• Выделение геномной днк


    Методы выделения ДНК и РНК из биологического материала

    Методы выделения ДНК из биологического материала


    Выделение ДНК и РНК — важный шаг подготовки проб перед биохимическими и диагностическими процессами. Амплификация, проведение обратной транскрипции, детектирование накопления продуктов амплификации методом ПЦР в реальном времени, клонирование, секвенс, гибридизация, синтез ДНК и т. д., не могут быть выполнены непосредственно на биологических образцах без предварительного выделения (экстракции) нуклеиновых кислот (НК) и их последующей очистки.

    Почему так важно получить высококачественную ДНК?

    Так как в ветеринарной клинической практике наиболее используемым методом является ПЦР в реальном времени (или, в некоторых случаях, классическая ПЦР), рассмотрим методы выделения НК и их особенности будут рассмотрены именно с точки зрения данного вида анализа.

    Механизм ПЦР.

    Как известно, ПЦР (полимеразная цепная реакция) представляет собой реакцию синтеза комплементарной цепочки ДНК на ДНК матрице, катализируемую ферментом ДНК-зависимой ДНК-полимеразой. Фермент термостабильный – он может выдерживать высокие температуры, необходимые на этапе денатурации. Оптимум работы полимеразы составляет около 72°C. Для создания оптимальных условий синтеза образец ДНК помещается в так называемую реакционную смесь (РС).

    Реакционная смесь состоит:

    1. Буфер для ПЦР. Это буферный раствор с определенным значением pH и концентрацией различных солей и кофакторов, необходимых для работы полимеразы. В наше время компании-производители реактивов для ПЦР предлагают к своим полимеразам фирменные буферы.
    2. ДНК-зависимая ДНК-полимераза. Катализатор реакции, чаще всего выделяется из термофильной бактерии Thermus aquaticus (Taq-полимераза).
    3. Нуклеотидтрифосфаты (dNTPs). Раствор мононуклеотидтрифосфатов (dATP, dCTP, dTTP, dGTP) в свободном виде, которые служат «строительным материалом» для синтеза ампликонов.
    4. Праймеры. Короткие синтезированные последовательности ДНК (олигонуклеотиды), фланкирующие исследуемые участки ДНК – от них полимераза начинает свою работу.
    5. MQ вода. Дистиллированная и деионизированная вода, пригодная для молекулярно-генетических исследований. Используется для доведения реакционной смеси до рабочей концентрации.
    6. ДНК. Собственно, сам образец ДНК, который необходимо исследовать.

    При должном качестве всех компонентов реакционной смеси реакция может ингибироваться только из-за плохой очистки ДНК. Ингибиторы ПЦР представляют собой вещества, способные повлиять на конформацию фермента и уменьшить его активность, вплоть до полной деактивации. Эти примеси могут оказаться в растворе ДНК по двум причинам:

    1.  Плохая очистка образца от остатков веществ, которые содержались в материале, из которого производилось выделение. Ингибировать ПЦР могут остатки жиров, белков, углеводов, пигментов (для растительных клеток – хлорофиллы, каратиноиды, антоцианы, для животных – гемоглобин и др.). Сюда же относятся и вещества, которые были использованы в качестве транспортной или консервационной среды для образца (ЭДТА, гепарин, формальдегид).
    2. Плохая очистка образца от реагентов, которые были использованы в процессе выделения. Сильно ингибируют ПЦР детергенты (ПАВ) и денатуранты, такие как SDS (додецилсульфат натрия) и мочевина; спирты и другие неполярные растворители, которые содержатся в экстрагентах и отмывочных буферах (этанол, изопропанол, фенол и др.).

    Список некоторых веществ, которые могут негативно повлиять на эффективность ПЦР, показан в таблице 1.

    Таблица 1. Некоторые ингибиторы процесса ПЦР

    Ингибитор Концентрация ингибитора
    SDS > 0.005%
    Фенол > 0.2%
    Этанол > 1%
    Изопропанол > 1%
    Ацетат натрия > 5 mМ
    Хлористый натрий > 25 mМ
    EDTA > 0.5 mМ
    Гемоглобин > 1  мг/мл
    Гепарин > 0.15 i.m/мл
    Мочевина > 20 mМ
    Агароза (при выделении ДНК из геля) > 1%
    РНК > 0,5 мкг/20мкл
    Реакционная смесь > 15%

     

    Из этого можно сделать вывод, что ключевыми факторами успешного выделения НК является грамотная подготовка материала, правильный выбор метода экстракции и точное соблюдение требований протокола выделения.

    Какие требования предъявляются к материалу для выделения нуклеиновых кислот?

    Прежде всего, биологические образцы должны быть взяты в достаточном количестве для проведения анализа, кроме того, образца должно хватить для проведения повторного анализа. При этом необходимо учитывать вариации содержания НК в различных органах и тканях, а также уменьшение содержания НК из-за деградации, если образец был взят через большой промежуток времени после смерти животного.

    Экстракцию нуклеиновых кислот следует начинать как можно скорее после отбора свежих тканей. Ткань может храниться в условиях низкой температуры в холодильнике в течение нескольких дней без риска деградации НК. Однако, если выделение невозможно в ближайшее время, образец должен быть заморожен до температуры от -20°C до -80°C. При этом целесообразно использовать для хранения и перевозки образцов одноразовую пластиковую пробирку или другие плотно закрывающиеся емкости.

    После экстракции целесообразно проверить качество выделенной НК, например, измерить концентрацию с помощью флюориметра/спектрофотометра, провести гель-электрофорез или ПЦР со специальными праймерами – факторами элонгации.

    Обзор методов выделения НК

    Выделение нуклеиновых кислот – один из базовых методов молекулярной биологии. В прошлом процесс выделения и очистки НК был сложным, времязатратным, трудоемким и имел ограничения с точки зрения скорости обработки образцов. На сегодняшний день имеется множество специализированных методик, которые могут использоваться для выделения нуклеиновых кислот с высокой степенью очистки. Их можно условно разделить на две группы: осаждение НК на суспензионный носитель и выделение на колонках. Безусловно, традиционные методы выделения являются надежными и прошли испытание временем, но сейчас на рынке имеется широкий ассортимент товаров, включая полные наборы, содержащие большинство реагентов, необходимых для выделения нуклеиновых кислот. Однако, большинство из них все же требует многократных этапов центрифугирования, которые сопровождаются удалением супернатанта (прим. фаза дисперсионной системы, которая располагается сверху от границы раздела фаз).
    В последний годы повысился спрос на автоматические системы. Разработанные для средних и крупных лабораторий, они являются альтернативой трудоемкому ручному методу. Данная технология значительно повышает производительность лаборатории. При этом выход НК и чистота материала, воспроизводимость и прогностичность эксперимента будут максимальными (так же как скорость, точность и надежность анализа в целом), а риск кросс-контаминации (перекрестного заражения) минимизируется.

    Фенол-хлороформная экстракция (Guanidinium Thiocyanate-Phenol-Chloroform Extraction).

    Обычно протокол выделения нуклеиновых кислот включает следующие этапы: 1.) клеточный лизис, в результате которого разрушаются клеточные структуры и образуется лизат, 2.) инактивацию нуклеаз клетки, таких как ДНКаза и РНКаза, 3.) выделение искомой нуклеиновой кислоты из клеточного дербиса. Экстракция с помощью смеси фенол-хлороформ – один из наиболее старых, но, тем не менее, широко используемых методов выделения нуклеиновых кислот.
    Несмотря на то, что фенол – легковоспламеняющееся, коррозионное и токсичное для человека вещество, он способен очень активно денатурировать белки, но не полностью инактивирует РНКазы. Эту проблему можно решить, используя смесь фенол : хлороформ : изоамиловый спирт (в пропорции 25:24:1).
    При смешивании фенола и хлороформа образуется двухфазная эмульсия. После центрифугирования гидрофобный слой эмульсии, в котором собираются белки, липиды и углеводы, оседает на дно, а гидрофильный остается сверху. Отбирается верхняя фаза, содержащая ДНК, после чего ДНК осаждают из супернатанта путем добавления этанола или изопропанола в соотношении 2:1 или 1:1 на фоне высокой концентрации солей в лизате. Соли – обычные примеси в образцах нуклеиновых кислот, поэтому их всегда необходимо удалять из образца перед любыми последующими процессами и планируемыми анализами. Следовательно, для обессоливания образца, содержащего нуклеиновую кислоту, требуется одна или несколько стадий отмывки.
    Осажденную ДНК выделяют путем повторного центрифугирования, причем избыток солей вымывается с помощью 70%-го этилового спирта, а центрифугирование необходимо для удаления супернатанта – этанола. Затем осажденную ДНК растворяют с помощью ТЕ-буфера или MQ-воды.

    FTA-карты.

    В данной методике нуклеиновые кислоты выделяются прямо на специальной бумаге, пропитанной смесью реагентов, связывающих ДНК. Для выделения достаточно нанести каплю образца на карту, после чего нанести на нее буфер для выделения и высушить. В дальнейшем, карту можно разрезать на фрагменты и загружать прямо в пробирку для ПЦР. Данный метод подходит только для жидких образцов и не пригоден для ПЦР в реальном времени, однако по времени анализа ему нет равных.

    С помощью коммерческих наборов (KITs)

    Для выделения НК возможно подготовить высококачественные образцы для анализа прямо «из коробки». По сравнению с традиционными методами они обеспечивают более быстрое и менее трудоемкое выделение. Многие затруднения, свойственные фенол-хлороформной экстракции, например, неполное разделение фаз, в данном случае исключены. В процессе выделения твердая фаза системы (сорбент) адсорбирует на себя нуклеиновые кислоты в зависимости от pH и ионной силы буфера. Процесс адсорбции основывается на следующих принципах: образование водородных связей с гидрофильной матрицей в хаотропных условиях, с последующим ионным обменом в жидкой среде с помощью анионообменника посредством отбора молекул по их афинности и размеру. В большинстве случаев твердофазная экстракция осуществляется с использованием колонки для очистки ДНК (spin column), через которую проходит лизат под воздействием центробежной силы. По сравнению с традиционными способами очистки данный метод имеет преимущество в скорости работы. В качестве носителя используются силикатные носители (силика), стеклянные частицы, диатомит и анионообменные носители.

    Протокол твердофазной экстракции включает четыре ключевых шага: клеточный лизис; адсорбцию нуклеиновых кислот, отмывку и десорбцию (элюцию). Исходным этапом является установка колонки для адсорбции образца. Подготовка колонки производится с использованием буфера с определенным pH – для того, чтобы придать поверхностным структурам (или функциональным группам) сорбента необходимые свойства – только в таком случае ДНК или РНК будут «налипать» на носитель. Следующий шаг – образец, расщепленный с помощью лизирующего буфера, помещают на колонку. Искомая нуклеиновая кислота адсорбируется на колонке за счет высокого pH и концентрации солей в связывающем растворе (binding solution). Прочие составляющие, такие как белки, также могут образовывать прочные специфические соединения с поверхностью колонки. Эти нежелательные примеси можно удалить на стадии промывания, используя промывочный буфер (wash buffer), который содержит вещества, не дающие им адсорбироваться. Для того, чтобы высвободить нуклеиновую кислоту с колонки на стадии десорбции, используется ТЕ-буфер или MQ-вода.
    Так называемые селективные носители (mixed-bed solid phases) представляют собой смесь по крайней мере двух различных сорбентов, которые могут быть твердыми или полутвердыми, пористыми или непористыми. Каждый из них способен связываться с целевой нуклеиновой кислотой при определенных условиях.

