• Выделение нуклеиновых кислот


    Топ-5 современных методик выделения нуклеиновых кислот

    Впервые нуклеиновые кислоты пытались выделить в середине XIX века, когда ещё практически ничего не было известно об этих молекулах. Однако с момента открытия структуры и свойств ДНК технологии её выделения непрерывно модифицируются и совершенствуются. В данной статье рассматриваются самые распространенные и прогрессивные методики, используемые для экстракции нуклеиновых кислот.

    Выделение фенол-хлороформом

    Рис.1. Схема протокола выделения фенол-хлороформным методом.

    Первое упоминание об использовании этого метода встречается в статье 1967 года 1, и с тех пор эта технология является одним из самых распространённых способов выделения нуклеиновых кислот.

    Суть методики заключается в смешивании клеточного лизата с фенолом, хлороформом и изоамиловым спиртом в пропорции 25:24:1 и последующем перемешивании и центрифугировании смеси. После проведения этих манипуляций получается раствор с двумя фазами: водной и органической, причем все липиды и жиры находятся в органической (нижней) фазе, белки — на границе фаз, а нуклеиновые кислоты — в водной (верхней) фазе 2 (Рис.1). Для повышения чистоты экстракта эти действия повторяют несколько раз. Если раствор будет иметь низкий pH, то ДНК перейдёт в органическую фазу, а РНК останется в водной фазе, что позволяет выделять РНК отдельно от ДНК.

    Данный метод используется повсеместно, поскольку он не требует дополнительного сложного оборудования и имеет невысокую стоимость. Однако нуклеиновые кислоты, полученные таким образом, обладают невысоким качеством и зачастую требуют дополнительной очистки. Также эта технология имеет существенно меньший выход нуклеиновых кислот в сравнении с другими методиками.

    Помимо качества экстракта, этот метод обладает ещё несколькими недостатками: он требует сложных манипуляций, которые могут привести к контаминации и потере образца, а сам процесс трудно автоматизировать. Также весь протокол занимает достаточно много времени 3

    Выделение на спин-колонках

     

    Рис.2. Схема протокола выделения на спин-колонках.

    Технология выделения на спин-колонках — это усовершенствованный метод экстракции на частичках силики, предложенный американскими учёными в 1979 году 4. Они продемонстрировали, что в щелочных условиях и при повышенных концентрациях соли ДНК связывается с силикатами, и это позволяет отделить все остальные компоненты клетки от частиц силики со связанной ДНК. Спин-колонки сконструированы таким образом, что при нанесении клеточного лизата на колонку и последующем центрифугировании ДНК остаётся на колонке, а всё лишнее проходит сквозь неё (Рис.2). Затем ДНК промывают несколько раз и элюируют в пробирку для сбора образца.

    Преимущества такого метода заключаются в повышенной чистоте и хорошем качестве выделенных нуклеиновых кислот, высокой воспроизводимости и простоте по сравнению с выделением фенол-хлороформом. Однако также большое количество манипуляций может привести к контаминации, а выделение коротких фрагментов ДНК на спин-колонках может быть затруднено 5.

    Экстракция на спин-колонках может занять от 20 минут в зависимости от биоматериала и сложности его лизиса. 

    На рынке этот метод представлен большим разнообразием наборов от таких производителей, как Qiagen, Analytik Jena, NEB, ThermoFisher и других. Стоимость одного выделения здесь значительно выше, чем у предыдущего метода, поскольку на каждую реакцию необходима своя колонка, несколько пробирок для сбора фильтрата и элюата и, конечно, реагенты.

    Выделение на магнитных частицах

     

    Рис.3. Схема протокола выделения на магнитных частицах.

    Спустя 20 лет после появления метода выделения на спин-колонках начинает набирать популярность более быстрый способ выделения на магнитных частицах 6. Технология этого способа выделения основана на связывании нуклеиновой кислоты с веществом, покрывающим магнитные частицы (целлюлоза, сефадекс, сефакрил, dT-олигонуклеотиды, специфичные олигонуклеотиды и др.). К клеточному лизату добавляют такие магнитные частицы и перемешивают для связывания ДНК с ними. После этого пробирку ставят в магнитный штатив или подносят к магниту, фиксируя таким образом твердую фазу. После отбора супернатанта нуклеиновые кислоты на частицах промывают и элюируют 7 (Рис.3).

