• Выделение днк на магнитных частицах


    #13 Очистка нуклеиновых кислот: многообразие методов и подходов

    25.06.2020

    Одной из базовых методик практически в любом эксперименте является выделение нуклеиновых кислот. Причем, зачастую, от качества выделенной нуклеиновой кислоты зависит успех всего дальнейшего эксперимента, поэтому к подбору реагентов для экстракции НК стоит подходить ответственно. Мы решили рассмотреть различные технологии выделения НК, их особенности, преимущества и недостатки, чтобы вы смогли подобрать идеальное решение для ваших индивидуальных задач.

    Методы выделения НК, применяемые в современных коммерческих наборах

    Впервые нуклеиновые кислоты были выделены швейцарским физиологом Фридрихом Мишером в 1869 году. Он изучал химический состав животных клеток и заметил, что из ядер лейкоцитов можно выделить некое неизвестное ранее вещество – «нуклеин». Позже, благодаря кислотным свойствам этого вещества, его стали называть «нуклеиновая кислота». Технология выделения НК Фридриха Мишера была очень трудоемкой, она включала много сложных этапов и занимала несколько дней.

    Спустя 100 лет после открытия нуклеиновых кислот исследователи по всему миру стали широко использовать технологию фенол-хлороформного выделения.

    Рис.1 Схема протокола выделения НК фенол-хлороформным методом.

    В данной методике образец лизируют, а затем лизат смешивают с фенолом, хлороформом и изоамиловым спиртом. После центрифугирования эта смесь разделяется на две фазы, причем в нижней органической фазе остаются все жиры и липиды, в интерфазе – белки, а в верхней водной фазе – нуклеиновые кислоты (Рис.1). Для повышения чистоты экстракта эти действия повторяют несколько раз и таким образом получают выделенные и очищенные НК.

    Метод фенол-хлороформной экстракции широко распространен благодаря своей дешевизне, но он всё же уступает другим технологиям по качеству и выходу НК, а также требует сложных и длительных манипуляций, которые могут привести к контаминации и потере образца, а сам процесс трудно автоматизировать.

    В 1979 году американские учёные продемонстрировали, что при определённых условиях НК способны связываться с силикатами, что позволяет отделить все остальные компоненты клетки от частиц силики, со связанными НК. Их открытие легло в основу двух технологий: выделения НК на спин-колонках и на магнитных частицах.

    Спин-колонки сконструированы таким образом, что при нанесении лизированного образца на колонку и последующем центрифугировании НК остаются на кремниевой мембране колонки, а все остальные компоненты образца проходят сквозь неё (Рис.2). Затем НК можно промыть и элюировать в пробирку для сбора образца.

    Рис.2 Схема протокола выделения НК на спин-колонках.

    Основные преимущества метода - чистота и высокое качество выделенных нуклеиновых кислот, высокая воспроизводимость и простота по сравнению с выделением фенол-хлороформом. Однако также большое количество манипуляций может привести к контаминации, а выделение коротких фрагментов ДНК на спин-колонках может быть затруднено.

    Спустя 20 лет после появления метода выделения на спин-колонках становится популярным более быстрый способ выделения на магнитных частицах. Технология этого способа экстракции основана на связывании нуклеиновой кислоты с веществом, покрывающим магнитные частицы.

    Рис.3 Схема протокола выделения НК на магнитных частицах.

    К лизированному образцу добавляют такие магнитные частицы и перемешивают для связывания НК с ними. После этого пробирку ставят в магнитный штатив или подносят к магниту, фиксируя таким образом твердую фазу. После отбора супернатанта нуклеиновые кислоты на частицах промывают и элюируют (Рис.3).

    Этот метод так же хорош, как и выделение на спин-колонках, но для экстракции на магнитных частицах не нужно сложное оборудование (например, центрифуга), а сам процесс легко автоматизировать, и многие автоматические станции выделения основаны именно на этой технологии.