    Силикатные носители (Силика, Silica Matrices).

    Основой для большинства наборов для выделения и очистки нуклеиновых кислот, являются уникальные свойства силиконовых носителей для селективного связывания НК. К таким относятся стеклянные шарики и микроволокна, силикатные частицы, а также диатомовая земля (диатомит).
    Сюда же можно отнести носители из гидроокиси кремния (hydrated silica matrix), которые изготовливают путем нагревания смеси из диоксида кремния и гидроксида натрия (либо гидроксида калия) в молярном соотношении от 2:1 до 10:1 в течение 48 часов. ДНК связывается с неорганическим носителем и высвобождается при элюции. Принцип очистки нуклеиновых кислот с помощью силикатных носителей базируется на высокой афинности отрицательно заряженного остова ДНК к положительно заряженным силикатным частицам. Натрий играет роль катионного мостика, который притягивает отрицательно заряженный кислород в фосфатном «скелете» нуклеиновой кислоты. В условиях высокой ионной силы (pH ≤ 7) катионы натрия разрушают водородные связи между водородом воды и отрицательно заряженными ионами кислорода в силикатном материале. В этих условиях ДНК тесно связывается с носителем, а интенсивное промывание позволяет удалить все нежелательные примеси. Очищенные молекулы ДНК могут быть десорбированы позже, уже при низкой ионной силе раствора (pH ≥ 7), с использованием ТЕ-буфера или MQ-воды.
    Кроме силикатных носителей, связывать нуклеиновые кислоты способны также нитроцеллюлоза и полиамидные мембраны (polyamide membranes) (например, нейлоновые матрицы), однако они имеют меньшую специфичность.
    Вышеперечисленные материалы используются в качестве транспортировочных и гибридизационных носителей для твердофазной экстракции НК. Полиамидные носители более долговечны, чем целлюлозные, и способны необратимо связывать нуклеиновые кислоты. Нуклеиновые кислоты могут быть иммобилизованы на полиамидных сорбентах при низкой ионной силе буферного раствора.

    Стеклянные носители (Glass Particle).

    Для очистки нуклеиновых кислот используются частицы стекла, стеклянный порошок и стеклянные шарики. Адсорбция нуклеиновых кислот на стеклянный субстрат базируется на тех же принципах, что адсорбционная хроматография.
    Очистка нуклеиновых кислот также может осуществляться на силикагеле и стеклянной суспензии в присутствии раствора хаотропных солей.

    Диатомит.

    Диатомовая земля, известная также как кизельгур или диатомит, содержит до 94% кремния. Применяемая для фильтрации и в хроматографии, она подходит и для очистки плазмидной и ядерной ДНК. Впоследствии ДНК, связанная с диатомитом, вымывается с помощью спиртосодержащего буфера. Потом буфер сливается, а ДНК элюируется.

    Очистка нуклеиновых кислот с использованием магнитных микроносителей (Magnetic Bead Based Nucleic Acid Purification).

    Магнитная сепарация – современный, простой и эффективный способ очистки нуклеиновых кислот. Удобство данного метода заключается в том, что, намагниченные частицы могут быть удалены с помощью постоянного магнита. К стенке пробирки прикладывают магнит, благодаря чему происходит агрегация частиц вблизи него, после чего оставшуюся часть образца выливают. То есть не требуется ни органических растворителей, ни многократного центрифугирования, вакуумной фильтрации или осаждения на колонках. Часто для процесса выделения используют магнитные носители с иммобилизованными аффинными лигандами или носители, полученные из биополимера с аффинностью к целевой нуклеиновой кислоте. К таким относятся магнитные частицы, полученные из различных синтетических полимеров, биополимеров, пористого стекла или на основе неорганических магнитных материалов (например, поверхностно-модифицированный оксид железа).
    Для более эффективного связывания нуклеиновых кислот предпочтительно использовать материалы с большой суммарной площадью поверхности. Магнитные материалы в виде шариков (beads) более предпочтительны из-за их большей связывающей способности, так как НК буквально «оборачиваются» вокруг круглых частиц.
    Существует метод выделения НК с помощью инкапсулированных в полимер магнитных частиц. Чаще всего для этих целей используют целлюлозу, а в качестве магнитного компонента – оксиды железа или никеля. Особенность данного метода заключается в том, что нуклеиновые кислоты малого размера требуют более высоких концентраций солей для прочного связывания с модифицированными магнитными частицами. Следовательно, концентрацию соли можно избирательно изменять, чтобы высвободить связанную нуклеиновую кислоту нужного размера.

    Анионообменные смолы.

    Анионообменные смолы – класс носителей, в которых используется принцип анионного обмена. Он основан на взаимодействии между положительно заряженными группами диэтиламиноэтилцеллюлозы (DEAE) на поверхности смолы и отрицательно заряженными фосфатными группами ДНК-скелета. Анионообменная смола состоит из силикатных гранул с большим размером пор и гидрофильного поверхностного слоя. Большая суммарная площадь поверхности смолы обеспечивает плотное соединение DEAE-групп с НК. Смола работает в широком диапазоне рН (рН=6-9) и/или концентрации солей (0,1-1,6 М). Благодаря этому такие примеси, как белок и РНК вымываются из смолы с при использованием буферов со средней ионной силой, в то время как ДНК остается связанной с ней до этапа элюирования буфером с высокой ионной силой.

    Подводя итог, можно заключить, что современный рынок материалов для выделения нуклеиновых кислот характеризуется большим разнообразием. Все методики позволяют получать высококачественные образцы, пригодные для клинических исследований, однако следует учитывать условия работы лаборатории (вид анализов, количество образцов, цены на услуги лаборатории и т.д.), и тогда практический и экономический эффект выбранного метода будет максимальным.

    Выделение ДНК

    • Лизис клеток и клеточных мембран.

      Клетки разрушают механически или с помощью ферментативной обработки. Мембраны разрушают обработкой детергентами (навпример, SDS) или хаотропными агентами (гуанидин изотиацианат).

    • Удаление белков (депротеинизация).

      Белки экстрагируют смесью фенола, хлороформа, изоамилового спирта. Поскольку плотности этих органических растворитлей отличны от плотности воды, при центрифугировании лизата клеток, к которому были добавлены фенол и хлороформ, образуется два отдельных слоя: нижний, представляющий собой раствор на основе органических растворителей, и верхний, содержащий водный раствор. При этом белки денатурируют и образуют преципитат, который располагается узкой полосой на границе водной и органической фаз. Если фенол был уравновешени буфером с нейтральным значением рН, то водная фаза будет содержать сразу и ДНК, и РНК.

      Если же фенол был уравновешен буфером, имеющим кислое значение рН, то ДНК окажется в нижнем, органическом слое, а РНК - в верхнем, водном.

    • Получение концентрированной фракции нуклеиновых кислот.

      Используют осаждение ДНК этанолом (изопрапанолом) в присутствии соли (ацетата натрия) с дальнейшим отделением осадка центрифугированием и растворением осадка или адсорбцию ДНК на твердом носителе (например, стекло) с дальнейшей элюцией.

    • Выделение плазмидной ДНК

      Для выделения плазмидной ДНК из клеток используют щелочной метод. В ходе эксперимента изменяют pH раствора, содержащего геномную и плазмидную ДНК, на щелочной. При таком значении pH вся ДНК денатурирует. Однако цепи двуцепочечной плазмидной ДНК при этом остаются связанными друг с другом, поскольку плазмиды имеют кольцевую форму. При дальнейшей ренатурации, которая инициируется изменением pH раствора до первоначального, длинные цепи геномной ДНК, успев разойтись в растворе при денатурации, образуют плотный неструктурированный комок, а цепи плазмидной ДНК успешно восстанавливают исходную структуру. Теперь плазмидную ДНК легко отделить от геномной ДНК в ходе центрифугирования.

    Как работают наборы для выделения ДНК

    В наши дни большинство лабораторий используют коммерческие наборы для выделения ДНК, в которых используются спин-колонки, для выделения ДНК и РНК, которые содержат кремнеземную смолу, избирательно связывающую нуклеиновые кислоты, в зависимости от факторов, влияющих на метод экстракции. Наборы для выделения ДНК делают весь процесс намного проще и быстрее, чем старые методы, но недостатком их использования является то, что если вы не понимаете, что находится в черном ящике набора, он делает поиск проблем и ошибок намного сложнее.

    Итак, в этой статье я подробно объясню, как работают наборы для извлечения НК и что происходит на каждом этапе, а также о некоторых типичных проблемах, связанных с использованием колонок с силикагелем в экстракции ДНК, которые можно преодолеть или избежать, лишь немного разобравшись.

    Первый шаг в экстракции РНК и ДНК: лизис

    Лизирующий буфер Invitrogen ProcartaPlex

    Формулы лизиса могут варьироваться в зависимости от того, хотите ли вы извлечь ДНК или РНК, но общим знаменателем является лизирующий буфер, содержащий высокую концентрацию хаотропной соли. Хаотропы дестабилизируют водородные связи, силы Ван-дер-Ваальса и гидрофобные взаимодействия. Белки дестабилизируются, в том числе нуклеазы, нарушается связь нуклеиновых кислот с водой, что создает условия для перехода к кремнию. Хаотропные соли включают гуанидин HCl, гуанидинтиоцианат, мочевину и перхлорат лития.

    Помимо хаотропов, в буфере для лизиса обычно есть детергенты, которые улучшают солюбилизациею и лизис белка. Также могут быть ферменты, используемые для лизиса, в зависимости от типа образцов. Протеиназа К является одним из них и на самом деле очень хорошо работает в этих денатурирующих буферах; чем больше денатурирован белок, тем лучше работает протеиназа К. Лизоцим не работает при денатурировании, и поэтому обработку лизоцимом обычно проводят перед добавлением денатурирующих солей.

    Один комментарий о плазмидных препаратах: лизис сильно отличается от экстракции для выделения РНК или геномной ДНК, потому что плазмида должна быть сначала отделена от геномной ДНК, и если вы добавите хаотропы, вы высвободите все сразу и не будете иметь возможность отделить маленькую кольцевую ДНК от высокомолекулярной хромосомы. Таким образом, в плазмидных препаратах хаотропы не добавляются до тех пор, пока не происходит лизис, и соли не используются для связывания.