    Этот метод имеет те же преимущества, что и выделение на спин-колонках, но для экстракции на магнитных частицах не требуется сложное лабораторное оборудование (например, центрифуга). Более того, процесс выделения на магнитных частицах легко автоматизировать, и многие автоматические станции выделения основаны именно на этой методике 3. Однако здесь также присутствует риск контаминации и потерь образца.

    Данный протокол выделения займет немного меньше времени благодаря отсутствию этапов центрифугирования, но количество манипуляций будет примерно таким же. Также стоимость одной реакции обычно выше, чем при выделении на колонках, а панели наборов предоставляют Qiagen, Analytik Jena,  ThermoFisher и другие.

    Умное выделение (Smart Extraction)

    Рис.4. Схема протокола умного выделения. Протокол основан на принципе работы наборов для выделения компании Analytik Jena.

    Методики выделения нуклеиновых кислот не перестают совершенствоваться: в 2005 году специалисты из компании Analytik Jena доказали, что для связывания нуклеиновых кислот с неорганической твёрдой фазой можно использовать не только хаотропные соли, но и смесь из хаотропных и нехаотропных солей с низкой ионной силой, эту технологию они назвали Dual Chemistry 8.

    Позднее они усовершенствовали технологию Dual Chemistry при помощи немагнитных частиц с «умной» поверхностью 9. Для выделения используются специальные наконечники с этими частицами, которые надеваются на дозатор. При заборе клеточного лизата в наконечник нуклеиновая кислота из раствора связывается с частицами, затем следуют этапы промывки и элюции, в результате чего получается очищенная нуклеиновая кислота высокого качества (Рис.4).

    Эта технология значительно ускоряет процесс выделения, а благодаря особенностям «умной» поверхности выход и качество нуклеиновых кислот значительно превосходит все предыдущие методы. Данный способ экстракции очень легко автоматизировать, ведь носики со связывающими частицами подходят как для обычных лабораторных дозаторов, так и для различных автоматических станций выделения нуклеиновых кислот.

    Ферментативное температурно-зависимое выделение

     

    Рис.5. Схема протокола ферментативного температурно-зависимого выделения. Протокол основан на принципе работы наборов для выделения компании MicroGEM. * — несмотря на невысокую степень очистки, образец отлично подходит для дальнейшего использования в ПЦР, секвенировании и STR.

    Все вышеперечисленные методики имеют общую лимитирующую стадию — этап лизиса. Во всех технологиях используется SDS и протеиназа K для разрушения клеточных стенок и высвобождения нуклеиновых кислот. SDS является ингибитором ПЦР, именно поэтому необходимы множественные стадии промывки, которые повышают риск контаминации и приводят к потерям образца. Также более сложные для лизиса образцы могут требовать дополнительную долгую и трудозатратную пробоподготовку.

    Специалисты из новозеландской компании MicroGEM ликвидировали проблемы, связанные с длительным и сложным лизисом и использованием вредных химикатов, благодаря применению очень эффективной термофильной протеиназы EA1 вместе с мезофильными гидролазами 10.

    Процесс ферментативного температурно-зависимого выделения начинается со смешивания буфера и ферментов с образцом. При последующей инкубации при комнатной температуре гидролазы деградируют клеточные стенки. После этого пробирку нагревают до 75°C, что активирует работу протеиназы EA1, которая разрушает все белки и высвобождает нуклеиновые кислоты. Последующее нагревание до 95°C дезактивирует EA1, и после этого образец готов для дальнейшего исследования (Рис.5). Для особо загрязненных образцов вроде почвы или растений можно добавить этап очистки на колонке для избавления от ингибиторов.

