• Выделение и титрование бактериофагов


    Выделение и титрование бактериофага

     В ряде случаев, например, с научными, санитарно-гигиеническими целями или для постановки реакции нарастания титра фага необходимо выделить фаг или из объекта окружающей среды или из бактериальной культуры

    , а иногда еще и определить его количество в единице объема (этот показатель и определяется термином титр бактериофага).


    А. Выделение бактериофага проводят по следующему алгоритму.
    1. Материал, их которого выделяется бактериофаг (объект внешней среды или бактериальная культура), фильтруют через бактериальный фильтр.
    2. Фильтрат помещают в жидкую питательную среду, куда засевают чувствительную к выделяемому фагу бактериальную культуру.
    3. После термостатирования проводят учет опыта.
    а. Рост бактерии свидетельствует об отсутствии в исследуемом материале искомого бактериофага.
    б. Отсутствие роста бактерий свидетельствует, что искомый бактериофаг в исследуемом материале присутствует.
    Б. Титрование бактериофага проводят или по методу Аппельмана или по методу Грациа.
    1. Титрованием фага по Аппельману можно определить концентрацию бактериофага в единице объема с точностью до порядка. Для этого используется жидкая питательная среда.
    а. Фагосодержащий материал десятикратно разводится («титруется») в жидкой питательной среде.
    б. Каждое разведение засевается чувствительной к данному фагу бактериальной культурой.
    в. Посевы инкубируются в термостате.
    г. Последнее разведение фагосодержащего материала, в котором не будет роста – это и есть титр бактериофага.
    2. Титрованием фага по Грациа можно определить концентрацию бактериофага в единице объема с точностью до одной фаговой корпускулы.
    а. Фагосодержащий материал десятикратно разводится («титруется») в полужидкой питательной среде.
    б. К каждому разведению добавляется чувствительная культура с таким расчетом, чтобы в отсутствие бактериофага получился рост в виде газона.
    в. Каждое разведение фагосодержащего материала в полужидкой среде с добавлением чувствительной культуры заливается в чашку Петри на слой плотной питательной среды, используемой в роли под-ложки.
    г. Посевы инкубируются в термостате.
    д. Низкие разведения бактериофага полностью лизируют бактерии и роста не наблюдается. По мере разведения фага появляются отдельные изолированные бляшки, каждая из которых – результат репликации одной фаговой корпускулы. Для подсчета титра бактериофага следует количество бляшек умножить на то разведение, в котором эти бляшки подсчитаны.


    Бактериофаг — Студопедия

    Вирус, паразитирующий на бактериальных клетках, называют бактериофагом. По греч. phagein – пожирать, выражается в лизисе (растворении) бактериальных клеток. Бактериофаг имеет головку, в которой заключены ДНК или РНК и хвост с отростками.

    Известны вирулентные и умеренные фаги. Вирулентные бактериофаги могут лизировать бактерии с образованием новых фаговых частиц. ДНК умеренных фагов включаются в хромосому бактериальной клетки и передаются по наследству, придавая клетке-хозяину новые свойства. Такое взаимодействие фага с клеткой называют лизогенией, а бактерии, несущие умеренные фаги, называют - лизогенными.

    Действие фага строго специфично. Феномен действия вирулентных фагов проявляется просветлением взвеси бактерий в жидкой среде или отсутствием роста бактерий при посеве их на плотную среду газоном.

    Большинство фагов проявляет видоспецифичность в отношении бактерий, хотя имеются и вариантные фаги, для определения фаговаров внутри вида бактерий.

    Основные этапы взаимодействия фагов и бактерий. (вопрос 6)

    1.Адсорбция (взаимодействие специфических рецепторов).

    2.Внедрение вирусной ДНК (инъекция фага) осуществляется за счет лизирования веществами типа лизоцима участка клеточной стенки, сокращения чехла, вталкивания стержня хвоста через цитоплазматическую мембрану в клетку, впрыскивание ДНК в цитоплазму.


    3.Репродукция фага.

    4.Выход дочерних популяций.

    Метод титрования бактериофага:

    1. Метод Аппельмана (серийных разведений).

    Испытуемый фильтрат или известный бактериофаг разводят 10-ти кратно МПБ. Берут 10 пробирок с 4,5 мл МПБ в каждой. В первую вносят 0,5 мл исследуемого фага, содержимое перемешивают и 0,5 мл жидкости переносят из первой пробирки во вторую, перемешивают содержимое и таким же образом переносят во все следующме пробирки. Получают разведения бактериофага от 10-1 до 10-8. В каждую пробирку, включая контроль, вносят по одной капле культуры, выросшей на МПБ. Для контроля берут 2 пробирки с МПБ, в одну вносят 0,5 мл исследуемого фага (контроль на отсутствие бактерий в исследуемом фаге), в другую пробирку - одну каплю микробной культуры (контроль культуры). Все пробирки инкубируют при 370 С в течение 18 ч. Титр фага определяют по наибольшему разведению препарата, в котором обнаруживается литическая активность.

    2. Метод Грациа (агаровых слоев).


    В 5 чашек Петри заливают 1,5 % МПА с индикатором генцианвиолетом (0,1 мл 0,4 % раствора на 1 л среды). Агар в чашках подсушивают в термостате до полного удаления конденсата.

    Готовят разведения исследуемого фага на физиологическом растворе от 10-2 до 10-9.

    Готовят 5 пробирок, содержащих 0,7 % МПА в количестве 2,5 мл, расплавляют его на водяной бане и охлаждают до 45-500 С. Во все пробирки с МПА вносят 0,1 мл 1 млрд взвеси эталонной суточной культуры и в каждую из пробирок добавляют по 1 мл одного из разведений – 10-4, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8 испытуемого фага, перемешивают и добавляют во все пробирки по 2,5 мл 0,7 % МПА, охлажденного до 50О С. Содержимое пробирок перемешивают и из каждой пробирки смесь вносят вторым слоем в соответствующую чашку с МПА по принципу одна пробирка – одна чашка. Смесь равномерно распределяют по поверхности агара в чашке и оставляют на 50 мин до полного охлаждения агара. Затем чашку слегка подсушивают и инкубируют при 370 С в течение 18-20 ч.

    На фоне равномерного роста бактерий отмечают пятна, где рост бактерий отсутствует, что обусловлено лизисом микробной культуры в результате действия бактериофага. При большом количестве бактериофага наступает лизис по всей поверхности агара, при меньших разведениях бактериофага наблюдаются отдельные зоны просветлений, в последней чашке (10-8) зоны просветления отсутствуют. При определенном допуске, что каждый участок лизиса образован в результате действия одной частицы фага, то можно подсчитать в 1 мл препарата количество активных частиц фага. Допустим, что имеется 30 фаговых пятен, при разведении 10-7 степени. Следовательно, титр фага равен 3х10-8, т.е. в 1 мл фага содержится 3х108 активных корпускул фага.

    3. Титрование фага на твердых средах.

    Растирают шпателем 1-2 капли молодой агаровой культуры по всей поверхности агара, дают подсохнуть и на разные сектора чашки наносят по 1 капле разных разведений фага, который исследуют. Предварительно, со стороны дна чашки маркируют сектора с фагом. После 18-24 ч инкубирования в термостате следует определять результаты. Титром считают максимальное разведение фага, которое вызвало полный лизис бактерий на данном секторе среды. Метод можно проводить параллельно с исследованием Аппельмана.

    Метод выделения бактериофагов (вопрос 7)

    Для выделения бактериофагов из объектов внешней среды готовят фильтрат исходного материала, для чего 3-5 г фекалий размешивают в 50 мл МПБ и инкубируют полученную взвесь при 370 С в течение 18-20 ч. Далее взвесь очищают от взвешенных частиц, путем фильтрования. Освобождение фага от бактерий достигается за счет фильтрования через свечи или асбестовые пластинки. Корпускулы бактериофагов проходят через такой фильтр и обнаруживаются в фильтрате.

    Метод фаготипирования бактерий

    Испытуемую суточную бульонную культуру бактерий засевают на поверхность питательной среды в чашке Петри. Делят площадь чашки на квадраты (карандашом на дне чашки) и подписывают бактериофаг, который с помощью пастерки наносят на квадрат по одной капле. После инкубации 18-24 ч отмечают на чашке те квадраты, в которых имеется сплошной лизис бактерий.

    Фаготип культуры определяется тем типом фага, который вызвал лизис данного штамма.

    Специфичность бактериофагов определяют методами Отто и Фюрта.

    1. Метод Отто. Растопленный 3 % мясо-пептонный агар разливают в стерильные чашки Петри, охлаждают, подсушивают в термостате 10-15 мин. Газоном засевают на чашки 16-18 ч бульонную культуру разных бактерий. Наносят каплю известного фага ближе к одной из сторон чашки, затем чашку наклоняют и дают капле фага стечь до противоположного края чашки. Чашки инкубируют при 370 С в течение 18-24 ч и затем учитывают результат. Если фаг гомологичен бактериям в определенной чашке и биологически активен, то по пути стекания капли фага роста бактерий в этой чашке не будет, среда останется прозрачной.

    2. Метод Фюрта. В 15-30 мл МПБ вносят 0,5 мл фекалий и помещают в термостат при 370 С на 24 ч. На другой день МПБ фильтруют через свечу и полученный фильтрат заливают 1,5 % МПА, охлажденным до 500 С. Фильтрат тщательно смешивают с агаром и заливают в чашку Петри, когда агар остынет, подсушивают в термостате.

    Дно чашки делят на 8-10 секторов и на каждый из них засевают штрихом бульонную культуру бактерий 3 ч возраста. Чашки ставият в термостат на 37о С. Результат учитывают через 18-24 ч экспозиции при 37о С. Если в исследуемом фильтрате есть бактериофаг, то гомологичный микроорганизм на среде расти не будет или только путем отдельных колоний. На секторах, куда засеяли бактерии гетерогенные бактериофагу, будет нормальный рост микробов.

    По модификации Фишера, дно чашки делят пересекающимися линиями на тридцать квадратов. В центр каждого квадрата вносят исследуемые бульонные культуры. Результат учитывают через 18-24 ч инкубирования в термостате.

    На практике фаги применяют для: (вопрос 8)

    1. маркировки культур при эпидемиологическом расследовании, определение фаговара,

    2. диффренцировки бактериальных культур, установление видовой принадлежности,

    3. фагодиагностики - выделение фага из фекалий больного,

    4. фаготерапии - в отдельных случаях фаги применяют для лечения инфекционных заболеваний.

    Практическое использование бактериофагов.

    1.Для идентификации (определение фаготипа).

    2.Для фагопрофилактики (купирование вспышек).

    3.Для фаготерапии (лечение дисбактериозов).

    4.Для оценки санитарного состояния окружающей среды и эпидемиологического анализа.

    Петритест - микробиологические экспресс-тесты - 11.1. Выделение бактериофага из патологического материала и объектов окружающей среды

    Как отмечено выше, фагу присущи выраженные паразити­ческие свойства, обусловливающие существование и размно­жение только в культурах гомологичных микроорганизмов. На этом основании присутствие бактериофага можно рассматри­вать как косвенный показатель инфицированности исследуе­мого материала соответствующим микробом.

    В практике микробиологии бактериофаг обнаруживают в том случае, когда выделение культуры микроба не дает положительного результата, например вследствие чрезмерно малого количества этих микробов в исследуемом материале или силь­ного загрязнения его посторонней микрофлорой.

    В настоящее время разработаны различные методы качест­венного обнаружения фага в исследуемом материале (см. раз­дел 11.2), в основу которых положен засев исследуемого мате­риала совместно с гомологичным искомому фагу бактериаль­ным штаммом на плотные и жидкие питательные среды. Куль­туры микробов, чувствительные к бактериофагу, принято называть тест-культурами.

    Прямой метод выделения бактериофага из исследуемого мате­риала. Исследуемую жидкость фильтруют от микробов. Твер­дый материал (образцы почвы, пищевые продукты, испражне­ния) измельчают в ступке, эмульгируют, фильтруют через бумажный, затем через бактериальный фильтрьж Наличие фага в полученном фильтрате определяют на плотных или жидких питательных средах с использованием тест-культур.

    Выделение бактериофага методом обогащения "без подсева". Исследуемый материал засевают в жидкую питательную среду, являющуюся оптимальной для развития микроорганизмов, про­тив которых ищут бактериофаг. Посевы инкубируют в термо­стате при оптимальной температуре 18–20 ч. По истечении указанного срока посевы фильтруют через бумажный, а затем бактериальный фильтры.

    Полученные фильтраты испытывают на присутствие бакте­риофага на плотных и жидких питательных средах.

    В основу этого метода положен принцип создания наиболее благоприятных условий для размножения находящихся в ис­следуемом материале бактерий и соответствующего им иско­мого бактериофага.

    Выделение бактериофага методом обогащения "с подсевом". Жидкий исследуемый материал непосредственно, а плотный после предварительного измельчения в ступке засевают в мясопептонный бульон или в другую жидкую питательную среду. Одновременно с исследуемым материалом вносят 0,5–1 мл 3–6-часовой бульонной культуры или смыва с суточной ага­ровой культуры бактерий, гомологичных выделяемому фагу. Для контроля культуру бактерий, применяемую для обогаще­ния, засевают в стерильную питательную среду.

    Посевы ставят в термостат при 37°С на 18–24 ч. После инку­бации из опытной и контрольной пробирок берут по нескольку миллилитров жидкости и фильтруют через бактериальные фильт­ры. Полученные фильтраты исследуют на присутствие бактерио­фага, гомологичного бактериям, применяемым для обогащения.

    Сущность данного метода заключается в предварительном обогащении исследуемого материала клетками того микроор­ганизма, к которому ищут бактериофаг. Бактерии, внесенные в исследуемый материал, размножаются и вместе с ними раз­множается фаг.

    Методы получения и титрования фагов. Практическое использование фагов для профилактики, лечения, индикации и типирования бактерий.

     

    Для получения препарата бактериофага культуру бактерий заражают бактериофагом. На следующий день зараженную культуру фильтруют через бактериальный фильтр. Для количественной характеристики бактериофагов используют такой критерий, как титрбактериофага.

    Титр фага можно выразить двумя показателями:

    1. Наибольшее разведение препарата, при котором бактериофаг лизирует соответствующие бактерии (количество активных корпускул бактериофага в 1 мл препарата).

    2. Методы титрования бактериофага:

    ñ метод серийных разведении в пробирках с жидкой питательной средой по Аппельману;

    ñ двуслойный агаровый метод, при котором подсчитывают число негативных колоний фага на фоне сплошного роста бактерий – метод Грациа.

     

    Практическое применение.

    1. Фаготип (фаговар) – позволяет определить видовую принадлежность исследуемой культуры.

    2. Фаготипирование исследуемых культур с целью эпидемиолоического анализа инфекционных заболеваний.

    3. Применение фагов с лечебными и профилактическими целями проводят редко. Есть препараты дизентерийного, сальмонеллезных, коли-протейного, стафилококкого и других бактериофагов, а также наборы для фаготипирования. В настоящее время препараты бактериофагов применяют для лечения дизентерии, сальмонеллеза, гнойной инфекции, а сальмонеллезные фаги применяются для профилактики одноименного заболевания в детских коллективах.


    11. Питательные среды и их классификация. Требования, предъявляемые к питательным средам. Изучение биохимических свойств бактерий в зависимости от их метаболитной активности.

     

    Питательная среда – среда, содержащая различные соединения сложного или простого состава, которая применяется для размножения бактерий и др.микроорганизмов в лабораторных или промышленных условиях. Состоит из 3 главных компонентов: мясопептонный агар (МПА), субстрат, индикатор.

     

    Классификация по происхождению:

    1. Естественные,

    2. Искусственные (на основе естественных продуктов),

    3. Синтетические (на основе химических веществ).

     

    Классификация:

    1. Простые,

    2. Сложные.

     

    Классификация по плотности:

    1. Жидкие (физ-био-хим состава),

    2. Плотные (твердые) (1,5-2),

    3. Полужидкие (0,3-0,7),

    4. Сыпучие.

     

    Классификация по назначению:

    1. Основные (основа для приготовления более сложных). Пит.бульон и пит.агар.

    2. Дифференциально-диагностические (для разграничения отдельных видов/групп микроорганизмов. Принцип построения основан на том, что разные виды бактерии по б/х активности и имеют неодинаковый набор Е, расщепляющих субстраты пит.среды.. Есть основная пит.среда, обеспечивающая раззмножение бактерий, опред.хим.субстрат и цветной индикатор (например, инд.Андрерре).


    3. Элективные самого разнообразного состава (для избирательного выделения и накопления опред.вида из материалов, содержащих разнообразную микрофлору). Для их создания исходят из био.особенностей, которые отличают данные микробы от большинства других. Например, stph — при увеличенной [NaCl], холерный вибрион — в щелочной среде.

    4. Консервирующие – для доставки материала в лабораторию.