    После извлечения ДНК происходит очистка: связывание ДНК с колонкой

    Хаотропные соли имеют решающее значение для лизиса, а также для связывания нуклеиновых кислот с колонкой. Кроме того, для усиления и влияния на связывание нуклеиновых кислот с диоксидом кремния также добавляют спирт. В большинстве случаев это этанол, реже — изопропанол. Процент этанола и объем имеет большое значение.  Слишком много, и вы получите много разложившихся нуклеиновых кислот и мелких частиц, которые будут влиять на показания поглощения света и снижать выход эксперимента. Слишком мало – возникнут при смывании всей соли с мембраны. Важным моментом здесь является то, что этанол влияет на связывание, и добавленное количество оптимизируется для любого набора, который вы используете. Изменение этого шага может помочь изменить то, что вы восстанавливаете, поэтому, если у вас возникли проблемы и вы хотите устранить неполадки восстановления, это может быть шагом для дальнейшей оценки.

    Еще один способ диагностики проблем — сохранить поток после связывания и ускорить его, чтобы увидеть, можете ли вы найти искомые нуклеиновые кислоты. Если вы использовали SDS-содержащее моющее средство при лизисе, попробуйте использовать NaCl в качестве осадителя, чтобы избежать загрязнения ДНК или РНК моющим средством.

    Отмывка ДНК (или РНК)

    Набор для выделения геномной ДНК Invitrogen PureLink Pro 96

    Ваш лизат был центрифугирован через силикагелевую мембрану, и теперь ваша экстрагированная ДНК или РНК должна быть связана с колонкой, а примеси, белок и полисахариды должны были пройти. Но мембрана все еще загрязнена остаточными белками и солью. Если образец был взят из растений, на мембране все еще будут присутствовать полисахариды, возможно, некоторые пигменты.

    Этапы промывки служат для удаления этих примесей. Обычно есть две промывки, хотя это может варьироваться в зависимости от типа образца. Первая промывка часто содержит небольшое количество хаотропной соли для удаления белка и цветных загрязнений. За этим всегда следует промывка этанолом для удаления солей. Если в препарате недостаточно белка для начала, (плазмидные препараты или очистка продуктов Полимеразная цепная реакция), тогда необходима только промывка этанолом.

    Удаление хаотропных солей имеет решающее значение для получения высоких выходов и чистоты нуклеиновых кислот. Некоторые наборы даже дважды промывают колонку этанолом. Если соль останется, элюирование нуклеиновой кислоты будет плохим, и показание A230 (поглощение света с длиной волны 230 нм) будет высоким, что приведет к низким отношениям 260/230. Для ДНК и РНК, не содержащих этанол, вам нужна сухая колонка. После промывки этанолом большинство протоколов имеют стадию центрифугирования для высушивания колонки. Это необходимо для удаления этанола и важно для чистого элюента. Когда для элюирования на мембрану наносят 10 мМ Трис-буфера или воду, нуклеиновые кислоты могут гидратироваться и высвобождаться из мембраны. Если в колонке все еще есть этанол, то нуклеиновые кислоты не могут быть полностью регидратированы.

    Пропуск этапа сушки приводит к загрязнению этанолом и низким выходам. Если вы не видете абсорбции этанола на Nanodrop, то он не будет отображаться в ваших показаниях. Основные признаки проблемы состоят в том, что при попытке загрузить образец в агарозный гель ДНК не утонет. Даже при наличии красителя. Другим показателем является то, что если вы поместите образец в -20°C, он не замерзнет.

    Экстракция РНК и ДНК, последний рубеж: элюция

    Последним этапом в протоколе экстракции ДНК является освобождение чистой ДНК или РНК из силикагеля.

    Для приготовления ДНК обычно используют 10 мМ Трис при рН 8-9. ДНК более стабильна при слегка щелочном pH и быстрее растворяется в буфере. И это применимо также для гранул ДНК. Вода имеет тенденцию иметь низкий pH, так как 4-5 и высокомолекулярная ДНК могут не полностью регидратироваться за короткое время, используемое для элюции. Элюция ДНК может быть максимизирована, если позволить буферу сидеть в мембране в течение нескольких минут перед центрифугированием.

    РНК элюируется хорошо при слегка кислом pH, и поэтому вода является предпочтительным разбавителем. РНК легко растворяется в воде.

    Что еще может пойти не так?

    Низкий выход: если выход ДНК/РНК ниже, чем вы ожидали для образца, есть много факторов, которые стоит проанализировать. Обычно это проблема лизиса — неполный лизис является основной причиной низкого выхода. Это также может быть вызвано неправильными условиями связывания. Обязательно используйте свежий высококачественный этанол для разбавления буферов или для добавления на стадии связывания. Возможно, этанол низкого качества или в старые запасы попала вода и они имеют неправильную концентрацию. Если буфер для промывки сделан неправильно, возможно, вы смываете извлеченную ДНК или РНК.

    Низкая чистота: если извлеченная ДНК загрязнена белком (низкое соотношение  260/280), возможно, вы начали с слишком большого количества образца, и белок не был полностью удален или растворен. Если ДНК имеет плохое отношение 260/230, проблема обычно заключается в соли из связующего или промывочного буфера. Убедитесь, что этанол высочайшего качества использовался для приготовления промывочных буферов, и, если проблема не исчезнет, ​​дайте колонке дополнительную промывку.

    Некоторые образцы имеют гораздо больше ингибиторов по сравнению с другими. Образцы окружающей среды особенно подвержены проблемам с чистотой, потому что гуминовые вещества растворяются во время экстракции. Хьюмик ведет себя подобно ДНК и его трудно удалить из колонки с диоксидом кремния. Для этого типа образца  существуют специальные методы для удаления белка и гуминов перед стадией колонки.

    Деградация:  В основном при экстракции РНК деградация происходит из-за неправильного хранения образца или неэффективного лизиса, при условии что вы элюировали водой без РНКазы. Для экстракции ДНК деградация не является большой проблемой, потому что для ПЦР ДНК можно разрезать, и она работает нормально. Но если вы надеялись не иметь слишком много сдвинутой ДНК, возможно, вы использовали слишком сильный метод лизиса.

    Особые замечания по очистке для ПЦР: Очистка продуктов ПЦР сама по себе не является методом выделения ДНК, но это приятный и простой метод, потому что это просто добавление высокой концентрации связывающих солей (обычно между 3-5 объемами соли на объемы реакции) и центрифугирование через колонку. Поэтому, когда наборы для очистки ПЦР выходят из строя, это может быть особенно неприятно. Первый вопрос, который я задаю людям: «Вы проверили результаты ПЦР на геле?», Потому что вы не можете проверить реакцию ПЦР в УФ-свете и получить точные показания. В 260-й реакции ПЦР поглощается слишком много ультрафиолетового излучения: нуклеотиды, детергенты, соли и праймеры. По моему опыту, отказ комплекта для очистки ПЦР работать часто вызван неудачной реакцией. Но если вы знаете, что у вас был сильный продукт ПЦР, Наилучший подход — просто сохранить свою долю потока после связывания. Если ДНК не связывается, вот где она. Вы всегда можете спасти его, а затем очистить снова. А затем позвоните в техподдержку и попросите заменить комплект.

    Как ученые, конечно, мы хотим точно знать, что происходит с нашими экспериментами, и иметь возможность устранять неполадки, не обращаясь в службу технической поддержки.

    Я надеюсь, что эта статья поможет прояснить некоторые научные аспекты метода спин-фильтрации с силикагелем для экстракции РНК и ДНК, чтобы вы могли самостоятельно поставить диагноз и исправить его. Таким образом, когда вы звоните в службу технической поддержки, вы сначала дважды проверили несколько наиболее вероятных причин проблем, и вместо того, чтобы пройти через множество ошибок, вы сможете быстрее найти решение. Даже если это бесплатный набор для замены ДНК!

    Методы выделения ДНК и РНК из биологического материала

    Методы выделения нуклеиновых кислот

    Практически все научные исследования в области молекулярной биологии на той или иной стадии включают этап выделения нуклеиновых кислот. Выделенные нуклеиновые кислоты затем используют в ПЦР (ОТ-ПЦР), секвенировании и для множества других задач, причем технологии выделения различаются не только по принципу своего действия, но и в зависимости от типа биоматериала и последующего применения экстракта.

    Впервые нуклеиновые кислоты пытались выделить в середине XIX века, когда ещё практически ничего не было известно об этих молекулах. Однако с момента открытия структуры и свойств ДНК технологии её выделения непрерывно модифицируются и совершенствуются. Рассмотрим самые распространенные и прогрессивные методики, используемые для экстракции нуклеиновых кислот.

    Выделение фенол-хлороформом

    Первое упоминание об использовании этого метода встречается в статьях с 1967 года, и с тех пор эта технология является одним из самых распространённых способов выделения нуклеиновых кислот в большинстве исследовательских лабораторий.

    Суть методики заключается в смешивании клеточного лизата с фенолом, хлороформом и изоамиловым спиртом в определенных пропорциях и последующем перемешивании и центрифугировании смеси.

    При выделении нуклеиновых кислот из сложных исходных образцов, таких как кровь или ткани, включают в себя лизис биологического материала детергентами или хаотропными агентами иногда в присутствии разрушающих белки ферментов. После этого этапа следуют несколько стадий, в которых используются органические растворители, такие как Фенол/Хлороформ или Тризолом с последующим осаждением в Изопропиловом спирте. Полное отделение белков от нуклеиновых кислот может быть достигнуто добавлением перхлората натрия.

    При перемешивании клеточного лизата и фенола формируются две фазы: водная и органическая, причем все липиды и жиры находятся в органической (нижней) фазе, белки — на границе фаз, а нуклеиновые кислоты — в водной (верхней) фазе. Для повышения чистоты экстракта эти действия повторяют несколько раз. Если раствор будет иметь низкий pH, то ДНК перейдёт в органическую фазу, а РНК останется в водной фазе, что позволяет выделять РНК отдельно от ДНК. Дополнительно можно попробовать селективное инкубирование с хлоридом лития или специфичное безнуклеазное изолирование с гуанидин хлоридом или гуанидин тиоцианатом, скомбинированное с фенольной экстракцией или этанольной преципитацией. Стандартная методика получения чистого препарата основана на том, что ДНК является полярной молекулой и не растворяется в органических растворителях.

    Данный метод используется повсеместно, поскольку он не требует дополнительного сложного оборудования и имеет невысокую стоимость. Однако этот метод ориентирован на работу с такими агрессивными веществами, как фенол и хлороформ, и присутствуют стадии центрифугирования и жидкостной экстракции, которые нельзя автоматизировать. Также весь протокол занимает достаточно много времени.

    Сорбционная экстракция на поверхности silica и silica-spin колонках.

    Сорбционная экстракция – методика, в основе которой лежит избирательная сорбция на поверхности silica в присутствие хаотропной соли. Ингибиторы и другие компоненты клинического материала остаются в растворе. С помощью центрифугирования силика с НК осаждается, а супернатант c ингибиторами ПЦР удаляется. Серия последующих отмывок обеспечивает получение высокоочищенного препарата НК.