    Данная технология оптимальна для работы с малым количеством биоматериала, поскольку нет потерь нуклеиновых кислот. Также эту методику легко автоматизировать, она самая быстрая среди всех упомянутых способов выделения (от 7 минут) и включает меньше всего манипуляций. Стоимость одной реакции невысока, поскольку кроме реагентов не требуется никаких специальных расходных материалов.

    Обзор подготовлен при поддержке компании SkyGen — официального дистрибьютора продукции Analytik Jena, MicroGEM, Qiagen, NEB и других производителей.

    Источники

    1. Rae, P. M. M., Barnett, T. R. & Babbitt, D. G. Factors influencing the yield of satellite DNA in extractions from Drosophila virilis and Drosophila melanogaster adults and embryos. BBA Sect. Nucleic Acids Protein Synth. (1976) doi:10.1016/0005-2787(76)90157-X.

    2. Patrinos, G. P., Danielson, P. B. & Ansorge, W. J. Molecular Diagnostics: Past, Present, and Future. in Molecular Diagnostics: Third Edition (2016). doi:10.1016/B978-0-12-802971-8.00001-8.

    3. Ali, N., Rampazzo, R. D. C. P., Costa, A. Di. T. & Krieger, M. A. Current Nucleic Acid Extraction Methods and Their Implications to Point-of-Care Diagnostics. BioMed Research International (2017) doi:10.1155/2017/9306564.

    4. Vogelstein, B. & Gillespie, D. Preparative and analytical purification of DNA from agarose. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. (1979) doi:10.1073/pnas.76.2.615.

    5. Green, M. R. & Sambrook, J. Molecular Cloning, 3-Volume Set : A Laboratory Manual. Cold Spring Harbour Laboratory Press (2012).

    6. Trevor Hawkins. DNA PURIFICATION AND ISOLATION USNG MAGNETIC PARTICLES. United States Pat. (#5,705,628 ) 9, 2989–2997 (1998).

    7. Tan, S. C. & Yiap, B. C. DNA, RNA, and protein extraction: The past and the present. Journal of Biomedicine and Biotechnology (2009) doi:10.1155/2009/574398.

    8. http://www.dual-chemistry.com/

    9. https://www.analytik-jena.com/products/kits-assays-reagents/extraction-technology/

    10. https://microgembio.com/pdqex/

    #13 Очистка нуклеиновых кислот: многообразие методов и подходов

    25.06.2020

    Одной из базовых методик практически в любом эксперименте является выделение нуклеиновых кислот. Причем, зачастую, от качества выделенной нуклеиновой кислоты зависит успех всего дальнейшего эксперимента, поэтому к подбору реагентов для экстракции НК стоит подходить ответственно. Мы решили рассмотреть различные технологии выделения НК, их особенности, преимущества и недостатки, чтобы вы смогли подобрать идеальное решение для ваших индивидуальных задач.

    Методы выделения НК, применяемые в современных коммерческих наборах

    Впервые нуклеиновые кислоты были выделены швейцарским физиологом Фридрихом Мишером в 1869 году. Он изучал химический состав животных клеток и заметил, что из ядер лейкоцитов можно выделить некое неизвестное ранее вещество – «нуклеин». Позже, благодаря кислотным свойствам этого вещества, его стали называть «нуклеиновая кислота». Технология выделения НК Фридриха Мишера была очень трудоемкой, она включала много сложных этапов и занимала несколько дней.

    Спустя 100 лет после открытия нуклеиновых кислот исследователи по всему миру стали широко использовать технологию фенол-хлороформного выделения.

    Рис.1 Схема протокола выделения НК фенол-хлороформным методом.

    В данной методике образец лизируют, а затем лизат смешивают с фенолом, хлороформом и изоамиловым спиртом. После центрифугирования эта смесь разделяется на две фазы, причем в нижней органической фазе остаются все жиры и липиды, в интерфазе – белки, а в верхней водной фазе – нуклеиновые кислоты (Рис.1). Для повышения чистоты экстракта эти действия повторяют несколько раз и таким образом получают выделенные и очищенные НК.