    Вы можете найти наборы для выделения НК от SkyGen у следующих брендов:

    Наборы для выделения НК от компании New England Biolabs

    Американская компания New England Biolabs представляет линейку наборов Monarch® для выделения и очистки нуклеиновых кислот:

    T3010 L/S

    Набор Monarch® для выделения геномной ДНК
    (150/50 реакций)

    T1030 L/S

    Набор Monarch® для очистки ДНК-продуктов ПЦР и ферментативных реакций
    (250/50 реакций)

    T1020 L/S

    Набор Monarch® для выделения ДНК из агарозного геля
    (250/50 реакций)

    T1010 L/S

    Набор Monarch® для выделения плазмидной ДНК, 20 мкг
    (150/50 реакций)

    T2030, T2040, T2050 L/S

    Набор Monarch® для очистки РНК-продуктов ферментативных реакций
    (100/10 реакций)

    Все наборы основаны на технологии выделения НК на спин-колонках и позволяют получить экстракт очень высокого качества.

    Основываясь на собственном опыте и отзывах наших клиентов, мы рекомендуем использовать набор Monarch® (Т3010 L/S) для выделения геномной ДНК для дальнейшего секвенирования на платформах Oxford Nanopore Technology (MinION, GridION, PromethION).

    Вы можете узнать подробнее об особенностях и преимуществах этого набора в нашем обзоре.

    В каталог  Продукция на сайте NEB  Линейка Monarch    

    Видеобиблиотека  Брошюра

    Продукция для выделения НК от компании Analytik Jena

    Все наборы для выделения НК от немецкой компании Analytik Jena основаны на технологии двойной химии (Dual Chemistry Technology, DC-Technology), которая была разработана и запатентована в 2005 году. Она основана на использовании буферов с содержанием хаотропных и нехаотропных солей с низкой ионной силой в определенной комбинации. Это позволяет НК прочнее связываться с твердой фазой, а также сокращать время выделения благодаря более эффективному лизису.

    innuPREP и blackPREP - линейки наборов для выделения НК на спин-колонках из широкого спектра образцов. В линейке blackPREP представлены колонки чёрного цвета, других отличий от innuPREP у этой линейки нет.

       

    В данных линейках представлены наборы для выделения НК из следующих типов биологических образцов:

    • Кровь
    • Ткани, клетки и мазки
    • Бактерии
    • Криминалистические образцы
    • Вирусные НК из биологических жидкостей, тканей и мазков
    • Растения
    • Фекалии
    • Образцы пищи
    • Клещи
    • Фрагменты хвостов грызунов
    • Мазки буккального эпителия
    • Парафиновые срезы = FFPE
    • Гели и смеси

    Для использования наборов innuPREP и blackPREP потребуется следующее оборудование:

    • Дозаторы
    • Вортекс
    • Термошейкер
    • Центрифуга до 10.000 g (~ 12.000 rpm)

    innuSPEED – линейка наборов для выделения НК на спин-колонках из сложнолизируемых образцов. Данная панель адаптирована под этап механического лизиса на гомогенизаторе (можно заменить на вортекс) в специальных пробирках с шариками. Такие пробирки со стеклянными, керамическими или стальными шариками различного размера уже входят в состав наборов, а также их можно приобрести отдельно и комбинировать с любыми другими наборами.


    Наборы innuSPEED позволяют выделять НК из следующих образцов:

    • Бактерии и грибы
    • Растения
    • Ткани
    • Почва

    Для использования наборов innuSPEED потребуется следующее оборудование:

    • Дозаторы 
    • Вортекс 
    • Гомогенизатор SpeedMill (или любой другой, а также можно заменить на вортекс) 
    • Термошейкер 
    • Центрифуга до 10.000 g (~ 12.000 rpm)

    Наряду с DC-Technology компания Analytik Jena разработала технологию SmartExtraction, которая основана на связывании НК с частицами с особой смарт-поверхностью. Это обеспечивает более эффективное связывание высокомолекулярной ДНК, а также уменьшение стресс-факторов за счет отсутствия этапов вортексирования и центрифугирования. Методика основана на выделении НК при помощи систем дозирования жидкостей. Для экстракции используют специальные наконечники с «умными» частицами, которые надеваются на дозатор. При заборе лизированного образца в наконечник нуклеиновая кислота из раствора связывается с частицами, затем следуют этапы промывки и элюции, в результате чего получается очищенная нуклеиновая кислота высокого качества (Рис.4).