    Технология выделения на silica-spin колонках — это усовершенствованный метод экстракции на частичках silica, предложенный американскими учёными в 1979 году. Метод колоночного выделения использует то же свойство нуклеиновых кислот адгезироваться на поверхности материала silica в присутствии хаотропных ионов, и легко смываться в их отсутствии. Данный метод пришел из органической химии, где на первых этапах набивались стеклянные колонки различными материалами, в том числе silica, потом ДНК и РНК смывались, и далее колонка разбиралась и набивалась заново. Чтобы исключить эти трудоемкие этапы, было предложено использовать одноразовые пластиковые колонки, уже с прослойкой silica-мембраны, которые идеально подходят по размеру к обычным пробиркам эппендорф на 1,5 и 2 мл. Спин-колонки сконструированы таким образом, что при нанесении клеточного лизата на колонку и последующем центрифугировании ДНК остаётся на колонке, а всё лишнее проходит сквозь неё. Затем ДНК промывают несколько раз и элюируют в пробирку для сбора образца.

    Чаще всего для лизиса используются хаотропные агенты, например гуанидин тиоцианат, которые дестабилизируют водородные связи, ван-дер-ваальсовы и гидрофобные взаимодействия. В таких условиях растворимость ДНК/РНК в воде снижается, а белки денатурируют. Кроме хаотропных солей в лизирующем буфере чаще всего присутствуют детергенты, которые способствуют растворению и лизису белков.

    Хаотропная соль необходима не только для лизиса, но и для процесса сорбции нуклеиновых кислот. Также для усиления процесса сорбции в некоторых протоколах рекомендуют добавлять спирт. Нужно отметить, что сорбция ДНК на силике под действием хаотропных солей – процесс, который по-прежнему вызывает много споров. Однако среди всех существующих точек зрения на процесс взаимодействия ДНК с силикой можно выделить несколько основных.

    Первая точка зрения состоит в том, что сорбция ДНК на силике происходит за счёт образования катионных мостиков между силанольными группами, расположенными на поверхности силики и фосфатными группами ДНК. Известно, что в растворе при рН 6 – 8 поверхность силики отрицательно заряжена, как и фосфатные группы НК. Из-за электростатического отталкивания взаимодействие между ними невозможно. Однако при добавлении хаотропной соли отрицательный заряд экранируется. В таких условиях молекулы НК сорбируются на поверхности силики за счет ван-дер-ваальсовых взаимодействий.

    Вторая точка зрения опирается на свойства хаотропных агентов. Известно, что молекула НК в растворе покрыта гидратной оболочкой. Попадая в раствор, молекулы хаотропной соли активно разрушают водородные связи, присоединяя к себе воду. В итоге молекула ДНК, лишённая своей гидратной оболочки, становится гидрофобной. То же самое происходит с поверхностью силики. В итоге между ДНК и силикой возникают гидрофобные взаимодействия, и идёт процесс сорбции.

    Согласно еще одной точке зрения основным механизм взаимодействия ДНК и силики является образование водородных связей между водой и молекулами НК. Подобные выводы были сделаны после выявления зависимости между количеством адсорбированной ДНК и диаметром пор силики.

    Предполагается, что сорбция происходит за счет взаимодействия гидратных оболочек образованных поверхностью поры и молекул НК. Авторы подчеркивают, что НК лишь частично включается в поры, а основная часть молекул торчит на поверхности. В данной теории не ясным остаётся роль хаотропных солей, присутствующих в растворе. Вследствие этого наиболее вероятными вариантами механизма сорбции представляются первые два, которые являются взаимодополняющими.

    Необходимо также отметить, что процесс сорбции лучше всего идет при высокой ионной силе раствора, показателях рН 3,5-6,5 (оптимум рН 5) и температуре выше 37 °С.

    Преимущества такого метода заключаются в повышенной чистоте и хорошем качестве выделенных нуклеиновых кислот, высокой воспроизводимости и простоте по сравнению с выделением фенол-хлороформом. Однако также большое количество манипуляций может привести к контаминации, а выделение коротких фрагментов ДНК на спин-колонках может быть затруднено.

    Экстракция на спин-колонках может занять от 20 минут в зависимости от биоматериала и сложности его лизиса. Стоимость одного выделения здесь значительно выше, чем у предыдущего метода, поскольку на каждую реакцию необходима своя колонка, несколько пробирок для сбора фильтрата и элюата и, конечно, реагенты.

    Спиртовое осаждение нуклеиновых кислот

    После осаждения спиртом нуклеиновые кислоты отделяется от раствора центрифугированием. Осадок, содержащий целевую НК, отмывается 70% этиловым спиртом с последующим центрифугированием. После удаления супернатанта осадок подсушивается и растворяется в водном буфере. Роль соли в протоколе экстракции состоит в том, что её положительно заряженные ионы нейтрализуют отрицательный заряд на сахаро-фосфатном скелете НК, приводя к снижению растворимости последних в воде. В водном растворе электростатическое притяжение положительно заряженных ионов и отрицательно заряженных фосфатных групп подчиняется закону Кулона и зависит от диэлектрической константы раствора. Вода имеет большую диэлектрическую константу, что затрудняет взаимодействие ионов, тогда как этанол с гораздо более низкой диэлектрической константой способствует взаимодействию положительно заряженного иона и фосфатной группы, что приводит к выпадению НК в осадок. Нужно отметить, что НК менее растворима в изопропаноле, чем в этаноле, соответственно для ее осаждения требуются меньшая концентрации изопропанола (для выпадения НК в осадок достаточно присутствия 35 % изопропанола и 0,5 М соли, в то время как этанола требуется около 75% при той же концентрации соли). Таким образом, к образцу изопропанола необходимо добавлять 0,7-1 объема образца, а этанола 2,-2,5 объема. Следовательно, изопропанол предпочтительнее использовать, если есть ограничения по объему используемого пластика (например, есть возможность добавить только один объем образца). В ряде протоколов экстракции предлагается проводить осаждение (преципитацию) НК при пониженной температуре (-20°С). Однако, есть исследователи не согласные с этой теорией; по результатам их экспериментов температура инкубации со спиртом не имеет значительного влияния на выход продукта. Главенствующая роль, по их мнению, должна быть отведена продолжительности центрифугирования.

    При выделении малых количеств НК (менее 100 нг) для визуализации осадка и улучшения процесса преципитации рекомендуется использовать соосадители, такие как гликоген, линейный полиакриломид или декстран. В некоторых протоколах экстракции предлагается добавлять соосадители непосредственно к осадителю (этанолу или изопропанолу). Делать этого, однако, не следует, так как соосадитель, попадая непосредственно в спирт, начинает образовывать центры нуклеации в отсутствие НК и, соответственно, при последующем смешивании с образцом в меньшей степени способствует агрегации НК. Соосадитель, таким образом, следует добавлять непосредственно в лизирующий буфер или к образцу.

    На предпоследнем этапе выделения ДНК проводится добавление 70% этанола для отмывки осадка от остатков солей. Важно, чтобы отмывка проводилась именно водным раствором спирта, так как соли хорошо растворяются в воде и в гораздо меньшей степени в спирте. Кроме того, использование 70% этанола препятствует переходу НК в водную фазу.

    На завершающем этапе процедуры происходит растворение НК в водном буфере обычно при температуре 56-65°С и вортексировании, что необходимо для лучшего растворения осадка.

    Выделение на магнитных частицах

    Спустя 20 лет после появления метода выделения на спин-колонках начинает набирать популярность более быстрый способ выделения на магнитных частицах 6. Технология этого способа выделения основана на связывании нуклеиновой кислоты с веществом, покрывающим магнитные частицы (целлюлоза, сефадекс, сефакрил, dT-олигонуклеотиды, специфичные олигонуклеотиды и др.). К клеточному лизату добавляют такие магнитные частицы и перемешивают для связывания ДНК с ними. После этого пробирку ставят в магнитный штатив или подносят к магниту, фиксируя таким образом твердую фазу. После отбора супернатанта нуклеиновые кислоты на частицах промывают и элюируют.

    Этот метод имеет те же преимущества, что и выделение на спин-колонках, но для экстракции на магнитных частицах не требуется сложное лабораторное оборудование (например, центрифуга). Более того, процесс выделения на магнитных частицах легко автоматизировать, и многие автоматические станции выделения основаны именно на этой методике 3. Однако здесь также присутствует риск контаминации и потерь образца.

    Данный протокол выделения займет немного меньше времени благодаря отсутствию этапов центрифугирования, но количество манипуляций будет примерно таким же. Также стоимость одной реакции обычно выше, чем при выделении на колонках, а панели наборов предоставляют Qiagen, Analytik Jena,  ThermoFisher и другие.

    Ферментативное температурно-зависимое выделение

    Все вышеперечисленные методики имеют общую лимитирующую стадию — этап лизиса. Во всех технологиях используется SDS и протеиназа K для разрушения клеточных стенок и высвобождения нуклеиновых кислот. SDS является ингибитором ПЦР, именно поэтому необходимы множественные стадии промывки, которые повышают риск контаминации и приводят к потерям образца. Также более сложные для лизиса образцы могут требовать дополнительную долгую и трудозатратную пробоподготовку.

    Клинический образец помещается в пробирку с лизирующим буфером, затем подвергается термической обработке, в процессе которой происходит деструкция клеточных мембран, вирусных оболочек и других биополимерных комплексов и высвобождение НК. С помощью последующего центрифугирования нерастворимые компоненты осаждаются на дне пробирки, а надосадочная жидкость (супернатант), содержащая ДНК, используется для проведения ПЦР.

    Данная технология оптимальна для работы с малым количеством биоматериала, поскольку нет потерь нуклеиновых кислот. Также эту методику легко автоматизировать, она самая быстрая среди всех упомянутых способов выделения (от 7 минут) и включает меньше всего манипуляций. Стоимость одной реакции невысока, поскольку кроме реагентов не требуется никаких специальных расходных материалов.

    Разработки наборов для выделения нашей компании.

    На данный момент в нашей компании ВМТ разрабатываются наборы для пробоподготовки на основе всех трех подходов к экстракции НК:

    • Набор на основе сорбционной экстракции. Эту надежную, проверенную, хорошо работающую методику, нашедшую широкое применение в клинической практике мы адаптировали для выделения геномной ДНК из цельной крови и сыворотки.
    • Набор на основе спиртового осаждения. Эту надежную, проверенную, хорошо работающую методику, нашедшую широкое применение в клинической практике мы адаптировали для выделения геномной ДНК из цельной крови и сыворотки.
    • Набор для выделения нуклеиновых кислот методом сорбции на silica-spin колонках – наиболее интересная и перспективная разработка.

     

    #13 Очистка нуклеиновых кислот: многообразие методов и подходов

    25.06.2020

    Одной из базовых методик практически в любом эксперименте является выделение нуклеиновых кислот. Причем, зачастую, от качества выделенной нуклеиновой кислоты зависит успех всего дальнейшего эксперимента, поэтому к подбору реагентов для экстракции НК стоит подходить ответственно. Мы решили рассмотреть различные технологии выделения НК, их особенности, преимущества и недостатки, чтобы вы смогли подобрать идеальное решение для ваших индивидуальных задач.