    Метод фенол-хлороформной экстракции широко распространен благодаря своей дешевизне, но он всё же уступает другим технологиям по качеству и выходу НК, а также требует сложных и длительных манипуляций, которые могут привести к контаминации и потере образца, а сам процесс трудно автоматизировать.

    В 1979 году американские учёные продемонстрировали, что при определённых условиях НК способны связываться с силикатами, что позволяет отделить все остальные компоненты клетки от частиц силики, со связанными НК. Их открытие легло в основу двух технологий: выделения НК на спин-колонках и на магнитных частицах.

    Спин-колонки сконструированы таким образом, что при нанесении лизированного образца на колонку и последующем центрифугировании НК остаются на кремниевой мембране колонки, а все остальные компоненты образца проходят сквозь неё (Рис.2). Затем НК можно промыть и элюировать в пробирку для сбора образца.

    Рис.2 Схема протокола выделения НК на спин-колонках.

    Основные преимущества метода - чистота и высокое качество выделенных нуклеиновых кислот, высокая воспроизводимость и простота по сравнению с выделением фенол-хлороформом. Однако также большое количество манипуляций может привести к контаминации, а выделение коротких фрагментов ДНК на спин-колонках может быть затруднено.

    Спустя 20 лет после появления метода выделения на спин-колонках становится популярным более быстрый способ выделения на магнитных частицах. Технология этого способа экстракции основана на связывании нуклеиновой кислоты с веществом, покрывающим магнитные частицы.

    Рис.3 Схема протокола выделения НК на магнитных частицах.

    К лизированному образцу добавляют такие магнитные частицы и перемешивают для связывания НК с ними. После этого пробирку ставят в магнитный штатив или подносят к магниту, фиксируя таким образом твердую фазу. После отбора супернатанта нуклеиновые кислоты на частицах промывают и элюируют (Рис.3).

    Этот метод так же хорош, как и выделение на спин-колонках, но для экстракции на магнитных частицах не нужно сложное оборудование (например, центрифуга), а сам процесс легко автоматизировать, и многие автоматические станции выделения основаны именно на этой технологии.

    Вы можете найти наборы для выделения НК от SkyGen у следующих брендов:

    Наборы для выделения НК от компании New England Biolabs

    Американская компания New England Biolabs представляет линейку наборов Monarch® для выделения и очистки нуклеиновых кислот:

    T3010 L/S

    Набор Monarch® для выделения геномной ДНК
    (150/50 реакций)

    T1030 L/S

    Набор Monarch® для очистки ДНК-продуктов ПЦР и ферментативных реакций
    (250/50 реакций)

    T1020 L/S

    Набор Monarch® для выделения ДНК из агарозного геля
    (250/50 реакций)

    T1010 L/S

    Набор Monarch® для выделения плазмидной ДНК, 20 мкг
    (150/50 реакций)

    T2030, T2040, T2050 L/S

    Набор Monarch® для очистки РНК-продуктов ферментативных реакций
    (100/10 реакций)

    Все наборы основаны на технологии выделения НК на спин-колонках и позволяют получить экстракт очень высокого качества.

    Основываясь на собственном опыте и отзывах наших клиентов, мы рекомендуем использовать набор Monarch® (Т3010 L/S) для выделения геномной ДНК для дальнейшего секвенирования на платформах Oxford Nanopore Technology (MinION, GridION, PromethION).

    Вы можете узнать подробнее об особенностях и преимуществах этого набора в нашем обзоре.

    В каталог  Продукция на сайте NEB  Линейка Monarch    

    Видеобиблиотека  Брошюра

    Продукция для выделения НК от компании Analytik Jena

    Все наборы для выделения НК от немецкой компании Analytik Jena основаны на технологии двойной химии (Dual Chemistry Technology, DC-Technology), которая была разработана и запатентована в 2005 году. Она основана на использовании буферов с содержанием хаотропных и нехаотропных солей с низкой ионной силой в определенной комбинации. Это позволяет НК прочнее связываться с твердой фазой, а также сокращать время выделения благодаря более эффективному лизису.

    innuPREP и blackPREP - линейки наборов для выделения НК на спин-колонках из широкого спектра образцов. В линейке blackPREP представлены колонки чёрного цвета, других отличий от innuPREP у этой линейки нет.

