующий буфер или к образцу.
На предпоследнем этапе выделения ДНК проводится добавление 70% этанола для отмывки осадка от остатков солей. Важно, чтобы отмывка проводилась именно водным раствором спирта, так как соли хорошо растворяются в воде и в гораздо меньшей степени в спирте. Кроме того, использование 70% этанола препятствует переходу НК в водную фазу.
На завершающем этапе процедуры происходит растворение НК в водном буфере обычно при температуре 56-65°С и вортексировании, что необходимо для лучшего растворения осадка.
Выделение на магнитных частицах
Спустя 20 лет после появления метода выделения на спин-колонках начинает набирать популярность более быстрый способ выделения на магнитных частицах 6. Технология этого способа выделения основана на связывании нуклеиновой кислоты с веществом, покрывающим магнитные частицы (целлюлоза, сефадекс, сефакрил, dT-олигонуклеотиды, специфичные олигонуклеотиды и др.). К клеточному лизату добавляют такие магнитные частицы и перемешивают для связывания ДНК с ними. После этого пробирку ставят в магнитный штатив или подносят к магниту, фиксируя таким образом твердую фазу. После отбора супернатанта нуклеиновые кислоты на частицах промывают и элюируют.
Этот метод имеет те же преимущества, что и выделение на спин-колонках, но для экстракции на магнитных частицах не требуется сложное лабораторное оборудование (например, центрифуга). Более того, процесс выделения на магнитных частицах легко автоматизировать, и многие автоматические станции выделения основаны именно на этой методике 3. Однако здесь также присутствует риск контаминации и потерь образца.
Данный протокол выделения займет немного меньше времени благодаря отсутствию этапов центрифугирования, но количество манипуляций будет примерно таким же. Также стоимость одной реакции обычно выше, чем при выделении на колонках, а панели наборов предоставляют Qiagen, Analytik Jena, ThermoFisher и другие.
Ферментативное температурно-зависимое выделение
Все вышеперечисленные методики имеют общую лимитирующую стадию — этап лизиса. Во всех технологиях используется SDS и протеиназа K для разрушения клеточных стенок и высвобождения нуклеиновых кислот. SDS является ингибитором ПЦР, именно поэтому необходимы множественные стадии промывки, которые повышают риск контаминации и приводят к потерям образца. Также более сложные для лизиса образцы могут требовать дополнительную долгую и трудозатратную пробоподготовку.
Клинический образец помещается в пробирку с лизирующим буфером, затем подвергается термической обработке, в процессе которой происходит деструкция клеточных мембран, вирусных оболочек и других биополимерных комплексов и высвобождение НК. С помощью последующего центрифугирования нерастворимые компоненты осаждаются на дне пробирки, а надосадочная жидкость (супернатант), содержащая ДНК, используется для проведения ПЦР.
Данная технология оптимальна для работы с малым количеством биоматериала, поскольку нет потерь нуклеиновых кислот. Также эту методику легко автоматизировать, она самая быстрая среди всех упомянутых способов выделения (от 7 минут) и включает меньше всего манипуляций. Стоимость одной реакции невысока, поскольку кроме реагентов не требуется никаких специальных расходных материалов.
Разработки наборов для выделения нашей компании.
На данный момент в нашей компании ВМТ разрабатываются наборы для пробоподготовки на основе всех трех подходов к экстракции НК:
- Набор на основе сорбционной экстракции. Эту надежную, проверенную, хорошо работающую методику, нашедшую широкое применение в клинической практике мы адаптировали для выделения геномной ДНК из цельной крови и сыворотки.
- Набор на основе спиртового осаждения. Эту надежную, проверенную, хорошо работающую методику, нашедшую широкое применение в клинической практике мы адаптировали для выделения геномной ДНК из цельной крови и сыворотки.
- Набор для выделения нуклеиновых кислот методом сорбции на silica-spin колонках – наиболее интересная и перспективная разработка.
Очистка ДНК | Методы экстракции ДНК
Основная процедура изоляции
Существует пять основных этапов экстракции ДНК, которые соответствуют всем возможным химическим процессам очистки ДНК: 1) разрушение клеточной структуры для создания лизата, 2) отделение растворимой ДНК от клеточного мусора и другого нерастворимого материала, 3) связывание ДНК, представляющая интерес для очищающей матрицы, 4) отмывание белков и других загрязняющих веществ от матрицы и 5) элюция ДНК.
1. Создание лизата
Первым шагом в любой реакции очистки нуклеиновой кислоты является перевод ДНК / РНК в раствор. Целью лизиса является быстрое и полное разрушение клеток в образце для высвобождения нуклеиновой кислоты в лизат. Существует четыре основных метода лизиса материалов: физические методы, ферментативные методы, химические методы и их комбинации.