    Методы выделения НК, применяемые в современных коммерческих наборах

    Впервые нуклеиновые кислоты были выделены швейцарским физиологом Фридрихом Мишером в 1869 году. Он изучал химический состав животных клеток и заметил, что из ядер лейкоцитов можно выделить некое неизвестное ранее вещество – «нуклеин». Позже, благодаря кислотным свойствам этого вещества, его стали называть «нуклеиновая кислота». Технология выделения НК Фридриха Мишера была очень трудоемкой, она включала много сложных этапов и занимала несколько дней.

    Спустя 100 лет после открытия нуклеиновых кислот исследователи по всему миру стали широко использовать технологию фенол-хлороформного выделения.

    Рис.1 Схема протокола выделения НК фенол-хлороформным методом.

    В данной методике образец лизируют, а затем лизат смешивают с фенолом, хлороформом и изоамиловым спиртом. После центрифугирования эта смесь разделяется на две фазы, причем в нижней органической фазе остаются все жиры и липиды, в интерфазе – белки, а в верхней водной фазе – нуклеиновые кислоты (Рис.1). Для повышения чистоты экстракта эти действия повторяют несколько раз и таким образом получают выделенные и очищенные НК.

    Метод фенол-хлороформной экстракции широко распространен благодаря своей дешевизне, но он всё же уступает другим технологиям по качеству и выходу НК, а также требует сложных и длительных манипуляций, которые могут привести к контаминации и потере образца, а сам процесс трудно автоматизировать.

    В 1979 году американские учёные продемонстрировали, что при определённых условиях НК способны связываться с силикатами, что позволяет отделить все остальные компоненты клетки от частиц силики, со связанными НК. Их открытие легло в основу двух технологий: выделения НК на спин-колонках и на магнитных частицах.

    Спин-колонки сконструированы таким образом, что при нанесении лизированного образца на колонку и последующем центрифугировании НК остаются на кремниевой мембране колонки, а все остальные компоненты образца проходят сквозь неё (Рис.2). Затем НК можно промыть и элюировать в пробирку для сбора образца.

    Рис.2 Схема протокола выделения НК на спин-колонках.

    Основные преимущества метода - чистота и высокое качество выделенных нуклеиновых кислот, высокая воспроизводимость и простота по сравнению с выделением фенол-хлороформом. Однако также большое количество манипуляций может привести к контаминации, а выделение коротких фрагментов ДНК на спин-колонках может быть затруднено.

    Спустя 20 лет после появления метода выделения на спин-колонках становится популярным более быстрый способ выделения на магнитных частицах. Технология этого способа экстракции основана на связывании нуклеиновой кислоты с веществом, покрывающим магнитные частицы.

    Рис.3 Схема протокола выделения НК на магнитных частицах.

    К лизированному образцу добавляют такие магнитные частицы и перемешивают для связывания НК с ними. После этого пробирку ставят в магнитный штатив или подносят к магниту, фиксируя таким образом твердую фазу. После отбора супернатанта нуклеиновые кислоты на частицах промывают и элюируют (Рис.3).

    Этот метод так же хорош, как и выделение на спин-колонках, но для экстракции на магнитных частицах не нужно сложное оборудование (например, центрифуга), а сам процесс легко автоматизировать, и многие автоматические станции выделения основаны именно на этой технологии.

    Вы можете найти наборы для выделения НК от SkyGen у следующих брендов:

    Наборы для выделения НК от компании New England Biolabs

    Американская компания New England Biolabs представляет линейку наборов Monarch® для выделения и очистки нуклеиновых кислот:

    T3010 L/S

    Набор Monarch® для выделения геномной ДНК
    (150/50 реакций)

    T1030 L/S

    Набор Monarch® для очистки ДНК-продуктов ПЦР и ферментативных реакций
    (250/50 реакций)

    T1020 L/S

    Набор Monarch® для выделения ДНК из агарозного геля
    (250/50 реакций)

    T1010 L/S

    Набор Monarch® для выделения плазмидной ДНК, 20 мкг
    (150/50 реакций)

    T2030, T2040, T2050 L/S

    Набор Monarch® для очистки РНК-продуктов ферментативных реакций
    (100/10 реакций)

    Все наборы основаны на технологии выделения НК на спин-колонках и позволяют получить экстракт очень высокого качества.

    Основываясь на собственном опыте и отзывах наших клиентов, мы рекомендуем использовать набор Monarch® (Т3010 L/S) для выделения геномной ДНК для дальнейшего секвенирования на платформах Oxford Nanopore Technology (MinION, GridION, PromethION).

    Вы можете узнать подробнее об особенностях и преимуществах этого набора в нашем обзоре.

    В каталог  Продукция на сайте NEB  Линейка Monarch    

    Видеобиблиотека  Брошюра

    Продукция для выделения НК от компании Analytik Jena

    Все наборы для выделения НК от немецкой компании Analytik Jena основаны на технологии двойной химии (Dual Chemistry Technology, DC-Technology), которая была разработана и запатентована в 2005 году. Она основана на использовании буферов с содержанием хаотропных и нехаотропных солей с низкой ионной силой в определенной комбинации. Это позволяет НК прочнее связываться с твердой фазой, а также сокращать время выделения благодаря более эффективному лизису.

    innuPREP и blackPREP - линейки наборов для выделения НК на спин-колонках из широкого спектра образцов. В линейке blackPREP представлены колонки чёрного цвета, других отличий от innuPREP у этой линейки нет.

       

    В данных линейках представлены наборы для выделения НК из следующих типов биологических образцов:

    • Кровь
    • Ткани, клетки и мазки
    • Бактерии
    • Криминалистические образцы
    • Вирусные НК из биологических жидкостей, тканей и мазков
    • Растения
    • Фекалии
    • Образцы пищи
    • Клещи
    • Фрагменты хвостов грызунов
    • Мазки буккального эпителия
    • Парафиновые срезы = FFPE
    • Гели и смеси

    Для использования наборов innuPREP и blackPREP потребуется следующее оборудование:

    • Дозаторы
    • Вортекс
    • Термошейкер
    • Центрифуга до 10.000 g (~ 12.000 rpm)

    innuSPEED – линейка наборов для выделения НК на спин-колонках из сложнолизируемых образцов. Данная панель адаптирована под этап механического лизиса на гомогенизаторе (можно заменить на вортекс) в специальных пробирках с шариками. Такие пробирки со стеклянными, керамическими или стальными шариками различного размера уже входят в состав наборов, а также их можно приобрести отдельно и комбинировать с любыми другими наборами.


    Наборы innuSPEED позволяют выделять НК из следующих образцов:

    • Бактерии и грибы
    • Растения
    • Ткани
    • Почва

    Для использования наборов innuSPEED потребуется следующее оборудование:

    • Дозаторы 
    • Вортекс 
    • Гомогенизатор SpeedMill (или любой другой, а также можно заменить на вортекс) 
    • Термошейкер 
    • Центрифуга до 10.000 g (~ 12.000 rpm)

    Наряду с DC-Technology компания Analytik Jena разработала технологию SmartExtraction, которая основана на связывании НК с частицами с особой смарт-поверхностью. Это обеспечивает более эффективное связывание высокомолекулярной ДНК, а также уменьшение стресс-факторов за счет отсутствия этапов вортексирования и центрифугирования. Методика основана на выделении НК при помощи систем дозирования жидкостей. Для экстракции используют специальные наконечники с «умными» частицами, которые надеваются на дозатор. При заборе лизированного образца в наконечник нуклеиновая кислота из раствора связывается с частицами, затем следуют этапы промывки и элюции, в результате чего получается очищенная нуклеиновая кислота высокого качества (Рис.4).

    Рис.4 Схема протокола выделения НК при помощи технологии SmartExtraction.

    Так выглядит схема автоматической экстракции, но в портфолио Analytik Jena также присутствуют два набора для ручного выделения ДНК на магнитных частицах с такой «умной» поверхностью из крови и клеток и тканей.

    Каталог реагентов

    При больших потоках образцов и для упрощения этапа экстракции НК можно использовать автоматические решения от Analytik Jena:

    InnuPure C16 touch

    CyBio SELMA

    CyBio Felix

    Предназначена для эффективной и воспроизводимой экстракции ДНК/РНК при помощи технологий выделения на магнитных частицах, а также SmartExtraction. Полуавтоматическая компактная дозирующая система для раскапки 96- и 384-луночных планшетов.

    Можно адаптировать для выделения НК.

    Автоматическая дозирующая станция с гибкой модульной системой, которую легко трансформировать под индивидуальные задачи.

    Продукция для выделения НК от компании QIAGEN

    В нашем портфолио есть широкий спектр наборов для выделения НК от компании QIAGEN, причем особенность этих реагентов заключается в том, что можно подобрать набор под очень узкоспециализированную задачу в зависимости от типа выделяемой НК и биологического материала.

    Такие реагенты лучше всего подойдут пользователям с нестандартными задачами, например в каталоге QIAGEN есть наборы для выделения сцДНК, митохондриальной и космидной ДНК или микроРНК.

    Также есть наборы для элюции образца в очень малых объемах, для работы с архивными и сложнолизируемыми образцами, для выделения на спин-колонках, магнитных частицах или ферментативной экстракции в одной пробирке.

    Подробнее изучить наборы QIAGEN вы можете в каталоге на официальном сайте.

    В портфолио QIAGEN есть и автоматические станции для выделения НК:


           

    QIAcube Connect

    QIAcube HT

    QIAsymphony

    • Аналог ручного колоночного выделения
    • До 12 образцов одновременно
    • Совместим более чем с 80 наборами для выделения НК
    • Технология сорбции на кремниевой мембране
    • 24-96 образцов одновременно
    • Совместим с 7 наборами для выделения НК
    • Технология сорбции на магнитных частицах
    • 24 - 96 образцов одновременно
    • Совместим с модулем для ПЦР
    • Есть РУ

    Продукция для выделения НК от компании MicroGEM

    Новозеландская компания MicroGEM представляет уникальную технологию ферментативного температурно-зависимого выделения НК в одной пробирке. Она начинается со смешивания буфера и особых ферментов с биологическим образцом. При последующей инкубации при 75°C протеиназы разрушают клетки и высвобождают нуклеиновые кислоты. Дальнейшее нагревание до 95°C дезактивирует протеиназы, и после этого образец готов для дальнейшего исследования (Рис.5).

    Рис.5 Схема протокола ферментативного температурно-зависимого выделения НК.

    Эта технология очень простая и быстрая, и здесь отсутствуют потери НК, что позволяет работать даже с небольшим количеством образца. Однако, от этой технологии стоит отказаться, если для вас важна чистота выделяемой НК.

    Узнать больше о данной технологии вы можете в нашем обзоре.