     

    Требования:

    1. Стерильность,

    2. Н2О,

    3. Должна быть источники углерода, азота, серы, фосфат-группы и другие минеральные вещества и микроэлементы,

    4. Оптимальная рН,

    5. Прозрачность (если прозрачна, то роста нет),

    6. Буфферность,

    7. Свет,

    8. Температура,

    9. Среды – унифицированы (для каждой культуры),

    10. Доступность кислорода,

    11. Осмотическое давление – изотоничность

    12. Определленный окислит-восстановит.потенциал

    13. Ростковые факторы, играют роль катализаторов метаболич.процессов (вит.круппы В, никотиновая кислота, а/к, липиды, пурин-пиримидин.основания

    14. Вит. + учитывание, оксотрофы, хемоорганотрофы, литотрофы.

     

    Изучают:

    ñ Морфологию бактериальных клеток в окрашенных мазках,

    ñ Биохимические признаки культуры по ее способности ферментировать углеводы (глюкоза, лактоза, сахароза, мальтоза, маннит и др.), образовывать индол, аммиак и сероводород, являющиеся продуктами протеолитической активности бактерий.

     

    Типы питания бактерий. Механизм питания микробов. Культивирование бактерий в зависимости от типа питания.

     

    Типы питания бактерий:

    1. Ауксотрофы – используют для построения своих клеток неорганический углерод – СО2,

    2. Гетеротрофы – используют органический углерод.

    3. Фототрофы – используют свет,

    4. Хемотрофы – энергия за счет ВР,

    5. Литотрофы – способны использовать неорганические доноры электронов,

    6. Органотрофы – способны использовать органические доноры электронов,

    7. Сапрофиты – питаются мертвыми организмами,

    8. Паразиты – гетерозависимые в получении питательных веществ от макроорганизма (облигатные – полностью лишены возможности жить вне клеток макроорганизма; факультативные – могут жить вне хозяина и размножаться, как сапрофиты).

    9. Гетерохемоорганотрофы – это бактерии, изучаемые медицинской микробиологией.

     

    Механизм питания:

    1. Пассивная диффузия (без затрат энергии, по градиенту концентрации: О2, Н2О, СО2, N2),

    2. Облегченная диффузия (без затрат энергии, с помощью белков-переносчиков),

    3. Активный транспорт (с затратой энергии, против градиента концентрации:

    ñ с помощью пермеаз – определенное соединение,

    ñ белки-переносчикии фосфорилирование переносимой молекулы, например - глюкоза).

     

    Для культивирования.

    Для роста и жизнедеятельности микроорганизмов обязательно наличие в среде обитания питательных материалов для построения компонентов клетки и источники энергии. Для микробов необходимы вода, источники углерода, кислорода, азота, водорода, фосфора, калия, натрия и других элементов. Требуются также микроэлементы: железо, марганец, цинк, медь для синтеза ферментов. Различные виды микробов нуждаются в тех или иных факторах роста, таких, как витамины, аминокислоты, пуриновые и пиримидиновые основания.

    Количественные методы или методы титрования бактериофагов

    ⇐ ПредыдущаяСтр 7 из 16Следующая ⇒

    Титрование бактериофагов проводится с использованием культур чувствительных бактерий в жидких и плотных питательных средах.

     

    Метод титрования бактериофага по Аппельману
    (на жидкой питательной среде)

    Готовят десятикратные разведения исследуемого бактериофага в питательном бульоне. Для этого в ряд пробирок разливают по 4,5 мл бульона. В 1-ю пробирку добавляют 0,5 мл исследуемого фага. Тщательно перемешивают и переносят в последующие пробирки (из пробирки в пробирку) по 0,5 мл соответствующего разведения фага с уменьшением его концентрации в десять раз. Получают разведения от 10-1 до 10-9 степени. Затем в пробирки вносят по 1 капле суточной культуры соответствующих бактерий. После инкубации в течение суток определяют титр фага. За титр бактериофага принимают то его максимальное разведение, при котором наблюдается полный лизис культуры (просветление среды).

    Метод титрования бактериофага по Грациа
    (на плотной питательной среде)

    Питательный агар разливают в чашки Петри и подсушивают в термостате. Готовят полужидкий питательный агар по 3–4 мл в пробирке и растапливают его на водяной бане. Делают десятикратные разведения исследуемого бактериофага в изотоническом растворе хлорида натрия. Затем 0,5 мл каждого разведения бактериофага смешивают с таким же объёмом суточной бульонной культуры чувствительных к бактериофагу бактерий и выливают эту смесь в пробирку с полужидким агаром температурой 45°C. Приготовленную смесь быстро выливают на поверхность первого слоя агара в чашке Петри, где она застывает в виде тонкого слоя. После застывания второго слоя агара чашки инкубируют при 37°C в течение суток. Смеси бактериофага, культуры и полужидкого агара делают из разведений фага 102–1010, в зависимости от предполагаемого титра фага.

    Не заражённые бактериофагом бактерии, размножаясь, образуют сплошной газон роста на поверхности питательного агара. Каждая инфицированная бактериофагом бактерия лизируется и освобождает потомство бактериофага, которое внедряется в интактные клетки бактерий, и весь цикл повторяется. В результате лизиса клеток на сплошном бактериальном газоне появляются «стерильные» пятна или негативные колонии бактериофага. Число этих пятен соответствует количеству фаговых частиц в засеянной смеси. Количество пятнообразующих единиц в 1 мл исходной суспензии бактериофага называется его титром.

    Фаготипирование бактерий

    Метод фаготипирования имеет большое значение при эпидемиологических исследованиях, так как позволяет выявить источник и пути распространения возбудителей заболеваний. Определение фаговара выделенной чистой культуры проводят с помощью набора типовых диагностических бактериофагов. Фаговар культуры определяют по тому типовому фагу, который вызвал её лизис.

    Для проведения фаготипирования исследуемую суточную культуру бактерий засевают «газоном» на поверхность питательного агара в чашки Петри, подсушивают в термостате, делят со стороны дна чашки на квадраты и наносят пипеткой по одной капле соответствующего бактериофага в тест-разведении, указанном на ампуле. В один квадрат бактериофаг не вносят, для контроля роста культуры. Чашку термостатируют при 37оС 18-20 часов, после чего оценивают результат реакции. Положительный результат реакции фаголизиса – лизис культуры в месте нанесения бактериофага («негативные» колонии) при наличии роста в контроле свидетельствует о соответствии культуры бактериофагу и принадлежности с учетом её фаголизабельности к соответствующему виду.

    Применение бактериофагов

    Применяемые на практике препараты бактериофагов представляют собой фильтрат бульонной культуры соответствующих микробов, лизированных фагом, содержащий живые частицы фага, а также антигены бактерий, освободившиеся из бактериальных клеток при их лизисе. Полученный препарат – жидкий бактериофаг – должен иметь вид совершенно прозрачной жидкости желтого цвета большей или меньшей интенсивности. Препарат проходит контроль на стерильность (методом посева), безвредность и литическую активность (титр).

    Диагностические бактериофаги выпускаются как в жидкой, так и в сухой форме, в ампулах. Перед началом работы сухой бактериофаг разводится.

    Для лечебно-профилактических целей бактериофаги выпускаются в форме таблеток с кислотоустойчивой оболочкой, в жидком виде или в суппозиториях. Таблетированный сухой бактериофаг более стабилен при хранении и удобен при применении. Одна таблетка сухого бактериофага соответствует 20-25 мл жидкого препарата. Срок годности сухого и жидкого препарата составляет 1 год. Жидкий бактериофаг следует хранить при температуре +2 – +100С, сухой – не выше +10С, но его можно хранить в холодильнике и при отрицательной температуре.

    Принятый внутрь бактериофаг сохраняется в организме в течение 5-7 дней. Как правило, приём бактериофага не сопровождается какими-либо реакциями или осложнениями. Противопоказаний к приему нет.

    Бактериофаги могут применять также в виде орошений, полосканий, примочек, тампонов. Инъекционные формы бактериофагов можно вводить в стерильные полости – брюшную, плевральную, суставную и в мочевой пузырь. Существует форма выпуска бактериофагов в свечах для ректального применения.

    Контрольные вопросы

    Дайте определение понятия «химиотерапевтический препарат». Назовите фамилию учёного, разработавшего теорию химиотерапии. Какие свойства являются определяющими при выборе химиотерапевтического препарата? Что такое бактерицидное и бактериостатическое действие препарата? Что такое химиотерапевтический индекс, напишите его формулу, для чего применяется этот показатель? Укажите первые антиспирохетные препараты, синтезированные Эрлихом. Назовите группы химиотерапевтических препаратов, приведите примеры. Назовите фамилию учёного, впервые получившего антибактериальный препарат, и название препарата. Дайте определение понятию «антибиотик». Назовите фамилии русских учёных, впервые обнаруживших антибактериальные свойства зелёной плесени. Назовите фамилию учёного, изучавшего свойства зелёной плесени и сделавшего попытку выделить пенициллин. Назовите фамилии учёных – зарубежных и отечественных, получивших первый антибиотик из зелёной плесени. Назовите фамилию учёного, впервые получившего стрептомицин. Классификация антибиотиков по происхождению (источнику получения), по химическому составу. Механизм действия антибиотиков: «мишени» (точки приложения различных групп антибиотиков). Что означает понятие «спектр действия» антибиотиков? Назовите антибиотики активные преимущественно по отношению к грамотрицательным бактериям, преимущественно по отношению к грамположительным бактериям, антибиотики широкого спектра действия, противовирусные, противогрибковые, противоопухолевые антибиотики. Методы определения активности антибиотиков; в каких единицах измеряется антибактериальная активность антибиотиков? Основные проявления побочного действия антибиотиков. Виды лекарственной устойчивости микробов по происхождению. Генетические механизмы лекарственной устойчивости. Фенотипические (биохимические, структурные) механизмы лекарственной устойчивости. Методы определения чувствительности бактерий к антибиотикам, техника исследования и оценка результатов. Какие существуют способы предупреждения и преодоления лекарственной устойчивости микробов? Назовите препараты, предназначенные для преодоления лекарственной устойчивости и применяемые в сочетании с антибиотиками.

    ЗАДАЧА 1. Укажите культуру, наиболее чувствительную к пенициллину, если диаметр зоны задержки роста вокруг диска равняется: кишечная палочка – 0 мм; стафилококк – 15 мм; стрептококк – 30 мм; палочка дифтерии – 13 мм.

    ЗАДАЧА 2. Выберите наиболее эффективный антибиотик для лечения больного, если при определении лекарственной устойчивости возбудителя методом стандартных дисков установлены диаметры зон задержки роста: пенициллин – 0 мм; стрептомицин – 13 мм; тетрациклин – 28 мм; эритромицин –15 мм.

    ЗАДАЧА 3. Применение пенициллина для лечения стафилококкового заболевания у больного оказалось неэффективным. Какую можно предположить причину неэффективности пенициллина? Как можно проверить это предположение? Какие методы можно применить для этого?

    ЗАДАЧА 4. У больного Н. с диагнозом бактериальная дизентерия до начала лечения выделен возбудитель дизентерии, чувствительный ко всем антибиотикам. Больной лечился левомицетином, с другими больными дизентерией не контактировал. На третий день после начала лечения снова выделен возбудитель дизентерии, который оказался устойчивым одновременно к трём антибиотикам: левомицетину, тетрациклину и стрептомицину. Как могла возникнуть множественная лекарственная устойчивость у возбудителя дизентерии в данной ситуации? Как доказать предполагаемый вами механизм возникновения множественной лекарственной устойчивости.

    Свойства бактериофагов. Природа – к какому царству живых существ относится? Строение - какую форму чаще всего имеет? Какие химические компоненты содержит? Структурные элементы бактериофага. Размеры – в каких единицах измеряется величина бактериофагов? Назовите фамилии учёных, открывших явление бактериофагии. Опишите фазы взаимодействия вирулентного (инфекционного) бактериофага с чувствительной к нему бактериальной клеткой. Как обнаружить действие бактериофага на бактерии в жидкой и плотной питательной среде? Как будет выглядеть положительный результат? Что такое титр бактериофага? Как определяют и обозначают титр бактериофага? Что такое умеренный бактериофаг, профаг, лизогенная культура, лизогенная конверсия, трансдукция? Опишите взаимодействие умеренного бактериофага с бактериальной клеткой. Применение бактериофагов в практической медицине – на каком свойстве оно основано? Назовите бактериофаги, применяющиеся для лечения, для диагностики, для фаготипирования.

    Задания для выполнения в процессе самоподготовки.

    Заполните в тетради таблицы «Принципы классификации антибиотиков», «Механизмы развития приобретённой лекарственной устойчивости к антибиотикам». Перечислите принципы рациональной антибиотикотерапии и осложнения и побочные эффекты антибиотикотерапии.



    Читайте также:

     

    Количественные методы или методы титрования бактериофагов

    Титрование бактериофагов проводится с использованием культур чувствительных бактерий в жидких и плотных питательных средах.

    Метод титрования бактериофага по Аппельману (на жидкой питательной среде)

    Готовят десятикратные разведения исследуемого бактериофага в питательном бульоне. Для этого в ряд пробирок разливают по 4,5 мл бульона. В 1-ю пробирку добавляют 0,5 мл исследуемого фага. Тщательно перемешивают и переносят в последующие пробирки (из пробирки в пробирку) по 0,5 мл соответствующего разведения фага с уменьшением его концентрации в десять раз. Получают разведения от 10-1 до 10-9 степени. Затем в пробирки вносят по 1 капле суточной культуры соответствующих бактерий. После инкубации в течение суток определяют титр фага. За титр бактериофага принимают то его максимальное разведение, при котором наблюдается полный лизис культуры (просветление среды).

    Метод титрования бактериофага по Грациа (на плотной питательной среде)

    Питательный агар разливают в чашки Петри и подсушивают в термостате. Готовят полужидкий питательный агар по 3–4 мл в пробирке и растапливают его на водяной бане. Делают десятикратные разведения исследуемого бактериофага в изотоническом растворе хлорида натрия. Затем 0,5 мл каждого разведения бактериофага смешивают с таким же объёмом суточной бульонной культуры чувствительных к бактериофагу бактерий и выливают эту смесь в пробирку с полужидким агаром температурой 45°. Приготовленную смесь быстро выливают на поверхность первого слоя агара в чашке Петри, где она застывает в виде тонкого слоя. После застывания второго слоя агара чашки инкубируют при 37° в течение суток. Смеси бактериофага, культуры и полужидкого агара делают из разведений фага 102–1010, в зависимости от предполагаемого титра фага.

    Не заражённые бактериофагом бактерии, размножаясь, образуют сплошной газон роста на поверхности питательного агара. Каждая инфицированная бактериофагом бактерия лизируется и освобождает потомство бактериофага, которое внедряется в интактные клетки бактерий, и весь цикл повторяется. В результате лизиса клеток на сплошном бактериальном газоне появляются «стерильные» пятна или негативные колонии бактериофага. Число этих пятен соответствует количеству фаговых частиц в засеянной смеси. Количество пятнообразующих единиц в 1 мл исходной суспензии бактериофага называется его титром.

    Фаготипирование бактерий

    Метод фаготипирования имеет большое значение при эпидемиологических исследованиях, так как позволяет выявить источник и пути распространения возбудителей заболеваний. Определение фаговара выделенной чистой культуры проводят с помощью набора типовых диагностических бактериофагов. Фаговар культуры определяют по тому типовому фагу, который вызвал её лизис.

    Для проведения фаготипирования исследуемую суточную культуру бактерий засевают «газоном» на поверхность питательного агара в чашки Петри, подсушивают в термостате, делят со стороны дна чашки на квадраты и наносят пипеткой по одной капле соответствующего бактериофага в тест-разведении, указанном на ампуле. В один квадрат бактериофаг не вносят, для контроля роста культуры. Чашку термостатируют при 37о 18-20 часов, после чего оценивают результат реакции. Положительный результат реакции фаголизиса – лизис культуры в месте нанесения бактериофага («негативные» колонии) при наличии роста в контроле свидетельствует о соответствии культуры бактериофагу и принадлежности с учётом её фаголизабельности к соответствующему виду.

    Выделение и очистка бактериофагов

    Как выделить бактериофаг (фаг) и получить чистый препарат фага? Это достигается за счет посева суспензии фага с использованием метода двойного агара и восприимчивого штамма-хозяина для получения бляшек и дальнейшей очистки фага, содержащегося в бляшке.

    Метод двойного агара был описан ранее, но он будет резюмирован снова. В этом методе небольшой объем разбавленной суспензии фага и клетки-хозяева смешивают в расплавленном «мягком» агаре.Полученную суспензию затем выливают в подходящую «питательную» базальную агаровую среду, чтобы сформировать тонкий «верхний слой», который затвердевает и обездвиживает бактерии.

    Во время инкубации неинфицированные бактерии размножаются, образуя сплошную лужайку роста бактерий на поверхности чашки. Каждая инфицированная бактерия через короткое время лопается и высвобождает фаги-потомки, которые заражают соседние бактерии, которые, в свою очередь, лизируются. Эта «цепная» реакция распространяется круговыми движениями, пока не останавливается из-за снижения метаболизма бактерий.Бляшки - это зоны бактериального лизиса, вызванные действием фагов, и выглядят как кольцевые зоны лизиса на лужайках бактериальных клеток.