Физические методы
Физические методы обычно включают измельчение или дробление образцов для разрушения клеточных стенок или жестких тканей.Распространенным методом физического разрушения является замораживание и измельчение образцов ступкой и пестиком в жидком азоте для получения порошкообразного материала, который затем подвергается химическому или ферментативному лизису. Измельчители могут быть простыми ручными устройствами или автоматическими, способными разрушать несколько 96-луночных планшетов. Физические методы часто используются с более структурированными исходными материалами, такими как ткани или растения. В других устройствах используется взбивание или встряхивание шариков в присутствии металлических или керамических шариков для разрушения клеток или тканей или обработка ультразвуком для разрушения тканей и лизиса клеток.
Химические методы
Химические методы могут использоваться отдельно с материалами, легко поддающимися лизису, такими как клетки культур ткани, или в сочетании с другими методами. Разрушение клеток достигается с помощью множества агентов, которые разрушают клеточные мембраны и денатурируют белки. Обычно используемые химические вещества включают детергенты (например, SDS) и хаотропы (например, соли гуанидина и щелочные растворы).
Ферментативные методы
Ферментативные методы часто используются с более структурированными исходными материалами в сочетании с другими методами с тканями, растительным материалом, бактериями и дрожжами.Используемые ферменты способствуют разрушению тканей и прочных клеточных стенок. В зависимости от исходного материала, типичные ферментативные обработки могут включать, среди прочего, лизоцим, зимолазу и литиказу, протеиназу К, коллагеназу и липазу. Ферментативная обработка может быть подвержена высокопроизводительной обработке, но может иметь более высокую стоимость образца по сравнению с другими методами разрушения.
Во многих протоколах часто используется комбинация химического разрушения и другого, поскольку химическое разрушение клеток быстро инактивирует белки, включая нуклеазы.
2. Очистка от лизата
В зависимости от исходного материала, клеточные лизаты могут нуждаться в удалении клеточного дебриса перед очисткой нуклеиновых кислот, чтобы уменьшить перенос нежелательных материалов (белков, липидов и сахаридов из клеточных структур) в реакцию очистки, которые могут закупоривать мембраны или мешать последующие приложения. Обычно очистку проводят центрифугированием, фильтрацией или методом гранул.
Центрифугирование может потребовать больше времени, но оно способно справиться с большим количеством мусора.Фильтрация может быть быстрым методом, но пробы с большим количеством мусора могут засорить фильтр. Очистка на основе гранул, как и метод, используемый с наборами для подготовки плазмид на основе частиц Promega, может использоваться в автоматизированных протоколах, но может быть перегружена биомассой. После образования очищенного лизата ДНК можно очистить с помощью множества различных химических методов, таких как диоксид кремния, ионный обмен, методы на основе целлюлозы или осаждения.
3. Привязка к матрице очистки
Независимо от метода, используемого для создания очищенного лизата, интересующую ДНК можно выделить с помощью множества различных методов.Promega предлагает системы выделения геномной ДНК, основанные на лизисе образцов детергентами и очистке путем связывания с матрицами (диоксид кремния, целлюлоза и ионный обмен), к которым в последние годы в первую очередь обращают внимание.
Каждый из этих химических составов может влиять на эффективность и чистоту выделения, и каждый из них имеет характерную связывающую способность. Емкость связывания - это показатель того, сколько нуклеиновой кислоты может связывать химический состав выделения, прежде чем он достигнет емкости системы и больше не изолирует больше этой нуклеиновой кислоты.Мы можем встроить конструктивные особенности в эти химические соединения, манипулируя условиями связывания для обогащения различных категорий нуклеиновых кислот (например, химические соединения, которые избирательно связывают РНК по сравнению с ДНК или большие по сравнению с маленькими фрагментами).
Химия на основе растворов
Этот тип химии основан не на связующей матрице, а на осаждении спиртом. После образования лизата клеточный мусор и белки осаждаются с использованием высококонцентрированного солевого раствора.Высокая концентрация соли вызывает выпадение белков из раствора, а затем центрифугирование отделяет растворимую нуклеиновую кислоту от клеточного дебриса и осажденного белка (1).
Затем ДНК осаждают путем добавления изопропанола к высококонцентрированному солевому раствору. Это вытесняет большие молекулы геномной ДНК из раствора, в то время как более мелкие фрагменты РНК остаются растворимыми. Затем нерастворимую ДНК осаждают и отделяют от фрагментов соли, изопропанола и РНК центрифугированием.