    Наша команда научной поддержки может помочь с подбором идеального набора для ваших задач, для этого необходимо заполнить форму:

    Подобрать набор


    К вопросу о выделении геномной днк из содержимого костного канала фрагментов трубчатых костей

    Publication in electronic media: 12.11.2011 under http://journal.forens-lit.ru/node/494
    Publication in print media: Актуальные вопросы судебной медицины и экспертной практики, Барнаул-Новосибирск 2011 Вып. 17

    Г.В. Червоная, С.Г. Хайдаршин

    г. Барнаул

    Тема экстракции геномной ДНК из костной ткани в практике судебно-медицинской экспертизы вещественных доказательств в последнее время становится всё более актуальной. В процессе выделения ДНК из биологического материала основная задача – хорошо диспергировать ткань, чтобы разрушить клетки, а затем отделить ДНК от сопутствующих ей белков и посторонних примесей для получения препарата с чистотой, пригодной для постановки ПЦР. С мягкими тканями в большинстве случаев проблем не возникает, а вот выделение ДНК из кости гораздо более трудоемко и требует специальных подходов.

    Общепринятая методика получения ДНК из костной ткани предполагает очень длительный (в течение нескольких дней) процесс пробоподготовки, декальцификации и очистки ДНК с использованием фенол-хлороформной экстракции. К недостаткам метода нужно отнести очень высокую токсичность (использование в процессе выделения агрессивных органических соединений). Он довольно трудоемок, при этом возможны значительные потери ДНК, остаточные загрязнения протеинами, фенолом и хлороформом – сильными ингибиторами ПЦР. В конечном итоге в большинстве случаев приходится сталкиваться с проблемой нестабильности конечного результата – результаты либо отрицательные, либо труднотрактуемые.

    С целью поиска альтернативных методов выделения, нами была использована методика исследования содержимого костного канала фрагментов трубчатых костей в качестве биологического материала для выделения геномной ДНК из кости. Мы испытывали различные варианты нефенольных методов выделения ДНК:

    • метод с использованием ионообменной смолы Chelex 100. Процедура заключается в очистке ДНК от металлосодержащих соединений и протеинов путем кипячения в присутствии Chelex 100, затем супернатант непосредственно добавляют в ПЦР-смесь;
    • метод с использованием набора реагентов DiatomTM DNA Prep 200 (Москва), основанного на использовании лизирующего реагента с гуанидинтиоцианатом, который предназначен для лизиса клеток, солюбилизации клеточного дебриса, а также для денатурации клеточных нуклеаз. В присутствии лизирующего реагента ДНК активно сорбируется на носителе NucleoSTM, с которого она легко снимается с помощью элюирующего буфера;
    • метод с использованием набора реагентов Diamond DNA Genomic DNA Extraction Kit for Animal Tissue Samples, в состав лизис-буфера которого входят компоненты предотвращающие адсорбцию ДНК на стенках пробирки, ее окисление и эффективно связывающие полифенолы. ДНК остается в растворе, а адсорбция примесей, ингибирующих ПЦР происходит с помощью сорбента, частицы которого имеют нанометровые размеры и не взаимодействуют с ДНК, что предотвращает ее механическую и химическую деградацию. Дополнительная очистка ДНК от белков, полисахаридов и компонентов лизис-буфера происходит вследствие селективного осаждения молекул ДНК высокоэффективным осадителем.

    Сравнительный анализ преимуществ и недостатков этих методов проводился с учетом: способности ДНК к амплификации; сохраняемости проб выделенной ДНК; длительности и трудоемкости процедуры пробоподготовки и экстрагирования; необходимости использования токсических веществ; материальных затрат.

    Исследовались кости от трупов, находящиеся в архиве нашего отделения, причина смерти которых не установлена из-за гнилостных изменений, промерзания и обгорания.

    Исследуемый материал готовился следующим образом: делались соскобы с внутренней поверхности трубчатых костей, содержимое высушивалось на отрезке марлевого бинта.

    Выделение хромосомной ДНК проводилось с использованием трех вышеуказанных методик.

    Амплификацию изучаемых полиморфных последовательностей ДНК методом ПЦР проводили в монолокусном формате, продукты полимеразной цепной реакции фракционировали электрофоретически в 8% ПААГ в денатурирующих условиях и анализировали в проходящем свете после окрашивания нитратом серебра с использованием коммерческих наборов НПФ “АТГ-Биотех” Москва. При этом были получены положительные результаты. В качестве примеров приводим 4 наблюдения.

    Наблюдение 1: 03.07.2010г. в результате взрыва на военном полигоне произошла гибель двух и более лиц, в отделение были доставлены три фрагмента бедренной кости от человеческих останков, наружная поверхность которых сильно обуглена, с наложениями вещества черного цвета, а содержимое костных каналов желтого и красновато-серого цвета. В результате исследования получены препараты ДНК мужской половой принадлежности, пригодные для идентификационного анализа (см. рис. 1).


    Рис. 1. Электрофореграмма амплифицированных фрагментов ДНК локуса Амелогенина содержимого костных каналов трех фрагментов бедренной кости от человеческих останков при взрыве на военном полигоне, выделенных: с использованием Chelex 100 – дорожки 1, 2, 3; набором реагентов Diamond DNA – дорожки 4, 5, 6 (соответственно).

    Наблюдение 2: 09.04.2010г. в отделение доставлен фрагмент бедренной кости от трупа неустановленного мужчины, погибшего при пожаре.

    Наблюдение 3: 01.04.2010г. в ходе тушения пожара в жилом доме обнаружены останки. Причина смерти не установлена из-за выраженного обугливания трупа.

    Наблюдение 4: 01.04.2008г. в лабораторию прислан фрагмент бедренной кости от трупа неизвестного мужчины, обнаруженного на улице. Причина смерти не установлена из-за выраженного гниения трупа. Дата смерти – осень–зима 2007-2008гг..

    В процессе исследования в феврале 2011г. из содержимого костных каналов фрагментов трубчатых костей наблюдений 2, 3, 4 выделены индивидуальные препараты ДНК мужской половой принадлежности и установлены их генотипические аллельные комбинации (см. рис. 2).


    Рис. 2. Электрофореграммы амплифицированных фрагментов ДНК STR – локусов D13S317 и F13A01: содержимого костного канала фрагмента бедренной кости от трупа неустановленного мужчины, погибшего при пожаре (наблюдение 2) – дорожка 1; содержимого костного канала фрагмента трубчатой кости останков, обнаруженных в ходе тушения пожара в жилом доме (наблюдение 3) – дорожка 2; содержимого костного канала фрагмента бедренной кости от трупа неизвестного мужчины, обнаруженного на улице (наблюдение 4) – дорожка 3.

    В результате исследования были сделаны следующие выводы:

    • исследование содержимого костного канала фрагментов трубчатых костей в качестве биологического материала для выделения геномной ДНК позволяет исключить длительный и трудоемкий процесс пробоподготовки в сравнении с исследованием компактного вещества костной ткани;
    • сама процедура выделения с использованием вышеперечисленных наборов проста в исполнении, предполагает малое количество стадий, непродолжительна по времени (процесс выделения занимал не более двух часов), экономична – позволяет затрачивать минимальные материальные ресурсы, и безопасна (исключает присутствие агрессивных органических соединений – фенола, хлороформа, толуола).

    При сравнительном исследовании трех методик выявлено, что метод выделения ДНК с использованием Chelex 100 в большинстве случаев не пригоден для работы с костной тканью, особенно гнилостно измененной, содержащей примеси, которые невозможно удалить с помощью ионообменников. Кроме того, многие микроорганизмы, размножающиеся в процессе гниения, не поддаются разрушению простым кипячением. Срок хранения выделенных таким образом препаратов ДНК непродолжителен.

    Два другие набора позволяют получить высокомолекулярный, чистый препарат ДНК, пригодный для идентификационного анализа, причем продолжительность хранения препаратов достаточно высока – более 1 года (при -20°С). Набор реагентов Diamond DNA позволяет получить низкие потери ДНК при экстракции, нанометровые частицы сорбента его нетоксичны, инертны и не ингибируют ПЦР, в отличие от гуанидинтиоцианата, который токсичен и даже следовые количества его в элюате могут ингибировать ферментативные реакции (см. рис. 3).


    Рис. 3. Электрофореграмма амплифицированных фрагментов ДНК локуса Амелогенина содержимого костных каналов трех фрагментов бедренных костей, выделенных: с использованием Chelex 100 – дорожки 1, 2, 3; набором реагентов DiatomTM DNA – дорожки 4, 5, 6; набором реагентов Diamond DNA – дорожки 7, 8, 9;

    Маркеры молекулярного веса: А – локус специфические аллельные маркеры, (К+) – положительный контрольный образец ДНК, (К–) – отрицательный контроль без ДНК.

    Таким образом, методы исследования содержимого костных каналов трубчатых костей с помощью наборов DiatomTM DNA и Diamond DNA пригодны для экспертного применения, просты, безопасны, экономичны, позволяют проводить эффективную экстракцию ДНК и могут быть использованы при невозможности получения образца жидкой крови трупа.

    Различия в выделении плазмид и геномной ДНК

    • О КОМПАНИИ
    • СПИСОК ЦЕН
    • ПОИСК ЛИТЕРАТУРЫ
    • СВЯЗАТЬСЯ С НАМИ
    • ВХОД
      • ВХОД
      • РЕГИСТР
    • ПРОТЕОМИКА
      • Моющие средства и аксессуары
        • Каликсареновые поверхностно-активные вещества
        • Растворы моющих средств Proteomic
        • Неионные детергенты
        • Ионные моющие средства
        • Цвиттерионные моющие средства
        • Системы удаления моющих средств
        • 2D-Моющие средства
        • Фторированные поверхностно-активные вещества
        • Принадлежности
      • Сшивание белков и модификация белков
        • Белковые сшивающие агенты
        • Восстанавливающие реагенты
        • Алкилирующие реагенты
        • Реагенты для расщепления белков
        • Реагенты йодирования
        • Аминокислотные модификаторы боковой цепи
        • денатуранты
        • Принадлежности
      • Очистка и хроматография
        • Смолы и методы аффинной очистки
        • Смолы для очистки антител
        • Гель-фильтрация / исключение по размеру
        • Хроматография с гидрофобным взаимодействием
    .

    Выделение геномной ДНК из ткани с использованием технологии ChargeSwitch | Thermo Fisher Scientific

    Protocol

    Связанная информация о продукте

    Наборы ChargeSwitch ® gDNA Mini и Micro Tissue позволяют быстро и эффективно очищать геномную ДНК от мини (10-25 мг) или микро (3-5 мг) количеств ткани, соответственно.После приготовления лизатов вы можете очистить ДНК менее чем за 15 минут с помощью технологии ChargeSwitch ® .

    Использование наборов по назначению

    Наборы тканей для гДНК ChargeSwitch ® разработаны для выделения геномной ДНК из следующих источников. Очищенная геномная ДНК подходит для использования в последующих приложениях, включая ПЦР, расщепление рестрикционными ферментами и Саузерн-блоттинг.

    • Micro-Tissue Kit: очищает до 5 мкг геномной ДНК из зажимов для ушей мыши диаметром 1-2 мм или 3-5 мг ткани.Этот размер образца подходит для очистки геномной ДНК из микропрепаратов или микропрепаратов с лазерным захватом.
    • Mini-Tissue Kit: очищает до 30 мкг геномной ДНК с кончиков хвоста мыши 0,5 см или примерно 25 мг ткани. Для ткани селезенки уменьшите размер ткани до 10 мг.