    Рис.4 Схема протокола выделения НК при помощи технологии SmartExtraction.

    Так выглядит схема автоматической экстракции, но в портфолио Analytik Jena также присутствуют два набора для ручного выделения ДНК на магнитных частицах с такой «умной» поверхностью из крови и клеток и тканей.

    Каталог реагентов

    При больших потоках образцов и для упрощения этапа экстракции НК можно использовать автоматические решения от Analytik Jena:

    InnuPure C16 touch

    CyBio SELMA

    CyBio Felix

    Предназначена для эффективной и воспроизводимой экстракции ДНК/РНК при помощи технологий выделения на магнитных частицах, а также SmartExtraction. Полуавтоматическая компактная дозирующая система для раскапки 96- и 384-луночных планшетов.

    Можно адаптировать для выделения НК.

    Автоматическая дозирующая станция с гибкой модульной системой, которую легко трансформировать под индивидуальные задачи.

    Продукция для выделения НК от компании QIAGEN

    В нашем портфолио есть широкий спектр наборов для выделения НК от компании QIAGEN, причем особенность этих реагентов заключается в том, что можно подобрать набор под очень узкоспециализированную задачу в зависимости от типа выделяемой НК и биологического материала.

    Такие реагенты лучше всего подойдут пользователям с нестандартными задачами, например в каталоге QIAGEN есть наборы для выделения сцДНК, митохондриальной и космидной ДНК или микроРНК.

    Также есть наборы для элюции образца в очень малых объемах, для работы с архивными и сложнолизируемыми образцами, для выделения на спин-колонках, магнитных частицах или ферментативной экстракции в одной пробирке.

    Подробнее изучить наборы QIAGEN вы можете в каталоге на официальном сайте.

    В портфолио QIAGEN есть и автоматические станции для выделения НК:


           

    QIAcube Connect

    QIAcube HT

    QIAsymphony

    • Аналог ручного колоночного выделения
    • До 12 образцов одновременно
    • Совместим более чем с 80 наборами для выделения НК
    • Технология сорбции на кремниевой мембране
    • 24-96 образцов одновременно
    • Совместим с 7 наборами для выделения НК
    • Технология сорбции на магнитных частицах
    • 24 - 96 образцов одновременно
    • Совместим с модулем для ПЦР
    • Есть РУ

    Продукция для выделения НК от компании MicroGEM

    Новозеландская компания MicroGEM представляет уникальную технологию ферментативного температурно-зависимого выделения НК в одной пробирке. Она начинается со смешивания буфера и особых ферментов с биологическим образцом. При последующей инкубации при 75°C протеиназы разрушают клетки и высвобождают нуклеиновые кислоты. Дальнейшее нагревание до 95°C дезактивирует протеиназы, и после этого образец готов для дальнейшего исследования (Рис.5).

    Рис.5 Схема протокола ферментативного температурно-зависимого выделения НК.

    Эта технология очень простая и быстрая, и здесь отсутствуют потери НК, что позволяет работать даже с небольшим количеством образца. Однако, от этой технологии стоит отказаться, если для вас важна чистота выделяемой НК.

    Узнать больше о данной технологии вы можете в нашем обзоре.