    При выделении фага в образцах окружающей среды важно понимать, что популяция фага может состоять из нескольких штаммов фага с одной общей характеристикой; все они размножаются на хозяине, использованном в анализе налета! Следовательно, существует потребность в получении чистых штаммов, поскольку бляшка может содержать более одного типа фагов.

    На молочных заводах фаги можно выделить из сырого молока, пастеризованного молока, сырной сыворотки, воздуха, заквасок, растворов CIP и ряда образцов окружающей среды, включая почву, силос и сточные воды.

    Фаги очищаются путем удаления хорошо изолированного налета с помощью пипетки Пастера или, что более грубо, но столь же эффективно, проволочной петли. С помощью стерильной пипетки Пастера протыкают область вокруг налета и кусочки мягкого участка «всасываются» в пипетку. Если используется петля (рис. 1), область вокруг бляшки аккуратно разрезается петлей (иссечена) и удаляется кусок «мягкого агара», содержащий фаг. Независимо от метода материал зубного налета добавляют к 9 мл 25% раствора Рингера или другого разбавителя - рисунок 2.


    Агар следует аккуратно разбить на более мелкие кусочки проволочной петлей, кратковременно перемешать вихревой мешалкой и оставить на 5-10 минут при температуре окружающей среды.


    Затем суспензию фага стерилизуют фильтрованием через установленный на шприце фильтрующий блок 0,45 мкм (рис. 3) для удаления любых бактерий, включая устойчивые к фагам бактерии-хозяева. Обратите внимание, если фаг объединяется, какой-то фаг может задерживаться фильтром. В случае коли-фагов обработка хлороформом обычно используется для уничтожения любых присутствующих бактерий, а этап стерилизации фильтрацией иногда пропускается.Хлороформ может инактивировать некоторые фаги, поэтому его следует использовать с осторожностью и надлежащим контролем. Азид натрия также может использоваться для некоторых фагов.

    Второй цикл очистки необходим для получения одной популяции фагового штамма. Так как суспензия должна содержать примерно от 10 2 до 10 5 БОЕ / мл, разведения от 10 -1 до 10 -4 должны давать планшеты с адекватным числом бляшек для дальнейшей работы.

    Описанная выше процедура должна работать с большинством фагов и давать надежные результаты.Может потребоваться оптимизация для определенных фагов, например. большие изометрические фаги могут быть хрупкими, и следует учитывать возможность того, что фаговые агрегаты приводят к препаратам с явно низким титром.

    Для получения информации о том, как производить и хранить лизаты фагов с высоким содержанием шин, щелкните здесь.


    Как цитировать эту статью

    W.M.A. Муллан (2001). [В сети]. Доступно по адресу: https://www.dairyscience.info/index.php / изоляция-и-очистка-бактериофагов.html. Дата обращения: 10 ноября 2020 г. Обновлено июнь 2010 г., декабрь 2012 г., январь 2015 г.

    .

    Выделение и характеристика бактериофагов, заражающих нокардиоформы в очистных сооружениях

    Установки активного ила (ASP) связаны со стабильной проблемой пенообразования во всем мире. Помимо физических и химических методов очистки, метод биологической очистки изучен меньше всего и может оказаться новым и экологически безопасным подходом к решению проблемы образования стабильной пены. В ASP обычно встречаются виды Nocardia , которые являются одной из основных причин образования липкой и устойчивой пены.В этом исследовании описывается выделение и характеристика трех бактериофагов Nocardia NOC1, NOC2 и NOC3 для контроля видов Nocardia . Бактериофаги, выделенные в этом исследовании, показали многообещающие результаты в борьбе с пенообразованием, вызывающим рост бактерий в лабораторных условиях, что позволяет предположить, что они могут оказаться полезными в полевых условиях в качестве альтернативного агента биологического контроля для уменьшения проблемы пенообразования. Насколько нам известно, на сегодняшний день в Индии не было опубликовано никаких работ, касающихся биологического подхода к контролю пенообразования.

    1. Введение

    Процесс активированного ила (ASP) - это наиболее часто используемый процесс для снижения токсичности сточных вод путем их микробиологической обработки. В системе с активным илом каждый тип сточных вод обрабатывается с использованием микробных сообществ для разложения органических веществ, присутствующих в воде [1]. Микробы используют органические вещества в качестве источника энергии и разлагают их до менее токсичной формы, но большая часть системы страдает от чрезмерного роста нежелательных миколиновых кислот, содержащих нитчатые бактерии или миколаты [2], которые приводят к образованию коричневых и липких пена [3].Mycolata like Sphaerotilus spp ., Leptothrix spp ., Microthrix parvicella, Corynebacterium spp ., Dietzia spp ., Nostocoida limicola, Gordonia 000 spp40003, Mycolata spp. . , Nocardia spp ., Rhodococcus spp ., Tsukamurella spp., Тип 021N и Тип 0041 играют роль в пенообразовании. Однако среди всех миколат за пенообразование в основном ответственны виды Eikelboom [4–7].

    Пена покрывает большую площадь в аэротенке, что мешает процессу обработки и в конечном итоге приводит к серьезным экологическим, эксплуатационным, косметическим проблемам и проблемам со здоровьем [3, 8, 9]. Внешняя поверхность пенообразующих бактерий имеет гидрофобные свойства, аналогичные свойствам жиров, масел и смазки, что позволяет основной массе бактерий плавать на поверхности жидкости в аэротенке. Сточные воды, содержащие медленно разлагаемые органические вещества, такие как липиды, белки и жиры, могут способствовать росту нитчатых микроорганизмов, таких как M . parvicella и G. amarae , что приводит к усилению пенообразования [3, 6, 10]. Наличие неблагоприятных условий в системе активного ила, таких как токсичные условия (pH ниже 6,5 или выше 9,0), недостаток растворенного кислорода (DO), дефицит питательных веществ или сезонные температуры могут способствовать вспениванию. Сообщалось, что образование накипи и стабильной пены в аэротенках (AT), вторичном осветлителе (SC) и активном иле (AS) является глобальной проблемой [9, 11, 12].

    Различные исследования показывают, что доступен ряд физических, химических и биологических [11, 13–15] методов для контроля пенообразования в процессе активного ила [12], но они требуют более высоких затрат на обслуживание. Современные подходы к контролю пены включают уменьшение среднего времени удерживания ячеек [16], использование классифицирующих селекторов и неспецифических мер, таких как разбрызгивание воды, нанесение пара [17], добавление полимера [18] и хлорирование [19]. Дозирование катионного полимера [18] и регулирование уровней растворенного кислорода в реакторе предварительного окисления были описаны как полезные методы для снижения пенообразования [20].

    Имеется лишь ограниченное количество сообщений о методах биологического контроля пены, особенно о применении бактериофагов в системах AS [11, 14, 15, 21–23]. Терапия бактериофагами для лечения инфекционных заболеваний показала себя многообещающей [24]; на аналогичных линиях литические бактериофаги могут быть использованы в качестве биоконтроля для нитчатых бактерий, что может привести к снижению пенообразования на установке для обработки AS [11, 25]. Были предприняты усилия Thomas et al. [23] и Петровский и др.[13–15] для выделения бактериофагов против нитчатых бактерий, ответственных за стабильное пенообразование в ASP. Успешное применение фага для эффективного бактериального контроля зависит от плотности популяции, которая должна быть достаточной для поддержки репликации фага [26].

    Подход, основанный на бактериофаге, может иметь потенциал в качестве экологически безопасного варианта решения всемирной проблемы вспенивания ASP. Тем не менее, подход к контролю пены на основе фагов имеет определенные ограничения: (1) для успешного применения должна применяться высокая концентрация фагов; (2) из-за поливалентных фагов более широкий круг хозяев может привести к деградации полезных бактерий; (3) конкретный фаг должен быть идентифицирован оператором, чтобы конкретно противодействовать пенообразующим бактериям, не затрагивая другие бактерии; (4) микробиологический анализ системы является предварительным условием применения фагов, так как бактериальная популяция может варьироваться в зависимости от станции очистки сточных вод (КОС) [11].

    Настоящее исследование было выполнено с целью разработки подхода к биоконтролю для управления пенообразованием в системах AS в городе Нагпур, Индия. В этом исследовании мы сообщаем о характеристике трех фагов Nocardia NOC1, NOC2 и NOC3, выделенных из очистных сооружений (ETP) и молочного ETP Nagpur, Индия. Насколько нам известно, на сегодняшний день в Индии не было опубликовано никаких работ, связанных с биологическим подходом к контролю пенообразования на очистных сооружениях.

    2.Материалы и методы
    2.1. Участки отбора проб

    Отбор проб производился на очистных сооружениях (ETP) и на молочных заводах в районе Нагпура, Индия, с учетом пенообразования очистных сооружений. Как нитчатые бактерии, например, Nocardia, хорошо растут на медленно разлагаемых органических веществах, таких как липиды, масла и жиры, жирные вещества [3, 5, 10] и обнаруживаются почти на всех очистных сооружениях. Итак, в ожидании получения фагов против Nocardia spp. образцы были собраны с вышеупомянутых сайтов.Образцы собирали из разных точек, а именно из AT, SC и AS, в стерильные пластиковые флаконы объемом 200 мл и обрабатывали в течение двух дней после отбора.

    2.2. Бактериальные штаммы и условия роста

    Бактериальные штаммы, использованные в этом исследовании, представляют собой американскую коллекцию типовых культур, которая приведена в таблице 1. Все бактериальные штаммы ATCC Nocardia были выращены на пептонно-дрожжевом кальциевом агаре (PYCa) [13], R2A агар [27] и триптонный дрожжевой глюкозный агар (TYGA) [28]. Для сравнения наилучшего роста видов Nocardia использовали три питательные среды.Агар PYCa оказался лучшей средой для поддержки роста видов Nocardia на основании анализа на чашках. С этого момента среда PYCa была предпочтительнее для поддержания культур Nocardia при 4 ° C, и ее обычно поддерживали путем пересева каждые две недели. После инкубации все бактерии были обогащены бульоном PYCa и хранили при 4 ° C в соответствии с методом, описанным Petrovski et al. [13].


    Бактериальные штаммы Депонирован как Номер АТСС

    Nocardia rhodochrous Nocardia rhodochrous Nocardia rhodochrous Nocardia rhodochrous

    03

    03

    030003 Nocardia rhodochrous 0003

    03

    03

    03

    030003000300030003000300030003000300030003000300030003 pinensis ( Skermania piniformis )

    Nocardia pinensis Blackall et al. 49497
    Gordonia amarae Nocardia amarae Lechevalier и Lechevalier 27808

    2.3. Выделение и очистка нокардиофагов

    Нокардиофаги были выделены из пробы сточных вод, собранных в районе Нагпура, Индия. Вкратце, образец сточной воды объемом 20 мл из каждой точки отбора проб подвергали центрифугированию при 3000 g в течение 20 минут.После центрифугирования супернатант фильтровали через мембранные фильтры из ацетата целлюлозы (0,22 мкм мкм) для удаления бактериальных клеток. Для обогащения бактериофагов 1 мл каждого отфильтрованного образца инокулировали 50 мл бульона PYCa смешанной бактериальной культуры и инкубировали при 30 ° C [13]. После обогащения бактериальные клетки сначала центрифугировали при 5000 g в течение 10 мин, супернатант фильтровали через 0,22 мкм фильтровальную бумагу из ацетата целлюлозы мкм. Для метода анализа бляшек 1 мл отфильтрованного образца смешивали с 1 мл культуры хозяина каждого вида и выливали на автоклавированные чашки Петри после смешивания расплавленного агара PYCa [29, 30].Затем планшеты инкубировали при 30 ° C в течение 2 дней по методу Petrovski et al. [13].

    2.4. Выделение ДНК нокардиофага

    ДНК всех фагов NOC1, NOC2 и NOC3 выделяли с использованием метода SDS-протеиназы K, как описано Petrovski et al. [13].

    2,5. Определение диапазона хозяев фага

    Все три вида Nocardia были подвергнуты определению диапазона хозяев путем заражения против нокардиофагов в соответствии с методом, описанным Petrovski et al.[13]. Извлечение фагов и очистка были достигнуты с их соответствующими хозяевами, а именно с N. rhodochrous, N. amarae, и N. pinensis, , как описано Petrovski et al. [13]. Характеристика фага была достигнута путем секвенирования нуклеотидов и анализа.

    2.6. Анализ нуклеотидной последовательности фага

    ДНК нокардиофага секвенировали геном с использованием секвенатора генома Roche GS FLX и химии титана от Genoseq (CA). Считывания пиросеквенирования собирали с использованием gsAssembler (Roche Applied Science, Индианаполис, Индиана).Все полученные одиночные контиги, полученные для каждого фага, имели как минимум 50-кратное покрытие считывания. После получения последовательностей генома нуклеотидные последовательности были подвергнуты анализу, подобному NCBI-BLAST и предсказанию открытой рамки считывания (ORF), с использованием инструмента NCBI ORF Finder, доступного по адресу http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf. html. Содержание G + C (%) для последовательностей оценивали с помощью программного обеспечения генетического анализа BitGene, доступного по адресу http://bitgene.com/gene-analysis.shtml.

    2.7. Номер доступа нуклеотидной последовательности

    Частичные последовательности генома для бактериофагов Nocardia NOC1, NOC2 и NOC3 депонированы в GenBank под номерами доступа KF879861, KF879862 и KF879863 соответственно.

    3. Результаты и обсуждение
    3.1. Выделение и очистка нокардиофагов

    Метод Петровского использовался для выделения и очистки бактериофагов. Одиночные бляшки наблюдались после 2 дней инкубации при 30 ° C. Количественные результаты анализа налета суммированы в таблице 2, указывающей на рост фага. Представлен репрезентативный культуральный планшет для анализа бляшек, в котором бляшки были собраны и подвергнуты дальнейшему выделению и очистке от бактериофагов (Фиг.1).На основании роста бактериофагов на N. rhodochrous , N . Фаги amarae и N. pinensis (реклассифицированы как Skermania piniformis ) получили названия NOC1, NOC2 и NOC3 соответственно. Кроме того, бляшки очищали четырьмя раундами разбавления и повторной изоляции, чтобы гарантировать, что каждая бляшка возникла из-за одного типа бактериофага. Чашки, демонстрирующие отличный визуальный рост, были взяты для очистки бактериофагов.


    Участки отбора проб Различные точки отбора проб Nocardia rhodochrous Nocardia amarae Nocardia pinensis ( Pinensis ) Sker.
    ETP AT - -
    AS -
    SC - -

    Молочная промышленность промышленность AT - -
    AS - -
    SC - -

    AT: аэротенк, AS: активный ил, SC: s вторичный осветлитель, - визуального нароста нет; + появление визуального роста; отличный визуальный рост.
    NOC1.
    б NOC2.
    c NOC3.

    3.2. Определение диапазона хозяев фага

    Диапазон хозяев фага определяли путем заражения каждого из трех видов Nocardia против отдельного фага на среде PYCa. Определение диапазона хозяев бактериофагов против нокардиоформ суммировано в таблице 3. Вкратце, NOC2 (выделенный из ETP, Нагпур) был способен расти на двух видах Nocardia, , а именно на N.amarae и N. pinensis ; особенно мало бляшек NOC2 было обнаружено против N. pinensis . NOC1 и NOC3 могли размножаться только на своем хозяине, то есть N. rhodochrous и N. pinensis (Skermania piniformis) соответственно. NOC2 имел относительно более широкий диапазон хостов по сравнению с NOC1 и NOC3. Хотя NOC3 смог показать небольшой рост на N. rhodochrous , но четких литических бляшек не наблюдалось, фаг NOC3 действительно вызывал мутный лизис на N.rhodochrous , поэтому он не считался хостом NOC3.

    Nocardia Nocardia rhodo визуально рост; хороший визуальный рост; отличный визуальный рост.
    +/− Незначительный рост.

    Виды бактерий Бактериофаг
    NOC1 NOC2 NOC3

    Nocardia amarae - -
    Nocardia pinensis ( Skermania piniformis ) -

    3.3. Анализ последовательности ДНК фага

    Нуклеотидное секвенирование бактериофагов Nocardia NOC1, NOC2 и NOC3 привело к получению частичной последовательности из 34189 п.н., 28456 п.н. и 28465 п.н. соответственно. Нуклеотидные последовательности бактериофагов Nocardia NOC1, NOC2, NOC3 были представлены в GenBank под номером доступа [GenBank: KF879861], [GenBank: KF879862] и [GenBank: KF879863] соответственно.Результаты анализа нуклеотидной последовательности, выполненного с использованием различных биоинформатических инструментов, таких как NCBI-BLAST, NCBI's ORF Finder и программа генетического анализа BitGene, сведены в Таблицу 4. В таблице суммировано содержание G + C в мол.%, Количество ORF более 100 п.н. процентная идентичность бактериофагов NOC1, NOC2 и NOC3 с другими материалами Genbank.