    Преимущества

    Использование наборов гДНК ChargeSwitch ® для выделения геномной ДНК дает следующие преимущества:

    • Использует технологию на основе магнитных шариков для выделения геномной ДНК без использования опасных химикатов, центрифугирования или вакуумных коллекторов
    • Быстрая и эффективная очистка геномной ДНК из микро- или миниатюрных тканей менее чем за 15 минут после подготовки образца и лизиса
    • Простой лизис тканей протеиназой К без необходимости механического лизиса
    • Минимальное загрязнение РНК
    • Очищенная геномная ДНК демонстрирует улучшенные последующие характеристики в приложениях, включая ПЦР, расщепление рестрикционными ферментами и Саузерн-блоттинг.


    Характеристики системы

    Микроткань мини-ткани
    Исходный материал: 10-25 мг 3-5 мг
    Объем элюции: 250 мкл 150 мкл
    Выход ДНК: до 30 мкг До 5 мкг
    Размер ДНК :> 20 kb> 20 kb

    Технология ChargeSwitch ®

    Технология ChargeSwitch ® (CST ® ) - это новая технология на основе магнитных шариков, которая обеспечивает переключаемый поверхностный заряд в зависимости от pH окружающий буфер для облегчения очистки нуклеиновой кислоты.В условиях низкого pH гранулы CST ® имеют положительный заряд, который связывает отрицательно заряженную основную цепь нуклеиновой кислоты (см. Рисунок ниже). Белки и другие загрязнители не связываются и просто смываются водным промывочным буфером. Для элюирования нуклеиновых кислот заряд на поверхности шарика нейтрализуется повышением pH до 8,5 с использованием буфера для элюирования с низким содержанием соли (см. Рисунок ниже). Очищенная ДНК мгновенно элюируется в этот буфер для элюции и готова к использованию в последующих приложениях.

    ChargeSwitch ® Характеристики магнитных шариков

    Связывающая способность шариков: 5-10 мкг геномной ДНК на мг
    Размер шариков: <1 мкм
    Концентрация шариков: 25 мг / мл
    Буфер для хранения: 10 мМ MES, pH 5,0 , 10 мМ NaCl, 0,1% Твин 20

    Схема эксперимента

    Введение

    На приведенном ниже рисунке показаны основные этапы, необходимые для очистки геномной ДНК из тканей с использованием наборов тканей для гДНК ChargeSwitch ® .

    Типы комплектов

    Это руководство поставляется со следующими продуктами.

    Продукт Каталожный номер
    Набор микротканей ChargeSwitch® gDNA CS11203
    ChargeSwitch® gDNA Mini Tissue Kit CS11204


    Транспортировка и хранение

    Все компоненты наборов тканей для гДНК ChargeSwitch® поставляются при комнатной температуре.По получении храните протеиназу K и РНКазу A при 4 ° C. Храните все остальные компоненты при комнатной температуре.

    Стабильность всех компонентов при правильном хранении составляет 6 месяцев.

    Содержание

    Компоненты, входящие в состав набора ChargeSwitch® gDNA Tissue Kits, перечислены ниже. Поставляемых реагентов достаточно для выполнения 25 (мини-ткани) или 50 (микротканей) очистки.

    Примечание: Некоторые реагенты в наборе могут быть превышены в необходимом количестве.

    Составная часть

    Количество

    Мини-ткань

    Микроткань

    ChargeSwitch ® Буфер для лизиса (L13)

    50 мл

    -

    ChargeSwitch ® Буфер для лизиса (L15)

    -

    50 мл

    ChargeSwitch ® Магнитные шарики

    3 х 1 мл

    2 х 1 мл

    Протеиназа К (20 мг / мл в 50 мМ трис-HCl, pH 8.5, 5 мМ CaCl 2 , 50% глицерина)

    500 мкл

    500 мкл

    РНКаза A (5 мг / мл в 10 мМ трис-HCl, pH 8,5, 10 мМ EDTA)

    250 мкл

    250 мкл

    ChargeSwitch ® буфер для очистки (N5)

    10 мл

    10 мл

    ChargeSwitch ® Промывочный буфер (W12)

    50 мл

    100 мл

    ChargeSwitch ® Буфер для элюции (E5; 10 мМ трис-HCl, pH 8.5)

    10 мл

    10 мл

    Материалы, предоставляемые пользователем

    В дополнение к реагентам, поставляемым с набором, перед началом работы вам необходимо иметь под рукой следующие материалы:

    • Стойка магнитной сепарации, подходящая для использования с 1.Микроцентрифужные пробирки 5 мл (см. Ниже)
    • Стерильные микроцентрифужные пробирки 1,5 мл
    • Вихревой смеситель
    • 20 мкл, 200 мкл и 1 мл стерильные, наконечники для пипеток
    • Водяная баня при 55 ° C


    MagnaRack ™

    MagnaRack ™, доступный от Invitrogen (каталожный номер CS15000), представляет собой стойку для магнитного разделения, состоящую из двух частей, для использования в протоколах с магнитными шариками. MagnaRack ™ состоит из магнитной базовой станции и съемной стойки для пробирок.Штатив для пробирок вмещает до 24 микроцентрифужных пробирок. Штатив для пробирок устанавливается на магнитную базовую станцию ​​в двух различных положениях, связывая ряд из 12 неодимовых магнитов с одним рядом из 12 трубок для простой обработки проб «на магните» и «вне магнита» (см. Рисунок ниже). Для получения дополнительной информации посетите сайт www.invitrogen.com или позвоните в службу технической поддержки.

    Информация по безопасности

    При использовании набора ChargeSwitch ® gDNA Tissue Kit соблюдайте приведенные ниже правила техники безопасности.

    • Относитесь ко всем реагентам, входящим в набор, как к потенциальным раздражителям.
    • Всегда носите подходящий лабораторный халат, одноразовые перчатки и защитные очки.
    • В случае разлива буфера промойте подходящим лабораторным моющим средством и водой. Если пролитая жидкость содержит потенциально инфекционные агенты, очистите пораженный участок сначала лабораторным моющим средством и водой, затем 1% (об. / Об.) Гипохлоритом натрия или подходящим лабораторным дезинфицирующим средством.


    Обращение с магнитными шариками ChargeSwitch ®

    Следуйте приведенным ниже инструкциям при обращении с магнитными шариками ChargeSwitch ® .

    • Не замораживать бусинки, так как это их непоправимо повредит. Храните шарики при комнатной температуре.
    • Всегда держите шарики в растворе. Не позволяйте им высыхать, так как это сделает их нефункциональными.
    • При использовании шариков тщательно ресуспендируйте их в буфере для хранения, встряхивая перед удалением.
    • Выбросьте шарики после использования. Не использовать повторно.


    Буфер для элюирования

    ChargeSwitch ® Буфер для элюирования (E5; 10 мМ трис-HCl, pH 8.5) поставляется с набором для элюирования ДНК из магнитных шариков ChargeSwitch ® . Для достижения наилучших результатов используйте буфер для элюции (E5) для элюирования ДНК. В качестве альтернативы можно использовать буфер TE с pH 8,5-9,0. Обратите внимание, что pH должен быть в пределах 8,5-9,0, иначе ДНК не будет элюироваться. Не используйте воду для элюирования.

    Протокол рекомендует элюировать геномную ДНК в 150 мкл (Micro Kit) или 250 мкл (Mini Kit) буфера для элюции ChargeSwitch ® (E5). Вы можете изменять количество буфера для элюции ChargeSwitch ® (E5), используемого для получения геномной ДНК в желаемой конечной концентрации. Для достижения наилучших результатов всегда используйте объем элюирующего буфера ChargeSwitch ® (E5), который равен или больше объема магнитных шариков ChargeSwitch ® , используемых в протоколе . Если объем буфера для элюции ChargeSwitch ® (E5) меньше, чем объем используемых шариков, элюция ДНК не завершена. Возможно, вам потребуется выполнить второе элюирование, чтобы восстановить всю ДНК.

    Выделение геномной ДНК с помощью набора для микротканей

    Введение

    В этом разделе представлены рекомендации и инструкции по выделению геномной ДНК из микроколичеств ткани с помощью набора ChargeSwitch ® gDNA Micro Tissue Kit (каталожный номер.CS11203).

    Исходный материал

    Используйте эту процедуру для выделения геномной ДНК из:

    • Зажимы для ушей для мыши 1-2 мм
    • 3-5 мг ткани


    Если вы хотите выделить геномную ДНК из большего количества ткани или из кончиков хвоста мыши, см. Раздел «Выделение геномной ДНК с помощью мини-набора тканей».

    Необходимые материалы

    Перед началом работы имейте под рукой следующие материалы:

    • Образец (-ы) ткани (см. Выше)
    • MagnaRack ™ (№ по каталогу.CS15000) или другую стойку магнитной сепарации
    • Стерильные микроцентрифужные пробирки 1,5 мл
    • Вихревой смеситель
    • Стерильные наконечники для пипеток (20 мкл, 200 мкл и 1 мл)
    • Водяная баня


    Компоненты, входящие в комплект

    • ChargeSwitch ® Буфер для лизиса (L15)
    • Протеиназа К
    • РНКаза А
    • ChargeSwitch ® Магнитные бусины
    • ChargeSwitch ® Буфер для очистки (N5)
    • ChargeSwitch ® Промывочный буфер (W12)
    • ChargeSwitch ® Elution Buffer (E5) или TE Buffer (не входит в комплект; 10 мМ трис-HCl, 1 мМ EDTA, pH 8.5)


    Перед запуском

    Перед началом выполните следующее:

    • Установить водяную баню на 55 ° C.
    • Приготовьте смесь для лизиса: для каждого образца смешайте 1 мл буфера для лизиса ChargeSwitch ® (L15) и 10 мкл протеиназы K, чтобы приготовить смесь для лизиса. При выделении ДНК из нескольких образцов увеличьте объем используемых реагентов и приготовьте основную смесь для лизиса.


    Примечание. Буфер для лизиса ChargeSwitch ® может казаться слегка мутным.Если он мутный, встряхните флакон перед использованием, пока раствор не станет прозрачным.

    Подготовка лизата ткани

    Чтобы приготовить лизат из образца ткани, выполните описанную ниже процедуру.

    1. Поместите образец ткани в стерильную микроцентрифужную пробирку.

    2. Добавьте в пробирку 1 мл Lysis Mix (см. Выше). Убедитесь, что ткань полностью погружена в буфер для лизиса.

    3. Перемешайте на вортексе в течение 10-15 секунд.

    4. Инкубируйте образец в течение ночи при 55 ° C до завершения лизиса.

      Примечание: Продолжительность этапа инкубации можно сократить до 1-2 часов путем встряхивания образца не менее 4 раз в течение этого периода.

    5. Добавьте к лизату 5 мкл РНКазы А. Пипеткой вверх и вниз осторожно 5 раз или до получения однородного раствора.

      Важно: Для перемешивания образца используйте наконечник пипетки на 1 мл, установленный на 900 мкл. Убедитесь, что наконечник погружен в воду, и осторожно поднимайте и опускайте пипетку, чтобы избежать образования пузырьков, поскольку это может привести к срезанию ДНК.