    Наша команда научной поддержки может помочь с подбором идеального набора для ваших задач, для этого необходимо заполнить форму:

    Подобрать набор


    Анализ связывания ДНК-магнитных частиц с помощью динамического и электрофоретического рассеяния света

    В этом протоколе теоретические принципы, объясняющие связывание ДНК с магнитными частицами через дзета-потенциал, были поставлены под сомнение. Протокол описывает синтез и модификацию магнитных наночастиц и микрочастиц. Также описаны способ приготовления контрольного и связывающего раствора ДНК. Здесь показаны две стратегии для скрининга взаимодействий ДНК с частицами: подходы количественной ПЦР и DLS.DLS обеспечивает три индикатора физико-химических изменений в частицах: размер частиц, индекс полидисперсности и дзета-потенциал. Изменения размера частиц прямо указывают на агрегацию или распад. Значение индекса полидисперсности описывает распределение частиц в системе от монодисперсных (индекс <0,05) до высокополидисперсных (индекс> 0,7). Дзета-потенциал может классифицировать частицы по поверхностному заряду, где сильно положительные частицы показывают значения больше 30 мВ, а сильно отрицательные частицы показывают значения ниже -30 мВ.Как и предполагалось, дзета-потенциал многозарядных магнитных частиц в связывающем растворе относительно уменьшался, когда частицы подвергались воздействию ДНК. Исключением из этого правила является MNPs_TEOS. Эти частицы отличаются только тем, что они обладают уникальным сильно отрицательным поверхностным зарядом ( Рисунок 2 ). Это говорит о том, что ионная сила сыграла важную роль в удержании вместе частиц, ДНК и положительных ионов. С другой стороны, изменения размера частиц могут указывать на роль преципитации / агрегации частиц ДНК в процессе связывания, особенно в присутствии более длинных цепей ДНК.

    Во время синтеза магнитных частиц и химических модификаций существует несколько критических этапов, которые требуют внимания: во-первых, воспроизводимость метода синтеза во многом зависит от точных количеств химических прекурсоров, используемых в синтезе, а также от хорошего перемешивания и своевременного контролируемого добавления NH. 4 ОН. Чтобы получить гомогенизированную популяцию частиц (одинакового размера, формы, плотности и состава), важно тщательно следовать этапам обработки ультразвуком и перемешивания, когда это указано.Во-вторых, во многих реальных случаях химические модификации не предсказывают реальности того, что находится на поверхности магнитных частиц. Для подтверждения химического состава поверхности частиц требуется этап комплексной характеристики, как описано во вводной части. Среди широко используемых методов исследователи полагаются на FTIR, XPS, электрохимию, спектроскопию, а также DLS.

    Кроме того, во время измерений и анализа DLS требуется несколько важных этапов: во-первых, выбор связывающего раствора влияет на различные этапы, включая химическую совместимость с частицами и ДНК, а также спектральные свойства.Выбор показателей преломления связующего раствора и материала частиц может быть основан на предыдущих исследованиях или оценен с помощью рефрактометрии. Во-вторых, следует тщательно контролировать взаимодействие между частицами и электродами в кюветах, поскольку процесс окисления / восстановления может повлиять на измерения. В-третьих, как показано на рис. 3 , скорость связывания может быть функцией времени. Очень важно соблюдать стабильность взаимодействия, и это является основным преимуществом применения DLS в таких исследованиях.Здесь наблюдатель отслеживает агрегацию частиц и физико-химические изменения в режиме реального времени. В-четвертых, полидисперсность системы может накладывать ограничения на объем анализа. Значение индекса полидисперсности ниже 0,05 описывает монодисперсную систему, тогда как значения выше 0,7 описывают полидисперсную систему с различными размерами частиц. Размер частиц и распределение различных видов частиц можно изучать с помощью различных типов DLS, включая обратное, боковое и прямое рассеивание, как указано в разделе 3 протокола.1. Наконец, обработка частиц ультразвуком перед испытанием, очевидно, может повлиять на их физические свойства (, например, размер и площадь поверхности), и, если ее проводить чрезмерно, это может вызвать высвобождение некоторых химических модификаций.