Дополнительная промывка осадка этанолом удаляет оставшуюся соль и усиливает испарение. Наконец, осадок ДНК ресуспендируют в водном буфере, таком как Трис-ЭДТА или в воде, свободной от нуклеаз, и после растворения готов к использованию в последующих приложениях.
Химия, связывающая кремнезем
Технология этих систем очистки геномной ДНК основана на связывании ДНК с диоксидом кремния в условиях высокого содержания соли (2–4). Ключом к выделению любой нуклеиновой кислоты с помощью диоксида кремния является присутствие хаотропной соли, такой как гидрохлорид гуанидина.Хаотропные соли, присутствующие в больших количествах, способны разрушать клетки, дезактивировать нуклеазы и позволять нуклеиновой кислоте связываться с кремнеземом.
После связывания геномной ДНК с мембраной из диоксида кремния нуклеиновая кислота промывается раствором соли / этанола. Эти промывки удаляют загрязняющие белки, липополисахариды и малые РНК для повышения чистоты, при этом ДНК остается связанной с колонкой с диоксидом кремния. По окончании промывки геномную ДНК элюируют в условиях с низким содержанием соли, используя либо воду, не содержащую нуклеаз, либо ТЕ-буфер.
Связывание с диоксидом кремния не является ДНК-специфическим, поэтому, если требуется чистая ДНК, также можно добавить рибонуклеазу (РНКазу A) в буфер для элюирования. РНК может быть очищена совместно с гДНК, и добавление РНКазы в буфер для элюции обеспечивает удаление подавляющего большинства загрязняющих РНК.
Этот химический состав может быть адаптирован к парамагнитным частицам (PMP), таким как PMP MagneSil® с диоксидом кремния Promega, покрытым диоксидом кремния, или форматам на основе колонок с диоксидом кремния. Хотя оба метода обычно обеспечивают хороший баланс выхода и чистоты, формат колонки с кремнеземной мембраной более удобен.Для автоматической очистки 96-луночные планшеты с диоксидом кремния или PMP MagneSil® легко адаптируются к различным роботизированным платформам.
Для обработки образцов ДНК PMP MagneSil® требует сильного магнита для захвата частиц, а не центрифугирования или вакуумной фильтрации. PMP MagneSil® считаются «подвижной твердой фазой» со связыванием нуклеиновых кислот, происходящим в растворе. Частицы также могут быть полностью ресуспендированы во время этапов промывки протокола очистки, тем самым улучшая удаление загрязняющих веществ.На Рисунке 1 показаны изображения колонки с диоксидом кремния и PMP Magnesil®.
Химия связывания целлюлозы
Совсем недавно Promega выпустила на рынок методы выделения ДНК, в которых используется матрица на основе целлюлозы. Нуклеиновая кислота связывается с целлюлозой в присутствии высоких солей и спиртов. Вообще говоря, связывающая способность методов на основе целлюлозы очень высока. Условия могут быть отрегулированы для предпочтительного связывания нуклеиновой кислоты разных видов и размеров. В результате комбинации связывающей способности и относительно небольшого объема элюирования мы можем получить элюаты с высокой концентрацией нуклеиновых кислот.
Химия ионного обмена
Ионообменная химия основана на взаимодействии, которое происходит между положительно заряженными частицами и отрицательно заряженными фосфатами, присутствующими в ДНК. ДНК связывается в условиях с низким содержанием соли, и загрязняющие белки и РНК затем могут быть смыты растворами с более высоким содержанием соли. ДНК элюируется в условиях с высоким содержанием соли, а затем выделяется осаждением этанолом.
4. Мойка
Промывочные буферы обычно содержат спирты и могут использоваться для удаления белков, солей и других загрязняющих веществ из образца или предшествующих связывающих буферов.Спирты дополнительно помогают связывать нуклеиновую кислоту с матрицей.
5. Элюирование
ДНКрастворима в растворах с низкой ионной силой, таких как TE-буфер или вода, не содержащая нуклеаз. Когда такой водный буфер наносят на мембрану из диоксида кремния, ДНК высвобождается из диоксида кремния, и элюат собирается. Затем очищенная высококачественная ДНК готова к использованию в широком спектре ответственных приложений, таких как мультиплексная ПЦР, связанные системы транскрипции / трансляции in vitro, реакции трансфекции и секвенирования.