    6. Инкубируйте при комнатной температуре 5 минут.

    7. Перейти к связыванию ДНК .

    Связывание ДНК

    Следуйте приведенной ниже процедуре, чтобы привязать ДНК к магнитным шарикам ChargeSwitch ® .

    1. Вортексируйте пробирку с магнитными шариками ChargeSwitch ® , чтобы полностью ресуспендировать и равномерно распределить шарики в буфере для хранения. Убедитесь, что весь раствор, содержащий шарики, находится на дне пробирки.

    2. Добавьте 200 мкл буфера для очистки ChargeSwitch ® (N5) к образцу переваренной ткани и осторожно дважды пипеткой вверх и вниз перемешайте.

      Примечание: Добавление ChargeSwitch ® Purification Buffer снижает pH образца и оптимизирует условия связывания.


    3. Добавьте 40 мкл магнитных шариков ChargeSwitch ® (из шага 1) к образцу и осторожно пипетируйте 5 раз, чтобы перемешать.

    4. Инкубируйте при комнатной температуре в течение 1 минуты, чтобы ДНК могла связываться с магнитными шариками ChargeSwitch ® .

    5. Поместите образец в MagnaRack ™ на 1 минуту или пока шарики не сформируют плотный осадок.

    6. Не снимая пробирку с MagnaRack ™, аккуратно удалите супернатант и выбросьте. Будьте осторожны, чтобы не повредить гранулу с шариками, наклоняя пипетку так, чтобы кончик был направлен в сторону от гранулы (см. Рисунок ниже).


    7. Немедленно перейти к Промывка ДНК

    Промывка ДНК

    1. Удалите трубку с гранулированными магнитными шариками из MagnaRack ™.В пробирке не должно быть супернатанта.

    2. Добавьте 1 мл промывочного буфера ChargeSwitch ® (W12) в пробирку и осторожно пипетируйте дважды вверх и вниз, чтобы ресуспендировать магнитные шарики.

      Важно: Для перемешивания образца используйте наконечник пипетки на 1 мл, установленный на 900 мкл. Убедитесь, что наконечник погружен в воду, и аккуратно поднимайте и опускайте пипетку, чтобы избежать образования пузырьков.

    3. Поместите образец в MagnaRack ™ на 1 минуту или пока шарики не сформируют плотный осадок.

    4. Не снимая пробирку с MagnaRack ™, аккуратно удалите супернатант и выбросьте. Следите за тем, чтобы не повредить гранулу шариков, наклоняя пипетку так, чтобы кончик был направлен в сторону от гранулы.

    5. Повторите шаги 1-4.

    6. Перейти к выделению ДНК.



    Выделение ДНК

    1. Удалите трубку с гранулированными магнитными шариками из MagnaRack ™ (шаг 5). В пробирке не должно быть супернатанта.

    2. Добавьте 150 мкл буфера для элюции ChargeSwitch ® (E5) (или буфера TE, pH 8,5) в пробирку и осторожно пипеткой вверх и вниз 10 раз повторно суспендируйте магнитные шарики.

      Важно: Не используйте воду для элюирования. ДНК не элюируется из-за плохой буферной способности воды.


    3. Инкубируйте при комнатной температуре 5 минут.

      Совет: Для получения максимального выхода перемешайте суспензию шариков (осторожно пипетируя вверх и вниз) в середине инкубации.Инкубация образца при 55 ° C также может повысить урожайность.

    4. Поместите образец в MagnaRack ™ на 1 минуту или пока шарики не сформируют плотный осадок.

    5. Не вынимая пробирку из MagnaRack ™, осторожно удалите супернатант, содержащий ДНК, в стерильную микроцентрифужную пробирку. Будьте осторожны, чтобы не повредить гранулу шариков, наклоняя пипетку так, чтобы кончик был направлен в сторону от гранулы.

      Примечание: Если элюат, содержащий ДНК, обесцвечивается, повторите шаги 5-6.


    6. Выбросьте использованные магнитные шарики. Не используйте бусинки повторно.



    Хранение ДНК

    • Храните очищенную ДНК при -20 ° C или сразу используйте для желаемого последующего применения.
    • Избегайте многократного замораживания и размораживания ДНК. Очищенную ДНК храните при 4 ° C для краткосрочного использования или аликвотируйте ДНК и храните при -20 ° C для длительного хранения.


    Количественное определение выхода ДНК

    Вы можете оценить выход очищенной геномной ДНК, проверив УФ-поглощение при 260 нм или используя один из наборов для анализа ДНК Quant-iT ™.

    УФ-поглощение

    1. Измерьте A 260 раствора с помощью спектрофотометра, заполненного 10 мМ трис-HCl, pH 8,5.

    2. Рассчитайте количество ДНК по формуле:
      ДНК (мкг) = A 260 США 50 мкг / (A 260 x 1 мл) x коэффициент разбавления x общий объем образца (мл)
      Для ДНК, A 260 = 1 для раствора 50 мкг / мл, измеренного в кювете с длиной оптического пути 1 см.



    Наборы для анализа ДНК Quant-iT ™

    Наборы для анализа ДНК Quant-iT ™ обеспечивают быстрый, чувствительный и точный метод количественного определения дцДНК с минимальным вмешательством со стороны РНК, белка, оцДНК (праймеров) или других общие загрязняющие вещества, влияющие на поглощение УФ-излучения.Каждый набор содержит современный реагент для количественного анализа, предварительно разведенные стандарты для стандартной кривой и предварительно приготовленный буфер для количественного определения ДНК на основе флуоресценции. Для получения дополнительной информации посетите сайт www.invitrogen.com или позвоните в службу технической поддержки

    .

    Введение

    Обратитесь к таблице ниже для устранения проблем, с которыми вы можете столкнуться при очистке геномной ДНК с помощью набора.

    Проблема

    Причина

    Решение

    Низкий выход ДНК

    Неполный лизис

    • Уменьшить количество используемого исходного материала.
    • Обязательно добавьте протеиназу К во время лизиса.
    • Убедитесь, что ткань полностью погружена в буфер для лизиса.
    • Увеличьте продолжительность инкубации при 55 ° C.
    • Для небольших количеств ткани гомогенизируйте ткань перед лизисом.

    Низкое качество исходного материала

    Обязательно используйте свежий образец и обработайте его сразу после сбора или заморозьте образец при -80 ° C или в жидком азоте.Выход и качество выделенной ДНК зависит от типа и возраста исходного материала.

    Недостаточное количество ChargeSwitch Добавлены магнитные шарики ®

    Перемешайте на вортексе пробирку с переключателем заряда. ® Магнитные шарики, чтобы полностью ресуспендировать шарики в растворе перед добавлением их в образец.

    Гранулы шариков повреждены или потеряны во время связывания или промывки

    • Храните образец в MagnaRack при удалении супернатанта на этапах связывания или промывки.
    • Удалите супернатант, не нарушая гранулы шариков, отклонив кончик пипетки от гранулы.

    Неправильные условия элюирования

    • После добавления буфера для элюции ChargeSwitch ® (E5) к образцу пипетируйте его вверх и вниз, чтобы ресуспендировать магнитные шарики перед инкубацией.
    • Инкубируйте образец при 55 ° C, чтобы повысить выход.
    • Не используйте воду для элюирования ДНК. Используйте буфер для элюции (E5) или TE, pH 8,5.

    Неполная диссоциация ДНК от ChargeSwitch ® Магнитные шарики

    • Произвести дополнительное перемешивание суспензии шариков (пипетированием вверх и вниз).
    • Элюировать ДНК при 65 ° С.

    ДНК не восстановлена

    Вода, используемая для элюирования

    Не используйте воду для элюирования. Буфер для элюирования должен иметь pH = 8,5-9,0 , иначе ДНК останется связанной с ChargeSwitch ® Магнитные бусины. Используйте ChargeSwitch ® Буфер для элюции (E5) или TE, pH 8.5.

    ChargeSwitch ® Магнитные шарики хранятся или используются ненадлежащим образом

    • Хранить шарики при комнатной температуре. Не замораживайте бусины, так как они непоправимо испортятся.
    • Убедитесь, что шарики постоянно находятся в растворе и не высыхают. Высохшие бусины не работают.

    Элюат, содержащий ДНК, обесцвечивается

    Магнитный осадок нарушен во время элюирования

    Повторите этап элюирования ( Элюирующая ДНК ).

    Загрязнение РНК

    Забыл добавить РНКазу А

    Выполните расщепление РНКазой А до связывания ДНК с магнитными шариками.

    ДНК разрезана или разложена

    Лизат перемешан слишком сильно или во время перемешивания использовались маленькие наконечники пипеток

    • Используйте наконечник пипетки на 1 мл, установленный на 900 мкл, для перемешивания образца.
    • Аккуратно перемешайте пипеткой вверх и вниз.

    Пузыри, образующиеся на этапах смешивания

    Убедитесь, что наконечник пипетки погружен в раствор во время перемешивания.

    ДНК многократно замораживали и оттаивали

    Аликвотируйте ДНК и храните при 4 ° C или -20 ° C. Избегайте повторного замораживания и оттаивания.

    ДНК, загрязненная ДНКазами

    Поддерживайте стерильную среду во время работы ( я.е. носить перчатки и использовать реагенты, не содержащие ДНКаз).

    LT107

    .xF_ # pS7O`y / ˛: m = 3xT

    hGDqt, 1HOaAJɶve ء ccM}? LSәƶMc {l n m; 4vllW mckzaV] ck ێ m6mǶawMcƦv; 4v ۾ rc6VNcm6} cIX / 66 څ] j9vlc8HGOȏq b | 7 дюймов | {8Xwm> ء cck c`r. =

    % PDF-1.5 % 365 0 объект > endobj xref 365 40 0000000016 00000 н. 0000002165 00000 н. 0000002322 00000 п. 0000002839 00000 н. 0000003260 00000 н. 0000003697 00000 н. 0000003734 00000 н. 0000003905 00000 н. 0000004019 00000 н. 0000004392 00000 п. 0000004875 00000 н. 0000005218 00000 н. 0000005668 00000 н. 0000006554 00000 н. 0000007362 00000 н. 0000008132 00000 н. 0000008733 00000 н. 0000009515 00000 н. 0000010108 00000 п. 0000010896 00000 п. 0000011611 00000 п. 0000014260 00000 п. 0000014335 00000 п. 0000014432 00000 п. 0000014581 00000 п. 0000016826 00000 п. 0000018760 00000 п. 0000018873 00000 п. 0000018948 00000 п. 0000019261 00000 п. 0000019316 00000 п. 0000019432 00000 п. 0000019556 00000 п. 0000019631 00000 п. 0000019944 00000 п. 0000020019 00000 п. 0000020332 00000 п. 0000028203 00000 п. 0000075467 00000 п. 0000001096 00000 н. трейлер ] / Назад 979697 >> startxref 0 %% EOF 404 0 объект > поток hb``b`yh Ā

    .

    Смотрите также