    В этом протоколе информация, полученная с помощью DLS, сравнивается с данными, полученными с помощью количественной ПЦР, также известной как ПЦР в реальном времени. Последний является золотым стандартом для обнаружения и количественного определения ДНК. 15 Метод ПЦР широко используется в лабораториях, больницах и университетах.Однако при тестировании воздействия ДНК на новые и синтезированные материалы важно учитывать химию ПЦР. Фермент полимераза, ключевой элемент полимеразной цепной реакции, чувствителен к определенным химическим ингибиторам и усилителям. Добавление средств внутреннего контроля, тестирования синтетических материалов и надлежащей лабораторной практики может помочь уменьшить систематические ошибки в результатах ПЦР. Механизмы действия ингибиторов и усилителей различаются между химическими веществами, которые напрямую связываются с полимеразой, и другими химическими веществами, которые хелатируют ионы из Mg 2+ -зависимой полимеразы в растворе.Некоторое представление о выделении ДНК трудно получить с помощью скрининга ПЦР. DLS может показать случаи, когда ДНК связывается с частицами, но скорее промывается или не элюируется (ДНК не обнаруживается с помощью ПЦР). Например, и MNPs_APTES, и MMPs_APTES показали значительное снижение дзета-потенциала после воздействия ДНК (, таблица 1, ), но ДНК, обнаруженная при элюировании, не коррелировала с этими результатами. Можно модифицировать растворы для связывания, промывания и элюирования, чтобы контролировать высвобождение ДНК из частиц. DLS - это относительно более быстрый метод оценки взаимодействий ДНК с частицами.Стабильность и скорость взаимодействия также можно наблюдать с помощью этого метода (, рис. 3, ), что может повлиять на время, используемое в протоколах выделения ДНК на основе магнитных частиц.

    Проблемы использования DLS в анализе очевидны. Этот метод требует относительно большого объема образца для анализа (~ 1 мл) по сравнению с ПЦР. Некоторые параметры, такие как показатели преломления, требуют тщательной оценки при использовании новых растворов в образцах. Кроме того, при испытании нового материала очень часто наблюдаются реакции окисления / восстановления на электродах кювет.Тщательная оценка и знание химического состава образца могут помочь оценить возможность повторного использования той же кюветы. Стоит упомянуть, что DLS-анализ ограничен специфичностью и чувствительностью, обеспечиваемой ПЦР, но при этом дает иное представление о процессе связывания ДНК с частицами.

    Как и все спектроскопические методы, модификации и устранение неисправностей DLS направлены на создание более точных и чувствительных измерений. Это может быть достигнуто за счет лучшего понимания природы материала, испытываемого физически и химически.Другими словами, оптические свойства и детали химического состава являются ключом к получению точных и конфиденциальных данных от DLS. Оптические свойства можно получить с помощью рефрактометрии, в то время как химический состав поверхности частиц / частиц можно изучить с помощью различных методов, таких как FTIR, XPS, электрохимия и другие спектроскопические методы. В этом протоколе связывающий раствор может быть улучшен за счет использования различной ионной силы, других дегидратирующих агентов (, например, изопропанол), различных pH и низких температур.С другой стороны, химические модификации поверхности частиц оставлены на усмотрение химиков.

    Разработка материалов для выделения ДНК будет продолжать развиваться в следующие десятилетия, уделяя больше внимания специфичности, чистоте и пределу обнаружения. Качество методов экстракции играет важную роль в исследованиях масштабов отдельных клеток, метагеномных масштабов и образцов необычного происхождения. В настоящее время актуальным является проведение DLS-анализа наночастиц и микрочастиц, модифицированных различными видами материалов.Этот шаг необходим до создания сильной теоретической модели, описывающей поведение взаимодействий ДНК с частицами.

    Требуется подписка. Пожалуйста, порекомендуйте JoVE своему библиотекарю.

    .

    MagMAX Выделение внеклеточной ДНК (вкДНК) | Thermo Fisher Scientific

    Оптимизирован для внеклеточной ДНК

    Магнитные шарики и оптимизированный химический состав означают более эффективное выделение нуклеиновых кислот, которые специфически восстанавливают циркулирующую вкДНК, оставляя более крупные молекулы ДНК позади. Этот аспект обогащения части вкДНК нуклеиновой кислоты обеспечивает концентрацию более короткой фрагментированной ДНК и ее готовность для последующего анализа с использованием ПЦР в реальном времени, цифровой ПЦР или секвенирования следующего поколения.