    904

    Изолированные последовательности частичного генома бактериофага (инвентарный номер GenBank) Длина последовательности (п.н.) Общее содержание G + C (моль%) Количество ORF более 100 п.н. Идентичность с последовательностями генома других бактериофагов (регистрационный номер GenBank) Охват запросов (%) Идентичность (%)

    Фаг Nocardia NOC1 (KF879861) 34189 56.70 182 Фаг Gordonia GTE7 (JN035618) 100% 99%
    Nocardia фаг NOC2 (KF879862) 28456 61,17 150 Gordonia фаг GT3 100 % 99%
    Фаг Nocardia NOC3 (KF879863) 28465 67,49 147 Фаг Nocardia NBR1, полный геном (JN116828) 100% 99%

    Основная цель этого исследования заключалась в том, чтобы выделить и охарактеризовать нокардиофаги, которые могут уменьшить проблему пенообразования на очистных сооружениях в Индии.В настоящем исследовании бактериофаги NOC1 и NOC3 были выделены из ETP молочной промышленности, а фаг NOC2 был выделен из ETP, Nagpur, Ind

    .

    % PDF-1.4 % 213 0 объект > endobj xref 213 90 0000000016 00000 н. 0000002786 00000 н. 0000002954 00000 н. 0000002990 00000 н. 0000003502 00000 н. 0000003615 00000 н. 0000003727 00000 н. 0000003839 00000 н. 0000004741 00000 н. 0000005378 00000 п. 0000005542 00000 н. 0000006439 00000 н. 0000006586 00000 н. 0000006623 00000 н. 0000007793 00000 н. 0000008957 00000 н. 0000009023 00000 н. 0000022531 00000 п. 0000023852 00000 п. 0000025017 00000 п. 0000025950 00000 п. 0000026846 00000 н. 0000028011 00000 п. 0000028936 00000 п. 0000029575 00000 п. 0000030741 00000 п. 0000031622 00000 п. 0000032493 00000 п. 0000032634 00000 п. 0000032688 00000 п. 0000044450 00000 п. 0000045270 00000 п. 0000046089 00000 п. 0000047003 00000 п. 0000047303 00000 п. 0000047466 00000 п. 0000047698 00000 п. 0000048635 00000 п. 0000049397 00000 п. 0000052090 00000 н. 0000062453 00000 п. 0000065751 00000 п. 0000076209 00000 п. 0000087495 00000 п. 0000097419 00000 п. 0000108646 00000 п. 0000108706 00000 н. 0000108766 00000 н. 0000118744 00000 н. 0000119855 00000 н. 0000120141 00000 н. 0000120203 00000 н. 0000125009 00000 н. 0000126630 00000 н. 0000126915 00000 н. 0000127408 00000 н. 0000127495 00000 н. 0000145086 00000 н. 0000145158 00000 н. 0000145417 00000 н. 0000145515 00000 н. 0000145615 00000 н. 0000145732 00000 н. 0000145846 00000 н. 0000145984 00000 п. 0000146111 00000 п. 0000146249 00000 н. 0000146401 00000 п. 0000146531 00000 н. 0000146670 00000 н. 0000146785 00000 н. 0000146939 00000 н. 0000147112 00000 н. 0000147233 00000 н. 0000147385 00000 п. 0000147516 00000 н. 0000147635 00000 п. 0000147796 00000 н. 0000147946 00000 н. 0000148083 00000 н. 0000148244 00000 н. 0000148406 00000 н. 0000148539 00000 н. 0000148672 00000 н. 0000148812 00000 н. 0000148967 00000 н. 0000149118 00000 п. 0000149237 00000 п. 0000149408 00000 п. 0000002096 00000 н. трейлер ] / Назад 695162 >> startxref 0 %% EOF 302 0 объект > поток hb```f` b, ep * @ Y [ӂ29PM> bGgD> 9ϗJ [r ~ VXz {z \ * 'mk "V ULPL 珉 $ oO 4ѯCcc P $$ xa [LV: M; = .№

    .

    Выделение и характеристика фагов, инфицирующих Bacillus subtilis

    Бактериофаги были предложены в качестве альтернативного подхода для уменьшения количества патогенов в различных областях применения. Бактериофаги различной специфичности и вирулентности были выделены в качестве средства борьбы с патогенами пищевого происхождения. Мы изучили взаимодействие бактериофагов с видами Bacillus , которые очень часто сохраняются в промышленных применениях, таких как производство продуктов питания, из-за их устойчивости к антибиотикам и образования спор.Сравнительное исследование с использованием электронной микроскопии, PFGE и SDS-PAGE, а также определение диапазона хозяев, pH и термостойкости, скорости адсорбции, латентного времени и размера вспышки фага было выполнено на трех фагах семейства Myoviridae и одном фаге. из семейства Siphoviridae , которые инфицировали штаммов Bacillus subtilis . Фаги морфологически различны и характеризуются икосаэдрическими головками и сократительными (фаги SIOΦ, SUB ω и SPO σ ) или неконтрактильными (фаг AR π ) хвостами.Геномы SIOΦ и SUB ω состоят из 154 т.п.н. Капсид SIOΦ состоит из четырех белков. Бактериофаги SPO σ и AR π имеют размеры генома 25 и 40 т.п.н. соответственно. Оба фага, а также фаг SUB ω содержат 14 белков в своих капсидах. Фаги SIOΦ и SPO σ устойчивы к высоким температурам, кислотному (4,0) и щелочному (9,0 и 10,0) pH.

    1. Введение

    Недавние исследования показывают, что бактериофаги могут быть использованы как средство борьбы с патогенами пищевого происхождения [1–3].Поэтому новые фаги выделяются и описываются [4, 5]. Одним из наиболее распространенных в пищевой промышленности родов бактерий, потенциально контролируемых бактериофагами, является Bacillus , который принадлежит к гетерогенной группе грамположительных, эндоспорообразующих, факультативных анаэробных бактерий [6, 7]. Несмотря на многочисленные преимущества видов Bacillus в промышленных применениях, они также могут вызывать повреждения. Патогенность Bacillus anthracis для млекопитающих хорошо известна, а другие инфекции, вызываемые Bacillus , зарегистрированы с начала прошлого века [8, 9]. Bacillus cereus считается патогенным видом, вызывающим местные инфекции, бактериемию, сепсис, эндокардит и перикардит, а также инфекции центральной нервной системы и дыхательных путей [10-15]. Bacillus cereus является основным фактором пищевого отравления в результате выработки токсинов [16]. Помимо хорошо известных патогенных видов Bacillus , недавние исследования выявили продукцию энтеротоксинов и рвотного токсина B. subtilis, B. pumilus и B.licheniformis , что приводит к болезням пищевого происхождения [17–19]. Bacillus subtilis заразил 25% образцов пищевых продуктов в Нидерландах (молоко, дрожжи, мука, макаронные изделия, какао, шоколад, хлебобулочные изделия, мясные продукты, травы и специи) [20] и 12% сырья, образцы теста и хлеба в ЮАР [21]. Кроме того, контаминация спорами B. subtilis была обнаружена в пшеничной муке, панировочном хлебе [22] и желатине [23].

    Удаление загрязнения Bacillus ограничено из-за его устойчивости к физико-химическим методам дезактивации.Обычно в пищевой промышленности используются физические методы стерилизации или дезинфекции, такие как uv , гамма-излучение или высокая температура, но, к сожалению, они часто не эффективны против высокорезистентных спор Bacillus [24, 25]. Одним из вариантов лечения заражения Bacillus может быть фаготерапия [26].

    Бактериофаги - самая многочисленная группа вирусов [27, 28]. Они очень полезны для людей, проходящих фаготерапию [29]. С другой стороны, профилактическая фаговая терапия может устранить патогенные бактерии из пищевых продуктов.Фаги специфичны для хозяина и заражают только определенные виды или штаммы [1] за некоторыми исключениями [30]. Хотя исследования показали, что бактериофаги могут помочь в успешном уничтожении пищевых патогенов, таких как Listeria monocytogenes, Escherichia coli, Salmonella typhimurium или Campylobacter [1, 31], существует несколько коммерческих продуктов, таких как LISTEX P100, получившие статус GRAS [32]. Таким образом, необходимо определить критерии применения фагов для борьбы с бактериями в пищевых продуктах, и поэтому все вновь выделенные фаги, которые могут быть использованы в антибактериальной терапии, должны быть подробно охарактеризованы.Помимо использования изолированных фагов в качестве дезактивирующих агентов, их можно использовать для обнаружения бактерий и серотипирования или улучшения штаммов, недавно описанных Petty et al. [33]. Однако коммерческое применение бактериофагов требует оптимизации условий культивирования и детального определения физических и химических факторов, влияющих на жизнеспособность фагов [34, 35]. Первые попытки контролировать инфекцию Bacillus subtilis с помощью фагов были предприняты Ackermann et al. [36].Результаты показали крайнюю гетерогенность штаммов B. subtilis . Система фаготипов Акермана была использована Inatsu et al. [37] для дифференциации штаммов B. subtilis (натто) и других штаммов B. subtilis , выделенных из ферментированных соевых продуктов [38].

    Целью данной работы было выделить и охарактеризовать бактериофагов Bacillus с учетом их потенциального применения для фаготипирования, улучшения штаммов и уничтожения нежелательных штаммов Bacillus в пищевой промышленности.Нами выделили четыре бактериофага с различной специфичностью к 20 штаммам B. subtilis (). Подробные данные об их морфологии, термической и pH-стабильности, размере генома и массе капсидного белка описаны для бактериофагов, указанных для четырех репрезентативных штаммов B. subtilis .

    2. Материалы и методы
    2.1. Штаммы и бактериофаги Bacillus

    Происхождение бактериофагов, использованных в этом исследовании, а также их штаммов-хозяев показано в таблице 1. Bacillus штаммов 10 (выделено из почвы), SWV215 [39], B3 [40] и ATTC6633 [41] были использованы для детального исследования (таблица 1). Штаммы Bacillus поддерживали в виде замороженных запасов при -80 ° C в 1,5% питательном бульоне (Biocorp, Польша) с 2% агар-агаром (BioShop, Canada Inc) с добавлением 15% (об. / Об.) Глицерина. Для экспериментов штаммы культивировали на питательном агаре, а затем культивировали в течение ночи в жидком питательном бульоне. Бактериофаги, специфичные для Bacillus subtilis SUB ω , SPO σ , SIOΦ (Прим.номер KC699836) и AR π были выделены из почвы с добавлением литра культур Bacillus subtilis . Через неделю образцы почвы (1 г) суспендировали в воде, встряхивали (200 об / 30 мин) и центрифугировали (4500 об / мин / 10 мин), а супернатант фильтровали через полиэфирсульфон (PES) 0,22 μ мкм. Фильтр Millipore. Размножение фагов проводили следующим образом: 45 мл отфильтрованных образцов почвы и 5 мл культуры штамма Bacillus , выращенных в течение ночи в питательном бульоне, добавляли к 20 мл свежего питательного бульона и инкубировали в течение 24 ч при 37 ° C.Суспензию центрифугировали (4500 об / мин / 10 мин) и супернатант фильтровали через фильтр PES 0,22 мкм, мкм Millipore. Титр бактериофагов в фильтрате оценивали с использованием метода двойного агарового слоя Адамса [42].

    Б.subtilis 10 Наук, Факультет пищевых наук 7 9 9013

    Номер Штамм Происхождение Типирование бактериофагов
    SUB ω 9 SPO4 SIO AR π

    1 B.subtilis ATCC 6633 Польская академия наук, Вроцлав + + - -

    2 23 B. subtilisland, Институт Голливуда, 168 0 + 0 0
    3 B. subtilis SWV215 + + - - Вроцлавский университет, факультет биотехнологии - - + -

    5 B. subtilis + + - +
    6 B. subtilis Ż7-мутант B3 + + - - Б.subtilis Ż17-мутант B3 + + - +
    8 B. subtilis Ż25-мутант B3 + + + - - B. subtilis Hb36-мутант B3 + + - +
    10 B. subtilis B20 0 0
    11 Б.subtilis P22 + + - +
    12 B. subtilis KT20 0 - 0 0 0 0 subtilis 172 + + - +
    14 B. subtilis B24 0 + -
    0 9013 9013 -
    Б.subtilis PCM1938 Польская академия наук, Вроцлав + + - -
    16 B. subtilis PCM 2226 + + + +
    17 B. subtilis PCM 486 0 + - 0
    18 B. subtilis PCM 21896
    19 Б.subtilis PCM 2005 + + - 0
    20 B. subtilis PCM 2224 + +
    (-) Бляшки не сформированы, (+) отчетливые прозрачные бляшки и (0) мутные бляшки.

    Исходные фаги готовили в питательном бульоне и затем хранили при 4 ° C.

    2.2.Электронная микроскопия

    Лизат фага с высоким титром, профильтрованный через фильтр PES 0,22 мкм, мкм Millipore, центрифугировали при 25000 × g в течение 60 мин, и осадок дважды промывали ацетатом аммония (0,1 М, pH 7,0). Часть ресуспендированного осадка наносили на покрытые углеродом пленки Formvar, окрашивали 1% уранилацетатом в течение 30 с и исследовали в просвечивающем электронном микроскопе Philips CM 100 (Philips CM 100, Япония) при 80 кВ с увеличением 39000x. Размер фага определяли по среднему значению от пяти до семи независимых измерений с использованием хвоста фага Т4 (114 нм) в качестве контроля увеличения.

    2.3. Термическая обработка

    Термическое сопротивление всех бактериофагов определяли при 23, 50, 60, 70, 80, 90 и 100 ° C в термоблоке с регулируемой температурой (Labnet International. Inc.) при 121 ° C в автоклав при 4 ° C и −20 ° C в стандартном холодильнике и при −80 ° C в низкотемпературном морозильнике (REVCO Sanyo, Япония). Равные объемы фага (10 7 БОЕ / мл в стерильной воде) инкубировали в течение 1, 2, 5, 10, 15, 30, 60 и 180 минут при 4 ° C, а затем помещали на ледяную баню или размораживали.Образцы были проанализированы для определения выживаемости БОЕ с использованием метода двойного агарового слоя [42].

    2.4. Обработка pH

    Влияние pH на бактериофаги оценивали в CP (цитрат-фосфатном) буфере (0,2 M Na 2 HPO 4 / 0,1 M цитрат) в диапазоне pH от 2,0 до 8,0 и в карбонатном буфере ( 0,2 MH 2 CO 3 / 0,2 M NaHCO 3 ) в диапазоне pH от 9,0 до 11,0. Эксперименты проводили при комнатной температуре (25 ° C) в течение 1 и 6 ч.Образцы были проанализированы для определения БОЕ методом двойного агарового слоя [42].

    2,5. Определение диапазона хозяев

    Диапазон хозяев бактериофагов анализировали согласно Yang et al. [43] следующим образом: 10 8 бактериальных клеток смешивали с расплавленным 0,6% агаром и смесь выливали на 2% твердый агар для получения пластинок с двухслойным агаром. После затвердевания 10 мкл л бактериофага (> 10 6 БОЕ / мл) наносили пятнами на каждый планшет с каждым из различных штаммов Bacillus , инкубировали и проверяли наличие лизированных планшетов для определения диапазона хозяев.

    2.6. Скорость адсорбции, латентное время и размер вспышки фага

    Эксперименты проводили, как описано ранее [42, 44, 45] с небольшими изменениями. Равный объем фагов (10 6 –10 7 БОЕ / мл) добавляли к 0,9 мл ночных культур видов бактерий-хозяев и инкубировали при 37 ° C в течение 5 мин. После инкубации смесь разбавляли до 10 -5 и фильтровали через фильтр PES 0,22 мкм, мкм Millipore. Количество свободных фагов в фильтрате определяли дважды, используя метод двойного агарового слоя.

    Для определения латентного времени фага и размера всплеска был проведен одноэтапный эксперимент в соответствии с предыдущими описаниями [46] с модификациями. К 0,9 мл ночных культур бактерий-хозяев добавляли 0,1 мл суспензии бактериофага. Бактериям позволяли адсорбировать бактериофаги в течение 5 минут при 37 ° C; смесь разбавляли до 10 -5 или 10 -4 и дополнительно инкубировали в течение 135 мин при 37 ° C. Образцы отбирали с 10-минутными интервалами, и титр фага определяли методом двухслойной агаровой чашки.Размер взрыва рассчитывали как отношение конечного количества высвободившихся фаговых частиц к начальному количеству инфицированных бактериальных клеток в латентный период [42].