При выборе буфера для элюирования важно учитывать требования желаемых последующих процессов. Элюирование и хранение ДНК в буфере TE, например, полезно до тех пор, пока EDTA не влияет на выбранные вами последующие приложения. EDTA хелатирует или связывает магний, присутствующий в очищенной ДНК, и может помочь подавить возможную активность загрязняющих нуклеаз. Если EDTA вызывает беспокойство, мы рекомендуем хранить ДНК в буферном растворе, так как кислотная природа ДНК может привести к автогидролизу.В качестве альтернативы можно использовать буфер TE -4 , который представляет собой 10 мм трис-HCl, 0,1 мм EDTA (pH 8,0).
.ДНК - Протоколы изоляции
Этот протокол дает высокоочищенный препарат ДНК из биопсий хвоста мыши.
1. Удалите 0,5 мм хвоста из полипропиленовой микроцентрифужной пробирки (не измельчайте). (Пробирки должны иметь плотно прилегающие колпачки, чтобы не было утечек в шагах 3 и 7 ниже.)
2. Добавьте 0,5 мл буфера для расщепления ДНК с протеиназой К до конечной концентрации 0,5 мг / мл. (0,5 мг / мл - это высокая концентрация и, вероятно, ее можно уменьшить.)
Буфер для расщепления ДНК:
- 50 мМ Трис-HCl pH 8.0
- 100 мМ ЭДТА pH 8,0
- 100 мМ NaCl
- 1% SDS
3. Инкубируйте в течение ночи при 50-55 ° C при легком встряхивании. (На этом этапе механическое перемешивание в значительной степени способствует полному разрушению хвоста.)
4. Пробирки быстрого вращения для удаления раствора внутри крышки.
5. Заполните внутреннюю часть крышки пробирки для микроцентрифугирования вакуумной смазкой. (Для дозирования мы используем смазку для высокого вакуума Dow Corning и шприц объемом 10 куб. См.)
6. Добавьте 0,7 мл нейтрализованного фенола / хлороформа / изоамилового спирта (25: 24: 1).
7. Достаточно энергично перемешайте. (НЕ вортексировать; мы используем клинический ротатор в течение 1 часа.)
8. Прокрутите в микроцентрифуге на максимальной скорости 5 минут и перенесите 0,5 мл верхней фазы в новую микроцентрифужную пробирку. (Используйте P1000 для переноса и осторожно протяните водную фазу через наконечник несколько раз после переноса, если ДНК все еще находится в большой студенистой массе.)
9. Добавьте 1 мл 100% этанола при комнатной температуре и переверните (используя клинический ротатор, если хотите) до образования осадка ДНК. (примерно 1 минута).
10. Прокрутите в микроцентрифуге 5 минут и осторожно удалите супернатант.
11. Добавьте 0,5–1 мл 70% этанола (-20 ° C) и несколько раз переверните.
12. Прокрутите в микроцентрифуге 5 минут и осторожно удалите супернатант.
13. Пробирки быстрого вращения и удалить последнюю каплю раствора этанола с помощью капиллярной пробирки на 25 мкл.
14. Высушите на воздухе при комнатной температуре или в эксикаторе (по желанию, на ночь).
15. Добавьте 100-200 мкл ТЕ буфера и инкубируйте при 65 ° C в течение 15 минут для ресуспендирования ДНК.Проведите ДНК через наконечник P1000 после инкубации при 65 ° C, чтобы помочь суспендировать, если хотите.
16. Используйте 10-20 мкл для расщепления рестриктазами.
17. Общий выход составляет примерно 20-50 мкг ДНК, 0,1-0,25 мкг / мкл.
.% PDF-1.5 % 365 0 объект > endobj xref 365 40 0000000016 00000 н. 0000002165 00000 н. 0000002322 00000 п. 0000002839 00000 н. 0000003260 00000 н. 0000003697 00000 н. 0000003734 00000 н. 0000003905 00000 н. 0000004019 00000 н. 0000004392 00000 п. 0000004875 00000 н. 0000005218 00000 н. 0000005668 00000 н. 0000006554 00000 н. 0000007362 00000 н. 0000008132 00000 н. 0000008733 00000 н. 0000009515 00000 н. 0000010108 00000 п. 0000010896 00000 п. 0000011611 00000 п. 0000014260 00000 п. 0000014335 00000 п. 0000014432 00000 п. 0000014581 00000 п. 0000016826 00000 п. 0000018760 00000 п. 0000018873 00000 п. 0000018948 00000 п. 0000019261 00000 п. 0000019316 00000 п. 0000019432 00000 п. 0000019556 00000 п. 0000019631 00000 п. 0000019944 00000 п. 0000020019 00000 п. 0000020332 00000 п. 0000028203 00000 п. 0000075467 00000 п. 0000001096 00000 н. трейлер ] / Назад 979697 >> startxref 0 %% EOF 404 0 объект > поток hb``b`yh Ā
.