    Бусины лучше

    Гранулы связывают ДНК более эффективно, чем фильтры из стекловолокна, что дает более высокий и стабильный выход. Кроме того, поскольку фильтры и вакуумные коллекторы не используются, отсутствует риск засорения этих элементов клеточными частицами во время процесса экстракции. Эта проблема засорения особенно важна для богатых белком образцов большого объема, таких как плазма, которые обычно используются в исследованиях вкДНК.

    Dynabeads внутри

    Мы выбрали лучшие в отрасли бусины для нашего набора MagMAX.Силан Dynabeads MyOne, содержащийся в наборе для выделения внеклеточной ДНК MagMAX, имеет оптимизированную химию поверхности, подобную кремнезему, с высокой удельной площадью поверхности, которая обеспечивает эффективную кинетику и высокую чувствительность захвата нуклеиновых кислот. Эти аспекты делают Dynabeads MyOne Silane идеальным средством для восстановления циркулирующих мишеней вкДНК, присутствующих в низких концентрациях в бесклеточных жидкостях организма. После захвата эти редкие фрагменты ДНК можно затем элюировать небольшими объемами элюирования от 15 до 50 мкл, и они готовы к дальнейшим применениям.

    .

    % PDF-1.4 % 2090 0 объект > endobj xref 2090 36 0000000016 00000 н. 0000001075 00000 н. 0000001418 00000 н. 0000002505 00000 н. 0000002920 00000 н. 0000003570 00000 н. 0000004374 00000 н. 0000004417 00000 н. 0000004655 00000 н. 0000004887 00000 н. 0000004918 00000 н. 0000004941 00000 н. 0000005633 00000 п. 0000005880 00000 н. 0000006543 00000 н. 0000006566 00000 н. 0000007113 00000 н. 0000007136 00000 н. 0000007690 00000 н. 0000007713 00000 н. 0000008407 00000 н. 0000008430 00000 н. 0000009118 00000 п. 0000009141 00000 п. 0000009786 00000 н. 0000009809 00000 н. 0000010436 00000 п. 0000010459 00000 п. 0000011106 00000 п. 0000042887 00000 п. 0000086451 00000 п. 0000117536 00000 н. 0000117744 00000 н. 0000117824 00000 н. 0000001611 00000 н. 0000002482 00000 н. трейлер ] >> startxref 0 %% EOF 2091 0 объект > >> / LastModified (D: 20030827160157) / MarkInfo> >> endobj 2092 0 объект > endobj 2124 0 объект > ручей HSKSQ ^ or6meL * HHtP /: BdlJ ֺ LkŮCk28 RE0U8A @ rRi} tӹ? S

    .

    % PDF-1.3 % 302 0 объект> endobj xref 302 44 0000000016 00000 н. 0000001695 00000 н. 0000001176 00000 н. 0000001810 00000 н. 0000001867 00000 н. 0000002147 00000 н. 0000002267 00000 н. 0000002387 00000 н. 0000002507 00000 н. 0000002625 00000 н. 0000002743 00000 н. 0000002938 00000 н. 0000003040 00000 н. 0000003331 00000 н. 0000003931 00000 н. 0000003967 00000 н. 0000004121 00000 п. 0000004510 00000 н. 0000005281 00000 п. 0000006653 00000 п. 0000007918 00000 п. 0000009200 00000 п. 0000009379 00000 н. 0000009540 00000 н. 0000009724 00000 н. 0000009952 00000 н. 0000010022 00000 п. 0000010320 00000 п. 0000011300 00000 п. 0000011511 00000 п. 0000012766 00000 п. 0000014034 00000 п. 0000014937 00000 п. 0000015935 00000 п. 0000016822 00000 п. 0000019492 00000 п. 0000030849 00000 п. 0000036071 00000 п. 0000036577 00000 п. 0000037473 00000 п. 0000037666 00000 п. 0000038021 00000 п. 0000038217 00000 п. 0000038702 00000 п. трейлер ] >> startxref 0 %% EOF 304 0 obj> поток xb``` "n6

    .

    Смотрите также