    2.7. Экстракция ДНК фага

    Частицы фага были частично очищены преципитацией ПЭГ [47]. Суспензии с высоким титром (10 10 БОЕ / мл) отфильтрованного лизата фага смешивали с NaCl (конечная концентрация 1 М) и инкубировали на льду в течение 1,5 часов. Затем добавляли ПЭГ 8000 до конечной концентрации 10% и смесь инкубировали на льду в течение 2.5 ч. Затем следовало центрифугирование осажденных фагов (10 000 g, 4 ° C, 20 мин). Осадки суспендировали в 10 мМ буфере ТЕ (pH 8,0) или буфере TM (10 мМ Трис-HCl, 100 мМ NaCl, 10 мМ MgCl 2 ; pH 7,4). Остаточный ПЭГ и бактериальный дебрис затем удаляли осторожной экстракцией в течение 30 с равным объемом хлороформа с последующим центрифугированием при 3000 × g, 4 ° C в течение 15 минут.

    2,8. Гель-электрофорез в импульсном поле PFGE

    Определение размера генома бактериофага с помощью PFGE проводили в соответствии с Lingohr et al.[48]. Очищенные фаговые частицы в 10 мМ буфере ТЕ (pH 8,0) включали в пропорции 1: 1 в 2% легкоплавкую агарозу в 10 мМ ТЕ. Пробки из твердого геля инкубировали в течение 2,5 ч при 54 ° C в 1 мл фагового буфера для лизиса, содержащего 50 мМ pH 8,0 трис-HCl, 50 мМ EDTA, 1% (мас. / Об.) SDS и 100 мкл г / мл. (конечная концентрация) протеиназы K (фаги SUB ω , SPO σ , SIOΦ) или 1 мг / мл протеиназы K (фаг AR π ). Пробки промывали не менее 4 раз в 10 мМ Трис / ЭДТА буфере (TE, pH 8.0) и гель-электрофорез в импульсном поле (PFGE) (Bio-Rad, UK) проводили в 1% агарозе в 0,5X буфере TBE (pH 8,3). Параметры PFGE были следующими: буфер 0,5X TBE; 6 В / см, время начального переключения 1 с; окончательное время переключения 15 с; время работы 16 ч; температура 12 ° C. Гели окрашивали бромистым этидием с последующим обесцвечиванием в воде miliQ. Размер генома определяли с помощью программного обеспечения BioRad Quantity One, используя маркер PFG низкого диапазона (New England BioLabs, Великобритания) в качестве стандарта.

    2.9. Получение структурных белков фага и SDS-PAGE

    Концентрированные частицы фага в буфере TM экстрагировали хлороформом (1: 1 об. / Об.) И после осторожного перемешивания центрифугировали при 3000 × g, 4 ° C в течение 15 мин.Частично очищенные фаговые частицы в водной фазе осаждали ультрацентрифугированием (Beckman Coulter) при 50 000 об / мин при 4 ° C в течение 60 мин. Осадки ресуспендировали в 1X загрузочном буфере Лэммли (62,5 мМ Трис-HCl, 2% SDS (мас. / Об.), 5% β -меркаптоэтанол (об. / Об.), 10% глицерин (об. / Об.), 0,04% ( w / v) бромфенолового синего; pH 6,8), кипятили в течение 5 мин и разделяли на 12% геле SDS-PAGE. Все гели запускали при 40 мА с использованием аппарата mini Protean (BioRad) и буфера Лэммли. Гели окрашивали реагентом для окрашивания Gel Code Blue (Thermo Scientific).Программное обеспечение Biorad Quantity One использовалось для молекулярного анализа структурных белков фага на основе предварительно окрашенного белка Ladder plus (Fermentas).

    2.10. Статистический анализ

    Все эксперименты проводили как минимум в трех экземплярах. Для статистического анализа полученных данных применялись программы Microsoft Excel 2007 (SD и -тест) и R (ANOVA). Стандартное отклонение было включено в цифры. Статистическая значимость определялась с использованием критерия Стьюдента. Был установлен уровень значимости.

    3. Результаты
    3.1. Выделение фагов

    Специфические бактериофаги Bacillus subtilis были выделены из почвы, инокулированной четырьмя различными (изолированными из разных мест) штаммами B. subtilis : 10, B3, ATTC 6633 и SWV215. Все изолированные фаги образовывали прозрачные бляшки со штаммами, использованными для выделения. Титры фагов варьировались от 10 10 для SUB ω и SPO σ до 10 13 для SIOΦ (таблица 2).

    3 π

    24

    3 π

    24 Б.subtilis 10 Phage16

    Фаг SIO SUB ω SPO σ AR π 24
    B. subtilis ATCC 6633 B. subtilis SWV215 B. subtilis
    B3

    мл 13 10 10 10 10 10 12

    3.2. Типирование фага

    Двадцать штаммов Bacillus subtilis использовали для определения специфичности четырех выделенных бактериофагов: SUB ω , SPO σ , SIOΦ и AR π (таблица 1).Фаг SUB ω инфицировал все протестированных штаммов Bacillus , за исключением B. subtilis 10. Для B. subtilis 168, B20, KT20, B24 и PCM 486 полученные бляшки были мутными. Фаг SPO σ не образовывал бляшек с штаммами B. subtilis 10 и KT20, но формировал отчетливые прозрачные бляшки со всеми другими штаммами. Фаг SIOΦ образовал бляшки с штаммами B. subtilis 168, 10, KT20 и PCM 2226, но прозрачные бляшки наблюдались только у штаммов Bacillus 10 и PCM 2226.Фаг AR π не образовывал бляшек со штаммами ATCC 6633, SWV215, 10, PCM1938, PCM 2226, PCM 2189 и PCM 2224. Четкие бляшки наблюдались для штаммов P22 и 172, а также для B3 и его мутантов (Таблица 1).

    3.3. Морфология фага

    Фаги принадлежали к двум морфотипам. Три фага (SIOΦ, SUB ω и SPO σ ) были отнесены к Myoviridae из-за появления икосаэдрических головок и сократительных хвостов с шейками, воротничками и базовыми пластинами (рисунки 1 (a), 1 (b) ) и 1 (в)).Длина головы и хвоста фага также указывает на родство с Myoviridae (таблица 3).

    9117 90IO B.subtilis SWV215 имел икосаэдрические головы и несокращающиеся длинные хвосты (Рисунок 1 (d), Таблица 3) и, таким образом, морфологически сходен с фагами, принадлежащими к семейству Siphoviridae .

    3.4. Тест на термостабильность и pH-стабильность

    Тест на термостабильность проводили для определения термостойкости тестируемых фагов при pH 7,0. Все фаги были стабильными через 180 мин при -80 ° C, -20 ° C, 4 ° C, 23 ° C, 30 ° C, 37 ° C и 50 ° C, и все фаги сохраняли 100% инфекционную активность после 1 мин инкубации при 90 ° C, 100 ° C и 121 ° C (данные не показаны). Был проведен тест ANOVA, и взаимодействие между типами тестируемых параметров фага было признано статистически важным. Таким образом, можно сказать, что скорость инактивации фагов различна для разных типов фагов.

    Фаг SIOΦ потерял общую активность через 2 мин при 80 ° C, 30 мин при 70 ° C и при 60 ° C только 1% от исходной активности наблюдался после 3-часового инкубационного периода. Фаг SUB ω потерял свою инфекционную способность через 1 мин при 80 ° C, 5 мин при 70 ° C и 180 мин при 60 ° C. Фаг SPO σ неактивен через 2 мин при 80 ° C, 15 мин при 70 ° C и 60 мин при 60 ° C соответственно. Фаг AR π терял активность через 2 мин при 80 ° C, 10 мин при 70 ° C и 3 часа при 60 ° C (рисунки 2 (а), 2 (б), 2 (в) и 2 ( г)).

    Оптимальный pH был определен путем тестирования стабильности фагов при различных pH через 60 мин (данные не показаны) и 6 ч инкубации при комнатной температуре (25 ° C). После 1-часовой инкубации при pH 2,0 все протестированные фаги утратили инфекционную способность. Обнаружены статистически значимые различия между тестируемыми фагами. Фаг SPO σ кажется чрезвычайно стабильным в диапазоне pH 6,0–8,0; После 6 ч инкубации активность SPO σ снизилась с 10 7 до 10 4 БОЕ / мл при pH 3.0 и pH 4,0 (Рисунок 3 (c)). При щелочном pH 10,0 и pH 11,0 активность снижалась на один порядок (рис. 3 (c)).

    Бактериофаг AR π оказался наиболее чувствительным к кислым и щелочным условиям и показал 100% активность только при pH 7,0 и pH 8,0 (рис. 3 (d)). Подобные результаты наблюдались только после 1 часа инкубации (данные не показаны).

    Фаги SIOΦ и SUB ω имели 100% активность в диапазоне pH 6,0-8,0, а SIOΦ имел пониженную активность при pH 4.0, 5,0 и 9,0 от 10 7 до 10 2 , 10 3 и 10 3 соответственно (рисунки 3 (а) и 3 (б)).

    Фаг SIOΦ оказался наиболее активным в адсорбции (50%) на штамме B. subtilis 10. Одноступенчатая кривая роста SIOΦ показала, что латентный период составлял 55–65 мин, а расчетный размер взрыва составлял ~ 74 фаговых частиц на инфицированную бактериальную клетку (Таблица 4). Фаг SPO σ был менее активен. Он был адсорбирован только 7,5% из B.subtilis SWV215 штамм. Латентный период SPO σ составлял 75–85 минут, а расчетный размер взрыва составлял ~ 23 фаговых частицы на инфицированную бактериальную клетку (таблица 4). Латентные периоды фагов SUB ω и AR π были такими же, как у фага SIOΦ, но адсорбция была ниже (12%), а время роста было короче (30 мин). Разница между фагами SUB ω и AR π наблюдалась по размеру их взрыва: для SUB ω это было всего ~ 8 фаговых частиц на инфицированную бактериальную клетку, тогда как для AR π это было ~ 37 фаговых частиц (таблица 4).


    Хост Phage Диаметр головки
    нм × нм
    Длина хвоста
    нм

    208

    B. subtilis ATCC 6633 SUB 223

    SPO 70

    B. subtilis B3 AR 342





    50 4 Размер генома фага, оцененный с помощью PFGE

    Размер интактной геномной ДНК четырех фагов в этом исследовании был оценен с помощью электрофореза в импульсном поле (PFGE). Для фагов SIOΦ, SUB ω и SPO σ , принадлежащих к семейству Myoviridae , размер их геномов составлял соответственно 154, 154 и 25 т.п.н. (рис. 4).Размер генома Ar π , единственного фага из семейства Siphoviridae , составлял 40 т.п.н. (рис. 4). Определенные значения размера генома сопоставимы со значениями, оцененными ICTV для указанных семейств фагов.


    3.6. Белковая композиция

    SDS-PAGE использовали для определения содержания структурных белков фаговых частиц. Вирионы фагов SIOΦ, SUB ω и SPO σ содержали структурные белки с преобладающими белковыми полосами, соответствующими соответственно ~ 52 кДа (SIOΦ), ~ 45, 31 кДа (SUB ω ) и 45 кДа ( СПО σ ) (рисунок 5).Фаг AR π содержал по крайней мере 14 структурных белков и, как было обнаружено, продуцировал три основные белковые полосы с молекулярными массами приблизительно 42, 37 и 31 кДа (фиг. 5).


    4. Обсуждение

    Bacillus имеет высокую распространенность в природе и способность образовывать термостойкие эндоспоры; следовательно, его трудно искоренить, например, в ферментированной пище, а постоянное присутствие полезных микроорганизмов имеет решающее значение для поддержания ожидаемого качества пищи.Бактериофаги являются естественными врагами бактерий для конкретных хозяев, и эффективное уничтожение бактериальных патогенов с помощью фагов является эффективным способом борьбы с вредными бактериями [2, 49].

    Бактериофаги могут иметь различные применения, такие как биоконтроль (уничтожение) нежелательных видов (штаммов), улучшение (отбор) штаммов, используемых для производства, и типирование штаммов. Все эти применения зависят от специфичности фага [50]. Может быть полезен как широкий, так и узкий диапазон хостов.В то время как довольно узкий диапазон хозяев позволит различать близкородственные штаммы по типированию штаммов, довольно широкий диапазон хозяев будет полезен для биоконтроля. По сравнению с биоконтролем, применение бактериофагов для улучшения и отбора промышленных штаммов описано плохо. Фактически, хорошо известно, что в крупномасштабном производстве фаговая инфекция может привести к коллапсу производства, как это было в случае ацетон-бутанольной ферментации [51]. Таким образом, в производственной практике либо ежемесячно используются различные штаммы, либо смесь штаммов используется для инокулята.Вращение штаммов с различной устойчивостью снижает риск накопления бактериофагов, заражающих штамм-продуцент, в промышленных условиях [52].

    Мы обнаружили четыре бактериофага с различной специфичностью в отношении двадцати штаммов Bacillus subtilis (таблица 1). Классификация бактериофагов в большинстве случаев основана на морфологических критериях и редко на молекулярных данных, например, на гомологии нуклеотидных последовательностей [53]. Учитывая морфологию, 96% всех бактериофагов принадлежат к отряду Caudovirales , и этот отряд подразделяется на три семейства: Myoviridae (25%), характеризующиеся сократительным хвостом; Siphoviridae (61%) с несокращающимся хвостом; и Podoviridae (14%) с коротким несокращающимся хвостом [54, 55].В 2009 году Международный комитет по таксономии вирусов (ICTV) предложил создать Myoviridae подсемейства Spounavirinae с родами SPO1-подобных вирусов и Twort-подобных вирусов и восемью видами фагов [56]. Недавно Klumpp et al. [57] предложили пересмотреть существующую таксономическую организацию семейства Myoviridae и оценили новых членов этой группы. В этой работе мы выделили три фага, SIOΦ, SUB ω и SPO σ , которые морфологически принадлежат к семейству Myoviridae , и фаг AR π , который классифицируется в семействе Siphoviridae (Рисунок 1).Геномы SIOΦ и SUB ω имеют размер 154 т.п.н. каждый и подобны другим фагам Bacillus subtilis , таким как SPO1 (145,7 т.п.н.), SP8, SP82G, h2, 2C, Φe или Φ25 (~ 150) [ 57]. SIOΦ имеет только четыре капсидных белка, подобных ΦH-подобным вирусам; однако вирусы типа ФН имеют геном всего 59 т.п.н. [58]. Бактериофаг SPO σ имеет размер генома 25 т.п.н. и ~ 14 капсидных белков, и эти особенности позволяют ему попасть в группу P2-подобных или Mu-подобных вирусов, но, к сожалению, вирусы этого класса содержат грамотрицательные бактерии как хосты [58].Размер генома фага AR π составляет 40 т.п.н., и он имеет ~ 14 капсидных белков. По этим характеристикам он может быть классифицирован как вирус, подобный N 15 , но очень длинный хвост (342 нм) исключает его из известной классификации [58]. Бактериофаги с самыми длинными хвостами в семействе Siphoviridae относятся к ΦM 1 -подобным вирусам (210 нм), и их хвост заканчивается выступом, как у фага AR π .

    Использование бактериофагов в биотехнологических процессах требует знания их характеристик, таких как диапазон хозяев, латентный период, время роста или устойчивость к стрессовым условиям, например, различным температурам или pH.Температура играет решающую роль в выживании бактериофагов, их способности прикрепляться и длине латентного периода [59]. Бактериофаги SIOΦ, SUB ω , SPO σ и AR π сохраняют стабильную активность через 3 часа при температурах от -80 ° C до 50 ° C (рис. 2). Фаги SIOΦ, SPO σ и AR π оказались устойчивыми к высоким температурам, и все они выживают через 2 мин при 80 ° C, 5 мин или дольше при 70 ° C и 180 мин (кроме 60 мин. для SPO σ ) при 60 ° C (рисунок 2).В целом представители семейств Myoviridae и Siphoviridae считаются устойчивыми к большим температурным колебаниям [35].

    Кислотность и щелочность окружающей среды - другие важные факторы, влияющие на стабильность фагов. Фаги SIOΦ и SPO σ наиболее устойчивы к кислотному (4,0) и щелочному (9,0 и 10,0) pH; Фаг AR π наименее устойчив к колебаниям pH. Оптимальные значения pH для всех исследованных фагов составляли 7,0 и 8.0 (рисунок 3). Lasobras et al. [60] предположили, что представители семейства Siphoviridae являются наиболее устойчивыми к неблагоприятным условиям. Однако фаг Ar π , который мы морфологически классифицировали как член Siphoviridae , активен только в узком диапазоне pH (6,0–8,0).

    Бактериофаг SIOΦ имел самый высокий процент адсорбции на хозяине Bacillus (50%) и высвобождал наибольшее количество частиц (~ 74) из клеток-хозяев (Таблица 4), а его титр фага был самым высоким (10 13 ) (Таблица 2).Благодаря высокой активности при низкой и высокой температуре и pH, SIOΦ кажется лучшим кандидатом для использования в промышленности.

    В литературе содержится много описаний экспериментов, проведенных в различных условиях и, следовательно, с разными результатами. Некоторые фаги Bacillus subtilis , такие как SP02c1 или SP82, имеют более высокий процент адсорбции, чем наши фаги [61], в то время как, с другой стороны, фаг SPO1 имеет такой же размер вспышки, как SIOΦ [62].