       

    В данных линейках представлены наборы для выделения НК из следующих типов биологических образцов:

    • Кровь
    • Ткани, клетки и мазки
    • Бактерии
    • Криминалистические образцы
    • Вирусные НК из биологических жидкостей, тканей и мазков
    • Растения
    • Фекалии
    • Образцы пищи
    • Клещи
    • Фрагменты хвостов грызунов
    • Мазки буккального эпителия
    • Парафиновые срезы = FFPE
    • Гели и смеси

    Для использования наборов innuPREP и blackPREP потребуется следующее оборудование:

    • Дозаторы
    • Вортекс
    • Термошейкер
    • Центрифуга до 10.000 g (~ 12.000 rpm)

    innuSPEED – линейка наборов для выделения НК на спин-колонках из сложнолизируемых образцов. Данная панель адаптирована под этап механического лизиса на гомогенизаторе (можно заменить на вортекс) в специальных пробирках с шариками. Такие пробирки со стеклянными, керамическими или стальными шариками различного размера уже входят в состав наборов, а также их можно приобрести отдельно и комбинировать с любыми другими наборами.


    Наборы innuSPEED позволяют выделять НК из следующих образцов:

    • Бактерии и грибы
    • Растения
    • Ткани
    • Почва

    Для использования наборов innuSPEED потребуется следующее оборудование:

    • Дозаторы 
    • Вортекс 
    • Гомогенизатор SpeedMill (или любой другой, а также можно заменить на вортекс) 
    • Термошейкер 
    • Центрифуга до 10.000 g (~ 12.000 rpm)

    Наряду с DC-Technology компания Analytik Jena разработала технологию SmartExtraction, которая основана на связывании НК с частицами с особой смарт-поверхностью. Это обеспечивает более эффективное связывание высокомолекулярной ДНК, а также уменьшение стресс-факторов за счет отсутствия этапов вортексирования и центрифугирования. Методика основана на выделении НК при помощи систем дозирования жидкостей. Для экстракции используют специальные наконечники с «умными» частицами, которые надеваются на дозатор. При заборе лизированного образца в наконечник нуклеиновая кислота из раствора связывается с частицами, затем следуют этапы промывки и элюции, в результате чего получается очищенная нуклеиновая кислота высокого качества (Рис.4).

    Рис.4 Схема протокола выделения НК при помощи технологии SmartExtraction.

    Так выглядит схема автоматической экстракции, но в портфолио Analytik Jena также присутствуют два набора для ручного выделения ДНК на магнитных частицах с такой «умной» поверхностью из крови и клеток и тканей.

    Каталог реагентов

    При больших потоках образцов и для упрощения этапа экстракции НК можно использовать автоматические решения от Analytik Jena:

    InnuPure C16 touch

    CyBio SELMA

    CyBio Felix

    Предназначена для эффективной и воспроизводимой экстракции ДНК/РНК при помощи технологий выделения на магнитных частицах, а также SmartExtraction. Полуавтоматическая компактная дозирующая система для раскапки 96- и 384-луночных планшетов.

    Можно адаптировать для выделения НК.

    Автоматическая дозирующая станция с гибкой модульной системой, которую легко трансформировать под индивидуальные задачи.

    Продукция для выделения НК от компании QIAGEN

    В нашем портфолио есть широкий спектр наборов для выделения НК от компании QIAGEN, причем особенность этих реагентов заключается в том, что можно подобрать набор под очень узкоспециализированную задачу в зависимости от типа выделяемой НК и биологического материала.

    Такие реагенты лучше всего подойдут пользователям с нестандартными задачами, например в каталоге QIAGEN есть наборы для выделения сцДНК, митохондриальной и космидной ДНК или микроРНК.

    Также есть наборы для элюции образца в очень малых объемах, для работы с архивными и сложнолизируемыми образцами, для выделения на спин-колонках, магнитных частицах или ферментативной экстракции в одной пробирке.