    По крайней мере, один из охарактеризованных выделенных бактериофагов был литическим для каждого тестируемого штамма Bacillus subtilis .Таким образом, они могут быть пригодны для фаготипирования этого вида бактерий.

    Конфликт интересов

    Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов в связи с публикацией данной статьи.

    Благодарности

    Работа поддержана грантами Польского национального центра исследований и разработок KB / 48/13639 / IT1-B / U / 08, грантом EU POIG.01.01.02-00-016 / 2008, грантом Министерство науки и высшего образования (Польша) и Европейский Союз в рамках Европейского фонда регионального развития через грант инновационной экономики (POIG.01.01.02-00-008 / 08), а также Вроцлавским центром биотехнологии, программой Ведущий национальный исследовательский центр (KNOW) на 2014–2018 годы.

    .

    Frontiers | Новые методы исследования бактериофаговой инфекции на одноклеточном уровне

    Результаты заражения фагом остаются в значительной степени неизвестными для некультурных хозяев

    Фаги и их бактериальные хозяева широко распространены в различных экосистемах, где бы они ни проводились исследования, включая пресную воду (Hennes and Simon, 1995), морскую воду (Bergh, 1989; Fuhrman, 1999; Wommack and Colwell, 2000), отложения (Danovaro et al., 2002), почва (Ashelford et al., 2003; Salifu et al., 2013) и человеческий рот, кишечник и дыхательные пути (Hitch et al., 2004; Летаров, Куликов, 2009; Willner et al., 2009; Stern et al., 2012; Reyes et al., 2013). Фаги влияют на глобальный биогеохимический цикл, манипулируя популяциями хозяев посредством смертности, горизонтального переноса генов и вирусного метаболического перепрограммирования. Во-первых, лизис микробных клеток, вызванный фагом, высвобождает органическое вещество и способствует круговороту углерода, азота и фосфора (Shelford et al., 2012; Jover et al., 2014). Во-вторых, опосредованный вирусами горизонтальный перенос генов может иметь серьезные последствия для эволюционных траекторий хозяина.В океанах цианобактериальные вирусы (цианофаги) захватили основные гены фотосистем, которые изменяют эволюционную траекторию этих глобально распределенных фотосистем (Lindell et al., 2004; Sullivan et al., 2006). В медицине факторы вирулентности, кодируемые профагами, обычно превращают хозяев в патогены (например, Clostridium botulinum , Corynebacterium diphtheria , Streptococcus pyogenes и Vibrio cholera ), которые вызывают заболевания у людей (Davis et al., 1999; Вагнер и Уолдор, 2002; Броуди и Фишетти, 2003; Брюссов и др., 2004; Мокроусов, 2009). Наконец, кодируемые вирусом «вспомогательные метаболические гены» (AMGs, sensu ; Breitbart et al., 2007) могут напрямую изменять метаболическую обработку инфицированных клеток в сторону от их неинфицированного состояния с известными последствиями для фотосинтеза (Mann et al., 2003 ; Dammeyer et al., 2008; Sharon et al., 2009; Thompson et al., 2011, и как указано выше), почти весь центральный углеродный метаболизм (Hurwitz et al., 2013b) и связанный цикл углерода и серы (Anantharaman и другие., 2014; Roux et al., 2014).

    Несмотря на очевидную важность результатов взаимодействия вируса с хозяином для функционирования экосистемы, наши знания в значительной степени сдерживаются из-за выращивания и технических ограничений. Лишь небольшая часть (<1%) микробов в природе растет в типичных лабораторных условиях (Rappe and Giovannoni, 2003), и лишь немногие из 50 известных бактериальных типов имеют культивируемые фаги, в которых преобладают три типа, включая Cyanobacteria (например, Suttle и Чан, 1993; Лу и др., 2001; Sullivan et al., 2003), Proteobacteria (например, Ceyssens et al., 2010; Fogg et al., 2011; Wittmann et al., 2014) и Bacteroidetes (например, Holmfeldt et al., 2013, 2014). Такие модельные системы чрезвычайно ценны для проверки экспериментальных гипотез и представляют собой золотой стандарт для развития механистического понимания динамики и исходов конкретной инфекции фага-хозяина. Однако даже в то время, когда в культуру входят новые и экологически многочисленные системы фаг-хозяин (например,g., фаги SAR11 и SAR116; Канг и др., 2013; Zhao et al., 2013), маловероятно, что подходы, основанные на культивировании, смогут отобразить огромную сеть взаимодействий фаг-хозяин в естественных экосистемах.

    В дополнение к установлению справочных данных, представляющих некоторую часть виросферы, существует потребность в более точной количественной оценке относительной важности результатов взаимодействия фага-хозяина в природе. Наиболее часто описываемые жизненные циклы фагов являются литическими и лизогенными. Литические фаги инфицируют клетки и используют аппарат хозяина для репликации своих нуклеиновых кислот (Young, 1992; Catalão et al., 2013). После самосборки капсидных белков с их геномами ДНК / РНК, клетки-хозяева лизируются, высвобождая 10–100 потомков во внеклеточную среду, которые затем стремятся инфицировать другие клетки. Напротив, фаги умеренного климата инфицируют клетку, а затем либо продолжают литическую инфекцию, либо входят в лизогению, в результате чего хромосома фага поддерживается либо интегрированной в хромосому хозяина, либо внехромосомно (Jiang and Paul, 1998; Little, 2005). При определенных условиях (например, УФ-излучение, химические вещества, питательные вещества) умеренные фаги индуцируются в литическом цикле для производства фагов-потомков и лизирования клеток.Литические фаги воздействуют на экосистему, уменьшая численность восприимчивых хозяев и высвобождая органическое вещество из лизированных клеток. Лизогения может улучшить приспособленность хозяина (Anderson et al., 2011a), включая увеличение скорости роста (Edlin et al., 1975), устойчивость к суперинфекции другими фагами (Bossi et al., 2003), устойчивость к стрессорам (Wang et al. , 2010), и вирулентность микроба-хозяина по отношению к его эукариотическому хозяину (Fortier and Sekulovic, 2013).

    Кроме литического и лизогенного циклов, фаги, как известно, также хронически заражают своих хозяев или вступают в псевдолизогенез.Хронически инфицирующие фаги продуцируют потомство, которое медленно отходит от клетки или передается дочерним клеткам без лизиса клеток в любое время (Weinbauer, 2004; Díaz-Muñoz and Koskella, 2014). Точно так же псевдолизогенное состояние (иногда известное как «состояние носителя»), которое плохо изучено, не подразумевает ни интеграции генома фага в геном хозяина, ни лизиса клетки-хозяина (Weinbauer, 2004; Lood and Collin, 2011; Díaz-Muñoz and Koskella, 2014), и ее также можно рассматривать как хроническую инфекцию.Считается, что эта стратегия заражения помогает фагам сохраняться в организме хозяина при недостатке питательных веществ для поддержания нормального роста микробов. Однако оба явления недостаточно описаны в естественных сообществах, и их экологические последствия остаются количественно неизвестными, по крайней мере частично, из-за отсутствия подходящих методов.

    Это оставляет без ответа три фундаментальных вопроса: (1) , кто кого заражает, , (2) , сколько процентов микробных клеток инфицировано в конкретный момент времени , и (3) , как инфекция прогрессирует с течением времени или при различных условиях. Условия выращивания .К счастью, некоторые из этих столь необходимых методов начинают появляться. К ним относятся вирусная маркировка (Deng et al., 2012) и вирусная маркированная метагеномика (Deng et al., 2014), скрининг фосмидных библиотек с большими вставками (Mizuno et al., 2013) и in silico связей, полученных из последовательности последовательностей. (Canchaya et al., 2003; Paul, 2008; Akhter et al., 2012) или идентификация CRISPR (Andersson, Banfield, 2008; Anderson et al., 2011b; Weinberger et al., 2012). Кроме того, независимый от состава последовательности подход метагеномного анализа (Albertsen et al., 2013) способствует восстановлению более полных геномов бактерий, в том числе редких по численности, что позволяет анализировать вирусные сигналы на уровне популяции. Хотя все эти методы невероятно эффективны для изучения геномных сигналов популяции в наборах данных, им не хватает возможности разработать единичную перспективу взаимодействия вируса с хозяином.

    Здесь мы рассматриваем новые одноклеточные методы для изучения разнообразия фагов и исходов инфекции, уделяя особое внимание тем, которые также обеспечивают доступ к некультивируемым хозяевам.Эти методы используют информацию о последовательностях, которая становится все более доступной для поиска вирусных сигналов из наборов одноклеточных геномных данных и / или для разработки зондов и праймеров для нацеливания на определенные группы фаг-хозяин во времени и пространстве в сложных сообществах.

    Извлечение «вируса» из некультивируемых одноклеточных амплифицированных геномов (SAG)

    Экологи-микробиологи встают перед проблемой понимания «невидимого большинства» (Whitman et al., 1998) или «микробной темной материи» (Rinke et al., 2013) путем секвенирования одноклеточных амплифицированных геномов (SAG). Этот процесс работает путем выделения отдельных клеток из образца окружающей среды (например, микропипетирование, сортировка клеток с активацией флуоресценции, разделение микрофлюидных клеток), скрининга этих клеток с использованием секвенирования маркерных генов, а затем амплификации и секвенирования ДНК из представляющих интерес клеток (Lasken , 2012; Macaulay, Voet, 2014). Обычно исследователей интересует, какой метаболизм связан с этими данными о последовательности, чтобы связать известные метаболические процессы с их организменными «хозяевами».Однако такие данные также представляют собой сокровищницу для открытия новых вирусов. Например, анализ SAG выявил полный геном вируса с одноцепочечной ДНК, связанный с клеткой одной клады, но не с двумя другими морскими пикобилифитами (Yoon et al., 2011).

    Помимо общих обследований, SAG предлагают возможность целенаправленного экологического и эволюционного изучения конкретных пар фаг-хозяин в природе, что представляет собой серьезную проблему в данной области и достижимо только с использованием культур.Например, недавнее исследование (Roux et al., 2014) в модельной зоне минимума кислорода в морской среде нацелено на фаги бактерий SUP05, некультивируемой группы, критически важной в этой среде для химиоавтотрофии, обусловленной циклическим круговоротом углеродных и серных питательных веществ (Wright et al. , 2012). Всего 127 SUP05 SAG секвенировали и анализировали на предмет вирусного сигнала, что привело к геномным эталонным последовательностям для 69 новых фагов (Roux et al., 2014). Распределение обнаруженных фагов по SAG предполагает, что около одной трети клеток SUP05 были инфицированы, с более высокой частотой инфицирования, когда клетки более активны.Сравнение этих новых эталонных геномов фагов с 189 наборами вирусных или микробных метагеномных данных показало, что фаги SUP05 сохраняли устойчивость в течение 3 лет в зоне минимального кислородного минимума, но были эндемичны с небольшими указаниями на вирусы, встречающиеся в любых других наборах данных, доступных для популяционного уровня анализ. Несомненно, по мере того, как становится доступным больше данных о микробных последовательностях, SAG будут предоставлять неоценимый ресурс для дальнейшего картирования виросферы и получения экологического и эволюционного понимания динамики взаимодействия конкретных фагов и хозяев.

    Связывание вирусов с их хостами с помощью Digital PCR

    Цифровая ПЦР

    первоначально использовалась для количественного определения доли молекул ДНК с предопределенными мутациями в раковых клетках (Vogelstein and Kinzler, 1999). Вкратце, геномную ДНК разводят до исчезновения в микротитровальных планшетах (например, 96- или 384-луночных планшетах), чтобы отдельные матрицы можно было отдельно амплифицировать с помощью ПЦР. Это позволяет обнаруживать редкую мутантную матрицу из смеси с чувствительностью и точностью, превышающей ~ 2-кратные пределы обнаружения, возможные с помощью количественной ПЦР в реальном времени (Smith and Osborn, 2009; Baker, 2012).На основе измерения флуоресценции мутантный сигнал можно отличить от сигнала дикого типа по петлеобразной последовательности флуоресцентного зонда молекулярного маяка-RED (MB-RED, 5'-Cy3-олигонуклеотидный зонд-Dabcyl-3 '), который обнаруживает дикие продукты типа и мутантные по сравнению с зондом MB-GREEN (5'-флуоресцеин-олигонуклеотидный зонд-Dabcyl-3 '), который распознает только матрицу дикого типа, поскольку мутации препятствуют гибридизации зонда.

    Применение микрофлюидной технологии улучшает цифровую ПЦР (Ottesen et al., 2006; Марси и др., 2007; Zare and Kim, 2010), позволяя проводить крупномасштабные исследования (например, изолировать и анализировать отдельные клетки на 765-камерной панели массива ПЦР, где большинство камер не содержат или не содержат одну клетку; рис. 1A). В сочетании с секвенированием микрожидкостная цифровая ПЦР помогла выявить ассоциации фага и хозяина из образцов окружающей среды (например, задней кишки термитов; Tadmor et al., 2011), в частности, отвечая на два важных исследовательских вопроса в вирусной и микробной экологии: кто кого заражает и что процент определенных клеток-хозяев инфицирован определенным фагом.Прагматически ассоциация фаг-хозяин выявляется совместно локализованными флуоресцентными сигналами (FAM и HEX для фага и хозяина, соответственно). Продукты ПЦР консервативного гена фага (например, терминазы) гибридизуются с зондом, меченным FAM, в то время как продукты бактериального гена 16S рРНК связываются с зондом, меченным HEX. Наконец, фаг и хозяин могут быть идентифицированы путем секвенирования ДНК, извлеченной из камер массива ПЦР, с совместно локализованными сигналами.

    РИСУНОК 1. Обзор процедур одноклеточных экспериментальных методов для изучения взаимодействий фаг-хозяин. (A) Для микрожидкостной цифровой ПЦР клетки сортируются на матричной панели с большинством камер, не содержащих или не содержащих одиночные клетки (адаптировано из Tadmor et al., 2011). Параллельная амплификация проводится как для фаговых, так и для бактериальных маркерных генов. Совместная локализация фаговых и бактериальных сигналов показана в каналах FAM и HEX, соответственно, с флуоресценцией в половине каждой камеры массива ПЦР. (B) Для фагаFISH образец фага-хозяина иммобилизован на 0.2 мкм фильтровальные мембраны или приклеенные к положительно заряженным предметным стеклам (адаптировано из Allers et al., 2013). Ген бактериального маркера (16S рРНК) обнаруживается олигозондами, конъюгированными с молекулами пероксидазы хрена (HRP), которые катализируют отложение многих флуоресцентно меченых тирамидов (например, зеленого Alexa 488 ). Впоследствии ген маркера фага выявляется с помощью набора зондов двухцепочечной ДНК (6–12), меченных молекулами дигоксигенина (DIG). Затем DIG распознается антителом, меченным молекулой HRP, чтобы катализировать отложение многих флуоресцентно меченных тирамидов (например,г., красный Алекса 595 ).

    Критическим шагом в применении микрофлюидной цифровой ПЦР к другим системам является разработка соответствующих праймеров. В работе с задним кишечником термитов (Tadmor et al., 2011) универсальные праймеры 16S рРНК и праймеры терминаз использовали для идентификации хозяина и фага, соответственно. Новые наборы праймеров могут быть разработаны путем анализа наборов метагеномных данных (например, с использованием Metagenome Cluster Analysis Tool; Tadmor et al., 2011) для выявления генов-маркеров, специфичных для клонов, для конкретных вирусных и микробных мишеней.Программа CODEHOP (Rose et al., 2003) может затем исследовать области маркерных генов для создания праймеров с минимальной вырожденностью и димеров праймеров, а также профилей температуры плавления, аналогичных профилям универсального набора праймеров бактериальной рРНК, чтобы обеспечить коамплификацию. Затем несколько наборов разработанных праймеров тестируются экспериментально для оптимизации производительности амплификации и предела обнаружения (например, <100 копий гена; Tadmor et al., 2011).

    Существует несколько проблем при связывании вирусов с их хозяевами с помощью микрофлюидной цифровой ПЦР.Во-первых, ложноположительные сигналы могут происходить от множества фаговых генов, высвобождаемых из преждевременно лизированных клеток, множества бактериальных генов 16S рРНК из клеток, прикрепленных к одной и той же камере, или флуоресцентного сигнала, выходящего из соседних камер (Tadmor et al., 2011). Эти проблемы можно обойти, исключив камеры с множественными бактериальными и / или вирусными сигналами, что, в частности, исключает сопутствующие инфекции, частота которых в значительной степени неизвестна, и рассматривая только камеры, окруженные камерами без флуоресценции в обоих каналах.В качестве альтернативы можно применить стратегию штрих-кодирования, чтобы индивидуальная матрица ДНК могла быть помечена уникальным штрих-кодом, амплифицирована и считана путем секвенирования (Kinde et al., 2011). Во-вторых, 765-камерная матричная панель ПЦР, хотя и уже значительно увеличила пропускную способность, все же, вероятно, является лишь крошечной подвыборкой естественного разнообразия. Одним из путей продвижения вперед могло бы стать применение капельной стратегии (Hindson et al., 2011; Jones et al., 2014) для сортировки клеток на капли нанолитрового размера (QX100 / QX200 Droplet Digital PCR System, Bio-Rad), где можно было бы использовать ПЦР. происходят в масштабах от 10 до 1000 реакций при использовании автоматизированных жидкостных систем.Такие шкалы данных позволят исследователям изучить конкретные пары фаг-хозяин с очень небольшой долей клеток и / или фагов в образцах окружающей среды.

    Связывание и визуализация взаимодействий фаг-хозяин с помощью флуоресценции In situ Гибридизация

    Альтернатива цифровым методам ПЦР, флуоресцентные методы in situ гибридизации (FISH) дают возможность исследовать специфические взаимодействия фага с хозяином. GeneFISH (Moraru et al., 2010) изначально был разработан для обнаружения генов клеточных маркеров на уровне отдельных клеток.Вкратце, микробные сообщества собирают (например, на мембранных фильтрах 0,2 мкм или положительно заряженных предметных стеклах), а затем вводят зонды для нацеливания на ген бактериального маркера (например, 16s рРНК) и биогеохимически значимый ген. Молекулы пероксидазы хрена (HRP), связанные с зондами, катализируют осаждение многих флуоресцентно меченых тирамидов, так что обе генные мишени представлены разными флуоресцентными сигналами (например, зеленым Alexa 488 и красным Alexa 595 ), что снова делает возможной совместную работу с микроскопом. -локализация отдельных генных мишеней.Здесь ставилась цель найти микробных «хозяев» биогеохимически важных генов из образцов сложных сообществ.

    Основываясь на этих открытиях, phageFISH (Allers et al., 2013) был разработан для более чувствительного нацеливания на маркерные гены как клеток, так и их инфицирующих фагов. Он улучшил предыдущие методы на основе генов FISH и FISH (Hoshino and Schramm, 2010; Kawakami et al., 2010; Moraru et al., 2010) за счет увеличения эффективности обнаружения фаговых генов с менее чем 40% до 98% за счет использования большего количества зондов. (до 12 зондов, ∼300 пар оснований каждый), чтобы обеспечить обнаружение одной копии гена фага в клетке.Хотя длинные зонды (~ 800 п.н.) использовались для достижения аналогичной эффективности обнаружения (Kawakami et al., 2012), специфичность связывания для встречающихся в природе фаговых мишеней может быть затронута из-за высокой генетической изменчивости, когда такие длинные участки консервации встречаются редко. Такая высокая чувствительность позволяет phageFISH измерять динамику инфекции (рис. 1B) от ранней (одна фаговая матрица) до поздней / взрывной стадии (несколько фаговых матриц инкапсулированы и разложены), как продемонстрировано в системе модели морской подовирус – гаммапротеобактериальный хозяин (Allers et al., 2013). Такие измерения неоценимы для различения литических, лизогенных и хронических форм фаговой инфекции (рис. 2), и phageFISH - единственный доступный метод, позволяющий сделать это без генетических факторов.

    РИСУНОК 2. Возможное применение phageFISH для определения способов заражения. С течением времени инфекции фаги могут быть обнаружены как литические (например, рассеивание фагового сигнала вместе со снижением / потерей бактериального сигнала), хронические (например, постепенное усиление фагового сигнала вместе с отсутствием снижения / потери бактериального сигнала). сигнал) или лизогенный (например,g., без изменения фагового сигнала). Интенсивность фагового сигнала (красный) останется постоянной для лизогенных инфекций, в то время как она значительно возрастет для литических инфекций и в меньшей степени для хронических инфекций. Бактериальный сигнал (зеленый) со временем будет уменьшаться для литической инфекции в результате лизиса клеток и высвобождения фагового потомства, тогда как он должен оставаться неизменным при хронических инфекциях из-за производства потомства, медленно измельчаемого без нарушения целостности клеточной мембраны.Таким образом, сигналы двойного мечения могут помочь различить три режима фаговой инфекции на уровне одной клетки.

    Для модельных систем с одним фагом и хозяином создание наборов зондов несложно с идентификацией 6–12 участков гена с одинаковым% G + C и длиной для достижения температур плавления, которые находятся в диапазоне не более 1–2 ° C. Однако для образцов окружающей среды требуется биоинформатика для определения подходящих областей сохранения, поскольку даже основные ортологичные гены вирусов могут быть идентичны <40% для 21 из 57 протестированных вирусных таксонов (Kristensen et al., 2013). Растущие наборы вирусных метагеномных данных [например, виромы из морской воды (Hurwitz and Sullivan, 2013), пресной воды (Roux et al., 2012), морских отложений (Breitbart et al., 2004; Yoshida et al., 2013) и кишечника человека ( Waller et al., 2014)] должны по крайней мере предоставить данные о последовательности для идентификации высококонсервативных фаговых генов-мишеней, подходящих для создания зонда phageFISH. Также хорошо изученные группы фагов, такие как T4-подобные миовирусы (Sullivan et al., 2010; Deng et al., 2014) и T7-подобные подовирусы (Labrie et al., 2013), для которых уже определены «ядерные геномы», предлагают основные исходные материалы для разработки и применения зонда phageFISH.С практической точки зрения, зонды должны нацеливаться на все представляющие интерес фаги с не более чем 5% несоответствий, чтобы быть эффективными (Moraru et al., 2010), что требует рассмотрения соответствующих подгрупп для нацеливания.

    Помимо проблем, связанных с конструкцией зонда, использование этапа каталитического осаждения репортера (CARD) ограничивает phageFISH в лучшем случае «относительной количественной оценкой». В частности, phageFISH не может абсолютно количественно определить фаговые мишени в клетках, где молекулы тирозина, находящиеся в непосредственной близости от связанных с мишенью зондов, становятся ограниченными.Чтобы получить абсолютную количественную оценку сигнала фага каждой клетки, этап CARD необходимо исключить, возможно, заменить микроскопией сверхвысокого разрешения, чтобы обеспечить чувствительное обнаружение сигнала (Huang et al., 2010; Schermelleh et al., 2010; Vaughan et al. , 2012). Наконец, phageFISH в настоящее время имеет относительно низкую пропускную способность, поскольку одновременно можно обрабатывать только ограниченное количество образцов на мембранных фильтрах или положительных предметных стеклах. Для увеличения производительности, особенно для экспериментов, сравнивающих заражение одним фагом на нескольких хозяевах или разными фагами на одном и том же хозяине, образцы phageFISH могут быть приготовлены в формате 96- или 384-луночного планшета и проанализированы с помощью автоматизированной системы визуализации.

    Заключение

    Эти три появляющихся метода позволят будущим исследованиям изучить взаимодействие фаг-хозяин на уровне одной клетки с особыми преимуществами в доступе к некультивируемым парам фаг-хозяин в природе. Извлечение вирусного сигнала из быстро растущих наборов данных SAG предлагает высокопроизводительный информационный подход для идентификации пар фаг-хозяин и умеренных фагов, а также для оценки частоты инфицирования микробных популяций. В дополнение к этому цифровая ПЦР и phageFISH используют отслеживание гена маркера разрешения одной клетки для конкретных пар фаг-хозяин в пространстве и времени с большим потенциалом для высокопроизводительной адаптации, которая позволит более быстрый скрининг и крупномасштабное экспериментальное отслеживание.В то время как микрофлюидная цифровая ПЦР, вероятно, имеет более непосредственную высокую пропускную способность, phageFISH предлагает единственную возможность различать стратегии заражения (например, литическая, хроническая, лизогенная) посредством динамических измерений отдельных клеток. Чтобы лучше понять динамику конкретных вирусных генов или функцию любых кодируемых вирусом генов, необходимы исследования экспрессии генов или белков в ходе инфекции (например, Lindell et al., 2007; Dammeyer et al., 2008; Thompson et al. , 2011). Вместе эти и другие достижения виромики (например,г., Andrews-Pfannkoch et al., 2010; Джон и др., 2011; Duhaime et al., 2012; Hurwitz et al., 2013a; Culley et al., 2014), информатики (например, Jiang et al., 2012; Albertsen et al., 2013; Gagic et al., 2014; Hurwitz et al., 2014) и теории (например, Beckett and Williams, 2013; Weitz et al., 2013; Soffer et al., 2014; Thingstad et al., 2014) трансформируют нашу способность исследовать естественные вирусные сообщества на уровне отдельных клеток и всей популяции и все больше и больше у их хозяев. Хотя данный обзор посвящен фагам, соответствующие архейные хозяева и их вирусы также могут быть исследованы с использованием этих методов.Эти достижения должны помочь вирусологам и микробам-экологам начать разработку моделей прогнозирования для этих важнейших экологических и эволюционных винтиков в природных экосистемах.

    Заявление о конфликте интересов

    Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

    Благодарности

    Мы благодарим наших коллег Мию Брейтбарт, Салли Чисхолм, Морин Коулман, Джеда Фурмана, Стивена Халлама, Филипа Хугенхольца, Дебби Линделл, Фореста Роуэра, Грига Стюарда, Джошуа Вейца, Марка Янга и членов лаборатории TMPL за годы активного обсуждения вирусной экологии. методы.Эта публикация частично финансируется Фондом Гордона и Бетти Мур, грантами GBMF2631, GBMF3305 и GBMF3790 Мэтью Б. Салливану.

    Список литературы

    Альбертсен, М., Хугенгольц, П., Скаршевски, А., Нильсен, К. Л., Тайсон, Г. У., и Нильсен, П. Х. (2013). Последовательности генома редких, некультивируемых бактерий, полученные путем объединения нескольких метагеномов с дифференцированным охватом. Нац. Biotechnol. 31, 533–538. DOI: 10.1038 / NBT.2579

    Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Аллерс, Э., Moraru, C., Duhaime, M., Beneze, E., Solonenko, N., Barrero-Canosa, J., et al. (2013). Динамика вирусной инфекции на одноклеточном и популяционном уровне выявляется с помощью фагаFISH - метода визуализации внутриклеточных и свободных вирусов. Environ. Microbiol. 15: 2306. DOI: 10.1111 / 1462-2920.12100

    Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Анантараман К., Духейм М. Б., Брейер Дж. А., Вендт К. А., Тонер Б. М. и Дик Г. Дж. (2014). Гены окисления серы у разнообразных глубоководных вирусов. Наука 344, 757–760. DOI: 10.1126 / science.1252229

    Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Андерсон, Р. Э., Бразелтон, У. Дж., И Баросс, Дж. А. (2011b). Использование CRISPR в качестве метагеномного инструмента для идентификации микробных хозяев диффузного потока гидротермального сообщества вирусов. FEMS Microbiol. Ecol. 77, 120–133. DOI: 10.1111 / j.1574-6941.2011.01090.x

    Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Эндрюс-Пфаннкоч, К., Фадрош, Д. В., Торп, Дж., И Уильямсон, С. Дж. (2010). Опосредованное гидроксиапатитом разделение геномов двухцепочечной ДНК, одноцепочечной ДНК и РНК от природных вирусных сообществ. заявл. Environ. Microb. 76, 5039–5045. DOI: 10.1128 / AEM.00204-10

    Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Брейтбарт, М., Фелтс, Б., Келли, С., Махаффи, Дж. М., Нултон, Дж., Саламон, П. и др. (2004). Разнообразие и популяционная структура прибрежного морского вирусного сообщества. Proc. Биол. Sci. 271, 565–574. DOI: 10.1098 / rspb.2003.2628

    Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Брейтбарт М., Томпсон Л. Р., Саттл С. С. и Салливан М. Б. (2007). Изучение огромного разнообразия морских вирусов. Океанография 20, 353–362. DOI: 10.5670 / oceanog.2007.58

    CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Броуди, Т. Б., и Фишетти, В. А. (2003). Лизогенное преобразование Tox- Streptococcus pyogenes в Tox + с помощью лизогенных Streptococci или свободного фага in vivo. Заражение. Иммун. 71, 3782–3786. DOI: 10.1128 / IAI.71.7.3782-3786.2003

    CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Канчайя, К., Про, К., Фурнус, Г., Бруттин, А., и Брюссоу, Х. (2003). Геномика профагов. Microbiol. Мол. Биол. R. 67, 238–276. DOI: 10.1128 / MMBR.67.2.238-276.2003

    CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Каталао, М. Дж., Гил, Ф., Мониш-Перейра, Дж., Сан-Жозе, К., и Пиментел, М. (2013). Разнообразие систем бактериального лизиса: бактериофаги указывают путь. FEMS Microbiol. Ред. 37, 554–571. DOI: 10.1111 / 1574-6976.12006

    Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Ceyssens, P.-J., Brabban, A., Rogge, L., Lewis, M. S., Pickard, D., Goulding, D., et al. (2010). Молекулярно-физиологический анализ трех фагов Pseudomonas aeruginosa , относящихся к «N4-подобным вирусам». Вирусология 405, 26–30. DOI: 10.1016 / j.virol.2010.06.011

    Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Калли, А.И., Мюллер, Дж. А., Белкейд, М., Вуд-Чарлсон, Э. М., Пуассон, Г., и Стюард, Г. Ф. (2014). Характеристика РНК-вирусов в тропической морской воде с использованием целевой ПЦР и метагеномики. мБио 5, e01210 – e01214. DOI: 10.1128 / mBio.01210-14

    Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Даммайер, Т., Бэгби, С. К., Салливан, М. Б., Чизхолм, С. В., и Франкенберг-Динкель, Н. (2008). Эффективный фаговый биосинтез пигментов океанических цианобактерий. Curr. Биол. 18, 442–448. DOI: 10.1016 / j.cub.2008.02.067

    Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Дэвис, Б. М., Кимси, Х. Х., Чанг, В. и Уолдор, М. К. (1999). Бактериофаг CTXφ Vibrio cholerae O139 Calcutta является инфекционным и кодирует новый репрессор. J. Bacteriol. 181, 6779–6787.

    Google Scholar

    Дэн, Л., Грегори, А., Йилмаз, С., Поулос, Б., Гугенгольц, П.и Салливан М. (2012). Противопоставление жизненных стратегий вирусов, инфицирующих фото- и гетеротрофные бактерии, выявленное с помощью вирусной маркировки. мBio 3, e00516 – e00512. DOI: 10.1128 / mBio.00516-12

    Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Deng, L., Ignacio-Espinoza, J. C., Gregory, A. C., Poulos, B. T., Weitz, J. S., Hugenholtz, P., et al. (2014). Мечение вирусов выявляет дискретные популяции в пространстве последовательностей вируса Synechococcus . Природа 513, 242–245. DOI: 10.1038 / природа13459

    Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Диас-Муньос, С. Л., и Коскелла, Б. (2014). «Взаимодействие бактерий и фагов в естественной среде», в Advances in Applied Microbiology , ред. С. Сима и Дж. Джеффри (Майкл, Миннесота: Academic Press), 135–183.