    Подробнее изучить наборы QIAGEN вы можете в каталоге на официальном сайте.

    В портфолио QIAGEN есть и автоматические станции для выделения НК:


           

    QIAcube Connect

    QIAcube HT

    QIAsymphony

    • Аналог ручного колоночного выделения
    • До 12 образцов одновременно
    • Совместим более чем с 80 наборами для выделения НК
    • Технология сорбции на кремниевой мембране
    • 24-96 образцов одновременно
    • Совместим с 7 наборами для выделения НК
    • Технология сорбции на магнитных частицах
    • 24 - 96 образцов одновременно
    • Совместим с модулем для ПЦР
    • Есть РУ

    Продукция для выделения НК от компании MicroGEM

    Новозеландская компания MicroGEM представляет уникальную технологию ферментативного температурно-зависимого выделения НК в одной пробирке. Она начинается со смешивания буфера и особых ферментов с биологическим образцом. При последующей инкубации при 75°C протеиназы разрушают клетки и высвобождают нуклеиновые кислоты. Дальнейшее нагревание до 95°C дезактивирует протеиназы, и после этого образец готов для дальнейшего исследования (Рис.5).

    Рис.5 Схема протокола ферментативного температурно-зависимого выделения НК.

    Эта технология очень простая и быстрая, и здесь отсутствуют потери НК, что позволяет работать даже с небольшим количеством образца. Однако, от этой технологии стоит отказаться, если для вас важна чистота выделяемой НК.

    Узнать больше о данной технологии вы можете в нашем обзоре.

    Наша команда научной поддержки может помочь с подбором идеального набора для ваших задач, для этого необходимо заполнить форму:

    Подобрать набор


    Методы выделения нуклеиновых кислот — Студопедия

    При изучении химического состава и строения нуклеиновых кислот перед исследователем всегда стоит задача выделения их из биологических объектов. Нуклеиновые кислоты являются составной частью сложных белков – нуклеопротеинов, содержащихся во всех клетках животных, бактерий, вирусов, растений. Нуклеиновые кислоты обладают сильно выраженными кислыми свойствами (обусловлены остатками ортофосфорной кислоты в их составе) и при физиологических значениях рН несут отрицательный заряд. Этим объясняется одно из важных свойств нуклеиновых кислот – способность к взаимодействию по типу ионной связи с основными белками (гистонами), ионами металлов (преимущественно с Mg2+), а также с полиаминами. Поэтому для выделения нуклеиновых кислот из комплексов с белками необходимо, прежде всего, разрушить эти сильные и многочисленные электростатические связи между положительно заряженными молекулами белков и отрицательно заряженными молекулами нуклеиновых кислот. Для этого измельченный путем гомогенизации биоматериал обрабатывают крепкими солевыми растворами (10% раствор хлорида натрия) с последующим осаждением нуклеиновых кислот этанолом. В настоящее время для выделения нуклеиновых кислот в нативном состоянии пользуются более «мягким» фенольным методом, основанным на обработке нейтрального забуференного раствора нуклеопротеинов фенолом. Обычно эту процедуру проводят в присутствии веществ, вызывающих денатурацию белкового компонента, например додецилсульфата (ДСН) или салицилата натрия, затем смесь подвергают центрифугированию. При этом денатурированный белок попадает в фенольную фазу, а нуклеиновые кислоты остаются в водной среде, из которой их осаждают на холоде добавлением 2–3 объемов этанола. Этим методом удается получить очищенные препараты нуклеиновых кислот.


    В настоящее время применяют ряд усовершенствованных методов разделения нуклеиновых кислот на фракции из суммарного препарата, полученного описанным методом. Это, прежде всего, хроматография на геле фосфата кальция, ионообменная хроматография (в качестве адсорбентов используют ДЭАЭ-целлюлозу, ДЭАЭ-сефадекс и др.), ультрацентрифугирование в градиенте плотности сахарозы, хроматография по сродству на белковых носителях, фильтрация через гели агарозы и сефарозы, гель-электрофорез и др.

    После получения нуклеиновых кислот в чистом виде их подвергают гидролизу для изучения химического состава. Для этих целей используют ферментативные методы (экзо- и эндонуклеазы), а также чисто химические методы гидролиза, в частности нагревание нуклеиновых кислот с хлорной кислотой.

    Выделение и очистка нуклеиновых кислот

    Все наборы для выделения нуклеиновых кислот от Analytik Jena можно разделить на три группы по типу твердой фазы, используемой для связывания. Часть из них содержит спин-колонки с силикой, другие – магнитные частицы. Наконец, наборы третьей группы включают в себя частицы с так называемой Smart поверхностью и предназначены для выделения высокомолекулярных НК по технологии SmartExtraction.

    Эта технология является первой в мире методикой с возможностью автоматизации процесса выделения ДНК/РНК при помощи простых систем дозирования жидкостей. Таким образом, Analytik Jena учитывает тенденцию к максимальной автоматизации всех процессов в современных лабораториях.

    В основе всех наборов для выделения НК Analytik Jena лежит уникальная разработка компании - запатентованная технология DC-Technology® (от англ. "Dual Chemistry"). Для эффективного связывания ДНК/РНК с минеральной твердой фазой в них включают не высокосолевые буферы, а буферы, содержащие хаотропные и нехаотропные соли в определенной комбинации.

    Преимущества DC-Technology® для вашей лаборатории:

    • экономия времени - быстрый лизис и меньшее количество шагов в протоколе,
    • высокие выход и качество выделяемых НК даже для сложных образцов,
    • в качестве исходного материала можно использовать широкий спектр биологических образцов, 
    • возможно выделение из образца большого объема, 
    • простая автоматизация (для SmartExtraction).

    Брошюра ↓  

    Простой метод выделения нуклеиновых кислот в полевых условиях

    Острой проблемой современного здравоохранения является диагностика инфекционных заболеваний в малообеспеченных регионах и поселениях, удаленных от хорошо оснащенных лабораторных центров. Решением проблемы могут стать диагностические тесты у постели больного. Анализ нуклеиновых кислот (nucleic acid testing, NAT) считается одним из самых надежных методов выявления патогенов в биологических образцах. В основе работы тест-систем у постели больного, основанных на NAT, лежат три аспекта: 1) подготовка образца, то есть выделение и очистка нуклеиновых кислот; 2) амплификация; 3) регистрация и интерпретация полученного сигнала. При этом система должна удовлетворять ряду требований, среди которых высокая скорость работы, простота в транспортировке и хранении, низкая стоимость и т. д.

    В настоящее время разработчики занимаются упрощением второго и третьего шагов, то есть амплификации и регистрации сигнала, и приспосабливают приборы для работы с сырыми биологическими образцами. Однако такой подход ведет к удорожанию и снижению чувствительности системы. Группа корейских ученых пошла по другому пути и описала в Scientific Reports способ упрощения и удешевления первого шага — пробоподготовки.

    В основе метода лежат обычный шприц и фильтр-насадка к нему. Авторы модифицировали коммерческие тефлоновые шприцевые фильтры с размером пор 1 мкм: на тефлоновую поверхность нанесли амин-функционализированный диатомит (amine-functionalized diatomaceous earth, ADE) и гомобифункциональные имидоэфиры (homobifunctional imidoesters, HIs). Образец набирается в шприц и пропускается через фильтр. HIs взаимодействуют с аминогруппами ADE и формируют связи с высоким положительным зарядом. Эти связи притягивают отрицательно заряженные клетки патогенов из образца. Клетки накапливаются на фильтре. Затем фильтр обрабатывается лизирующим раствором для высвобождения нуклеиновых кислот. HIs обладают перекрестносшивающей активностью: через аминогруппы они сшивают ADE с нуклеиновыми кислотами при определенных значениях pH. При смене pH связи разрушаются. Поэтому после лизирующего агента фильтр промывают буфером с pH 8 (нуклеиновые кислоты связываются), а затем обрабатывают буфером с pH 10, и чистые нуклеиновые кислоты переходят в раствор.