    Google Scholar

    Duhaime, M. B., Deng, L., Poulos, B. T., and Sullivan, M. B. (2012). К количественной метагеномике диких вирусов и других образцов ДНК сверхнизкой концентрации: тщательная оценка и оптимизация метода амплификации линкера. Environ. Microbiol. 14, 2526–2537. DOI: 10.1111 / j.1462-2920.2012.02791.x

    Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Фогг, П.С.М., Хайнс, А.П., Дигби, Э., Ланг, А.С., и Битти, Дж. Т. (2011). Характеристика недавно открытого Mu-подобного бактериофага, RcapMu, в штамме Rhodobacter capsulatus SB1003. Вирусология 421, 211–221. DOI: 10.1016 / j.virol.2011.09.028

    Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Гагич, Д., Маклин, П. Х., Ли, Д., Аттвуд, Г. Т., и Мун, К. Д. (2014). Улучшение генетической представленности редких таксонов в сложных микробных сообществах с помощью методов нормализации ДНК. Мол. Ecol. Ресурс. (Предварительная онлайн-публикация). DOI: 10.1111 / 1755-0998.12321

    Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Хиндсон, Б. Дж., Несс, К. Д., Маскелье, Д. А., Белградер, П., Эредиа, Н. Дж., Макаревич, А. Дж. И др. (2011). Высокопроизводительная система цифровой ПЦР по каплям для абсолютного количественного определения количества копий ДНК. Анал. Chem. 83, 8604–8610. DOI: 10.1021 / ac202028g

    Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Холмфельдт, К., Ховард-Варона, К., Солоненко, Н., Салливан, М. Б. (2014). Противопоставление геномных паттернов и стратегий заражения двух сосуществующих родов Bacteroidetes podovirus. Environ. Microbiol. 16, 2501–2513. DOI: 10.1111 / 1462-2920.12391

    Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Хольмфельдт, К., Солоненко, Н., Шах, М., Корриер, К., Риман, Л., Верберкмоес, Н. К. и др. (2013). Двенадцать ранее неизвестных родов фагов повсеместно распространены в мировом океане. Proc. Natl. Акад. Sci. США 110, 12798–12803. DOI: 10.1073 / pnas.1305956110

    Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Хошино, Т., и Шрамм, А. (2010). Обнаружение генов денитрификации с помощью in situ амплификации-флуоресценции in situ гибридизации, чтобы связать метаболический потенциал с идентичностью внутри бактериальных клеток. Environ. Microbiol. 12, 2508–2517. DOI: 10.1111 / j.1462-2920.2010.02224.x

    Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Гурвиц, Б. Л., Денг, Л., Поулос, Б. Т., и Салливан, М. Б. (2013a). Оценка методов концентрации и очистки сообществ океанических вирусов с помощью сравнительной воспроизводимой метагеномики. Environ. Microbiol. 15, 1428–1440. DOI: 10.1111 / j.1462-2920.2012.02836.x

    Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Гурвиц, Б.Л., Вествелд, А. Х., Брам, Дж. Р., Салливан, М. Б. (2014). Моделирование экологических факторов в морских вирусных сообществах с использованием сравнительной метагеномики и сетевого анализа. Proc. Natl. Акад. Sci. США 111, 10714–10719. DOI: 10.1073 / pnas.1319778111

    Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Цзян, Б., Сун, К., Рен, Дж., Дэн, М., Сунь, Ф., и Чжан, X. (2012). Сравнение метагеномных образцов с использованием сигнатур последовательностей. BMC Genom. 13: 730. DOI: 10.1186 / 1471-2164-13-730

    Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Джон, С. Г., Мендес, К. Б., Дэн, Л., Поулос, Б., Кауфман, А. К. М., Керн, С. и др. (2011). Простой и эффективный метод концентрации океанических вирусов путем химической флокуляции. Environ. Microbiol. Реп. 3, 195–202. DOI: 10.1111 / j.1758-2229.2010.00208.x

    Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Джонс, М., Уильямс, Дж., Гертнер, К., Филлипс, Р., Херст, Дж., И Фратер, Дж. (2014). Обнаружение цели с низким числом копий с помощью Droplet Digital PCR за счет применения нового биоинформатического конвейера с открытым доступом, 'Definetherain' J. Virol. Методы 202, 46–53. DOI: 10.1016 / j.jviromet.2014.02.020

    Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Джовер, Л. Ф., Эгер, Т. К., Бьюкен, А., Вильгельм, С. В., и Вайц, Дж. С. (2014). Элементный состав вирусных частиц: последствия для морских биогеохимических циклов. Нац. Rev. Microbiol. 12, 519–528. DOI: 10.1038 / nrmicro3289

    Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Каваками С., Хасегава Т., Имачи Х., Ямагути Т., Харада Х., Охаши А. и др. (2012). Обнаружение однокопийных функциональных генов в прокариотических клетках с помощью двухпроходного TSA-FISH с полинуклеотидными зондами. J. Microbiol. Методы 88, 218–223. DOI: 10.1016 / j.mimet.2011.11.014

    Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Каваками, С., Кубота, К., Имачи, Х., Ямагути, Т., Харада, Х., и Охаши, А. (2010). Обнаружение одиночных копий генов с помощью двухпроходной флуоресценции с амплификацией тирамидного сигнала in situ гибридизацией (двухпроходный TSA-FISH) с одиночными олигонуклеотидными зондами. Microbes Environ. 25, 15–21. DOI: 10.1264 / jsme2.ME09180

    CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Кинде, И., Ву, Дж., Пападопулос, Н., Кинзлер, К. В., и Фогельштейн, Б. (2011). Обнаружение и количественная оценка редких мутаций с массовым параллельным секвенированием. Proc. Natl. Акад. Sci. США 108, 9530–9535. DOI: 10.1073 / pnas.1105422108

    Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Кристенсен, Д. М., Валлер, А. С., Ямада, Т., Борк, П., Мушегян, А. Р., Кунин, Э. В. (2013). Кластеры ортологичных генов и гены-сигнатуры таксонов для вирусов прокариот. J. Bacteriol. 195, 941–950. DOI: 10.1128 / jb.01801-12

    Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Лабри, С.J., Frois-Moniz, K., Osburne, M. S., Kelly, L., Roggensack, S. E., Sullivan, M. B., et al. (2013). Геномы морских цианоподовирусов обнаруживают множественное происхождение разнообразия. Environ. Microbiol. 15, 1356–1376. DOI: 10.1111 / 1462-2920.12053

    Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Линделл Д., Джаффе Дж. Д., Коулман М. Л., Футчик М. Э., Аксманн И. М., Ректор Т. и др. (2007). Полногеномная динамика экспрессии морского вируса и хозяина обнаруживает особенности совместной эволюции. Природа 449, 83–86. DOI: 10,1038 / п.

    .Выделение

    и физиоморфологическая характеристика Escherichia coli. O157: H7-инфицированные бактериофаги, полученные из мясного скота.

    Бактериофаги, выделенные из среды мясного скота и специально нацеленные на Escherichia coli O157: H7, были исследованы на их физиологические и морфологические характеристики. Степень бактериального лизиса и диапазон выделенных бактериофагов-хозяев определяли в отношении 55 изолятов E. coli O157: H7. Морфологию фагов изучали под просвечивающим электронным микроскопом.Также были определены параметры роста фага, в частности скорость адсорбции, период роста, латентный период и размер всплеска. Стабильность выделенных фагов проверяли при кислом и щелочном pH, при высоких температурах и при хранении в холодильнике. Всего было выделено 7 фагов, которые показали литическую активность против 50 из 55 изолятов E. coli O157: H7. По морфологии фаги были отнесены к семейству Myoviridae или Siphoviridae. Фаги имели период подъема от 19 до 40 минут, короткий латентный период от 12 до 30 минут и большой размер всплеска (89–631 вириона на инфицированную клетку), что указывает на высокую литическую активность.Фаги оставались стабильными в течение 24 часов при широком диапазоне pH (1–11) и температур (40–60 ° C) и в течение 90 дней при хранении в холодильнике. Характеристика бактериофагов с разнообразным диапазоном хозяев: E. coli, O157: H7, может помочь в разработке эффективных стратегий биологической борьбы с этим патогеном в пищевой промышленности.

    1. Введение

    Escherichia coli O157: H7 - важный патоген пищевого происхождения, который обитает в рубце крупного рогатого скота и других пищевых животных, таких как овцы и козы [1–5].Кроме того, олени, лошади, собаки и птицы также могут временно являться носителями этого патогена [4, 6–8]. Прямой или косвенный контакт с животными или навозом животных, являющихся носителями E. coli O157: H7, может опосредовать его перенос в воду и пищевые продукты, что может привести к инфицированию человека при употреблении. В типичный год в Соединенных Штатах (США) E. coli O157: H7 вызывает около 63000 болезней пищевого происхождения, 2100 госпитализаций и 20 смертей, что оборачивается экономическим бременем в 271 миллион долларов [9, 10].На поздних стадиях патогенной инфекции геморрагический колит может перерасти в гемолитико-уремический синдром. Тяжелые осложнения характеризуются почечной недостаточностью, гемолитической анемией и тромбоцитопенией, которые могут привести к летальному исходу [11–13]. Некоторые продукты питания высокого риска, связанные с этими заболеваниями, включают говядину и мясные продукты, свежие продукты, непастеризованный яблочный сок и молочные продукты [13–28].

    Уменьшение количества E. coli O157: H7 на этапе до сбора урожая и обработки может сыграть значительную роль в предотвращении проникновения этого патогена в пищевую цепь.Различные подходы, такие как диета и терапия пробиотиками, вакцинация и антибиотики, против E. coli O157: H7 были оценены для контроля его распространенности у сельскохозяйственных животных [3, 10, 29]. Однако повторное заселение ранее инфицированных животных одними и теми же или разными штаммами E. coli O157: H7 ограничивает эффективность этих стратегий [3, 30]. Точно так же на уровне обработки различные меры контроля, такие как органические кислоты, хлор или другие противомикробные промывки, использовались для борьбы с E.coli O157: H7 в пищевых продуктах [31–34]. Однако эти меры остаются недостаточными, о чем свидетельствуют продолжающиеся вспышки болезней пищевого происхождения и отзывы продуктов питания, связанные с этим патогеном. Поэтому важно разработать эффективные альтернативы для борьбы с E. coli O157: H7 в пищевой и животноводческой промышленности.

    Целевое использование бактериофагов против E. coli O157: H7 могло бы уменьшить эту проблему. Бактериофаги - это широко распространенные в природе вирусы, которые поражают определенные бактерии и убивают их.Они признаны комменсальными микроорганизмами желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) и были выделены из различных источников [35, 36]. Почти столетие назад д'Эрелль [37] продемонстрировал эффективность бактериофагов против патогенов человека. Однако в последнее время, в связи с появлением устойчивых к антибиотикам микроорганизмов, давно утраченная фаговая терапия вновь обрела интерес для использования против патогенов пищевого происхождения. В условиях in vitro вирулентные бактериофаги продемонстрировали способность к селективной элиминации E.coli O157: H7 [38, 39]. Кроме того, исследования на овцах показали, что колонизацию кишечника E. coli O157: H7 можно предотвратить пероральным введением фагов, инфицирующих O157: H7 [39]. Эффективность бактериофагов против E. coli O157: H7 также была зарегистрирована в различных пищевых продуктах, таких как дыня, шпинат, салат, помидоры, брокколи и говяжий фарш [40–42]. В исследовании O’Flynn et al. [43] коктейль из E. coli O157: H7-специфических бактериофагов полностью снизил количество патогенов на поверхности говяжьих стейков.Кроме того, исследования показали, что фаги могут эффективно уничтожать E. coli O157: H7 в биопленках на различных поверхностях пищевой промышленности, таких как нержавеющая сталь и полиэтилен высокой плотности [42, 44]. Несмотря на то, что исследования продемонстрировали потенциал технологий на основе фагов для борьбы с E. coli O157: H7, очень мало известно о морфологии, физиологии и характеристиках конкретных фагов. В то же время выбор эффективных бактериофагов для применения в пищевой и животноводческой промышленности также требует понимания их выживаемости в различных стрессовых условиях.Настоящее исследование было направлено на выделение E. coli O157: H7-специфических бактериофагов из мясного скота и определение их физиоморфологических характеристик, включая выживаемость при различных pH, высоких температурах и условиях хранения в холодильнике.

    2. Материалы и методы
    2.1. Бактериальные культуры

    Выделение бактериофагов проводили с использованием штамма-хозяина, E. coli O157: H7 ATCC 43895 (таблица 1). Диапазон хозяев выделенных фагов определяли с использованием 55 E.coli O157: H7 (таблица 1). Два из этих изолятов были клиническими штаммами (ATCC 43895, ATCC 43888), а остальные были изолятами дикого типа (WT), извлеченными из нашей коллекции лабораторных культур, первоначально выделенными из фекалий крупного рогатого скота или из окружающей среды фермы крупного рогатого скота [45]. Перед экспериментом ночную культуру каждого изолята E. coli O157: H7 из готовили в триптическом соевом бульоне (TSB; Bacto ™, BD, Sparks, MD) и инкубировали статически при 37 ° C в течение 18 часов.


    Фаг Адсорбция
    %
    Размер взрыва
    БОЕ / мл
    Латентный период
    мин
    ∼74 55–65 40
    SUB ω 12 ∼8 55–65 30
    9 SPO6 23.5 ∼23 75–85 40
    AR π 12 ∼37 55–65 30
    90 068 +++

    Штаммы P-1 P-2 P-3 P-4 P-5 P-6 P-7

    ATCC 43895 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
    ATCC 43888 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
    O157: H7 RF1 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
    O157: H7 RF2 +++ +++ ++ + +++ +++ +++ +++
    O157: H7 RF3 +++ +++ +++ +++ +++ 9 0073 +++ +++
    O157: H7 RF4 +++ +++ +++ +++ +++ - ++ +
    O157: H7 RF5 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
    O157: H7 RF6 - - - - - - -
    O157: H7 RF7 - - - - - - -
    O157: H7 RF8 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
    O157 : H7 RF9 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
    O157: H7 RF10 +++ +++ +++ +++ +++ +++
    O157: H7 RF11 +++ + ++ +++ +++ +++ +++ +++
    O157: H7 RF12 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
    O157: H7 RF13 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
    O157: H7 RF14 +++ +++ +++ +++ +++ ++ + +++
    O157: H7 RF15 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
    O157: H7 SF1 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
    O157: H7 SF2 +++ +++ +++ +++ + ++ +++ +++
    O157: H7 SF4 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
    O157: H7 SF5 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
    O157: H7 SF7 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
    O157: H7 SF8 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
    O157: H7 SF10 +++ + ++ +++ +++ +++ +++ +++
    O157: H7 SF12 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
    O157: H7 SF14 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
    O157: H7 SF15 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
    O157: H7 SW3 - - - - - - -
    O157: H7 TW3 - - - - - - -
    O157: H7 TE1 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
    O157: H7 TE2 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
    O157: H7 TF1 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
    O157: H7 TF2 +++ +++ +++ +++ ++ + +++ +++
    O157: H7 TF3 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
    O157: H7 TF4 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
    O157: H7 TF6 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
    O157: H7 TF7 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
    O157: H7 TF8 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
    O157: H7 TF9 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
    O157: H7 TF10 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
    O157: H7 TF11 + ++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
    O157: H7 TF12 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
    O157: H7 TF13 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
    O157: H7 TF14 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
    O157: H7 RF15 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
    O157: H7 XW5 +++ + ++ +++ +++ +++ +++ +++
    O157: H7 JF4 +++ +++ - - +++ - +++
    O157: H7 LF4 +++ +++ +++ +++ +++ + ++ +++
    O157: H7 KF10 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
    O157: H7 JEQ1 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
    O157: H7 JF6 +++ +++ ++ + +++ +++ +++ +++
    O157: H7 KF7 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
    O157: H7 LF5 +++ +++ +++ +++ +++ + ++ +++
    O157: H7 EF2 - - - - - - -

    на По степени прозрачности бактериального газона пятна были разделены на три категории: прозрачные (+++), мутные (++) или без реакции (-).
    2.2. Выделение бактериофагов

    В течение двух лет образцы воды () и бычьих фекалий () были собраны в течение летних месяцев от мясного скота в Оклахоме и использованы для выделения бактериофагов, специфичных для E. coli O157: H7 [45]. Образцы воды (10 мл) и фекалий (10 г) были обогащены 25 мл бульона NZ-амин казаминокислых дрожжей двойной концентрации хлорида натрия и сульфата магния (NZCYM; RPI Corp, IL) в течение 18 ч при 37 ° C вместе с 10 мл. мл бактериальной культуры хозяина ( E.coli O157: H7 ATCC 43895). После инкубации 2 мл суспензии центрифугировали при 12000 об / мин в течение 10 минут для удаления клеточного дебриса и фекального материала. Супернатант фильтровали с использованием шприцевого фильтра 0,45 µ (EMD Millipore Millex ™, Carrigtwohill, Ирландия) и фильтрат высевали на агар NZCYM (Fisher Scientific, NJ) методом двухслойного агара, как описано Sambrook et al. [46]. Присутствие фага подтверждали образованием бляшек на чашке с агаром, и фаг дополнительно концентрировали методом, описанным Chandra et al.[47]. Вкратце, ночную культуру (100 мкл л) E. coli O157: H7 суспендировали в расплавленном (0,75%) агаре NZCYM и выливали на чашку с агаром NZCYM, которой давали затвердеть в течение 2–5 минут. Затем планшет наносили штрихами фага в виде горизонтальных и вертикальных линий, используя стерильную платиновую петлю, и инкубировали при 37 ° C в течение 18–20 часов. После инкубации 5 мл буфера SM (10 мМ Трис-HCl, pH 7,5; 100 мМ NaCl; 10 мМ MgSO 4 ; Fisher Scientific, NJ) выливали на чашки с агаром для элюирования любых бляшек вдоль линий.Затем с агара, содержащего бляшки, соскребали стерильную платиновую петлю, чтобы высвободить фаги, и элюцию центрифугировали при 12000 об / мин в течение 15 минут. Полученный супернатант фильтровали с использованием шприцевого фильтра 0,22 µ , к которому добавляли 0,1% хлороформ (Fisher Scientific, Нью-Джерси), чтобы получить рабочий раствор фага, который хранили при 4 ° C до дальнейшего использования. Размер бляшек (мм) отдельных фагов определяли с помощью анализа бляшек [48] и путем измерения их диаметра с помощью штангенциркуля Vernier (Fisherbrand ™ Traceable ™ Digital Calipers, NJ).

    Перед экспериментом определяли титры фагов (таблица 2) в виде бляшкообразующих единиц (БОЕ) мл -1 , серийно разбавляя рабочий раствор фага в фосфатно-солевом буфере (PBS; pH 7,4; хлорид натрия, Fisher Scientific, Нью-Джерси; хлорид калия, одноосновный фосфат натрия и двухосновный фосфат натрия, Sigma-Aldrich, Миссури), а также путем проведения анализа налета [48].


    Фаги Титр (БОЕ, мл −1 ) Размер налета (мм)

    P-1
    П-2
    П-3
    П-4
    .

    Смотрите также

    © 2020 nya-shka.ru Дорогие читатели уважайте наш труд, не воруйте контент. Ведь мы стараемся для вас!