    Метод проверили на суспензиях патогенов Brucella ovis, Salmonella enterica и Aspergillus fumigatus в фосфатном буфере, а также в человеческой моче и в сыворотке крови. Адсорбцию микробов на фильтре проверяли микроскопически, с окрашиванием флуоресцентным красителем DAPI. Выход и качество РНК и ДНК определяли с помощью количественной ПЦР в реальном времени и традиционной ПЦР, соответственно.

    Фильтры захватывали 98,3% клеток патогенов при минимальной рабочей концентрации клеток 1 КОЕ/мл. Для бактериальных клеток выход нуклеиновых кислот был сопоставим с выходом для коммерческих наборов для выделения ДНК и РНК. Для работы с Aspergillus fumigatus метод не подошел из-за прочной клеточной стенки грибка. Для функционализации аминных групп в диатомите использовали 3-аминопропилдиэтоксисилан. Наиболее подходящим HI оказался диметил суберимидат.

    Новая система пробоподготовки не требует центрифуги, термостата или другого сложного оборудования, чистых комнат и даже электричества, нужны только человеческие руки. Подход, основанный на шприцевых фильтрах, дает возможность работать с большими (до 50 мл) объемами образца. Все компоненты системы дешевы и стабильны, что позволяет легко транспортировать ее к месту анализа. Авторы отмечают, что связывание с ADE стабилизирует РНК: она не деградирует в течение как минимум 20 минут — ровно столько занимает полный цикл пробоподготовки. Полученный раствор нуклеиновых кислот можно замораживать и хранить до анализа. Метод также можно адаптировать для 96-луночных фильтровальных планшетов.

    Авторы считают, что разработанный ими подход имеет большие перспективы для применения в диагностике у постели больного.

    Нуклеиновые кислоты метод выделения - Справочник химика 21

        Методы выделения нуклеиновых кислот. При изучении химического состава и строения нуклеиновых кислот перед исследователем всегда стоит задача выделения их из биологических объектов. В главе 2 было указано, что нуклеиновые кислоты являются составной частью сложных белков — нуклеопротеинов, содержащихся во всех клетках животных, бактерий, вирусов, растений. Нуклеиновые кислоты обладают сильно выраженными кислыми свойствами (обусловлены остатками ортофосфорной кислоты в их составе) и при физиологических значениях pH несут отрицательный заряд. Этим объясняется одно из важных свойств нуклеиновых кислот—способность к взаимодействию по типу ионной связи с основными белками (гистонами), ионами металлов (преимущественно с М "), а также с полиаминами (спермин, спермидин) и путресцином. Поэтому для вьщеления нуклеиновых кислот из комплексов с белками необходимо прежде всего разрушить эти сильные и многочисленные электростатические связи между положительно заряженными молекулами белков и отрицательно заряженными молекулами нуклеиновых кислот. Для этого измельченный путем [c.96]
        МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ [c.439]

        Распределительную хроматографию на бумаге используют в качестве быстрого стандартного метода анализа нуклеиновых кислот. Ионообменная хроматография на колонках (см. стр. 446) нашла применение прежде всего для препаративного выделения мононуклеотидов и высокомолекулярных продуктов гидролиза дезоксирибонуклеиновых кислот. Опыты по фракционированию на крахмале [26, 31] или на адсорбенте [55, 56] не привлекли достаточного внимания. [c.442]

        Второй раздел практикума ставит своей целью познакомить студентов с особенностями выделения, фракционирования, идентификации и количественного определения различных природных азотсодержащих оединений. белков, пептидов, аминокислот, нуклеиновых кислот, нуклеотидов и пр Предлагаемые экспериментальные работы включают аиболее широко используемые в лабораторной практике современные методы разделения и анализа этих соединений различные виды электрофореза, хроматографии, спектрофотометрии, колориметрии и др. Работа проводится как на готовых коммерческих препаратах высоко- и низкомолекулярных азотсодержащих соединений, так и на препаратах, выделяемых студентами из различных тканей лабораторных животных. [c.79]

        В последние 15 лет были разработаны различные хроматографические методы, позволяющие фракционировать высокомолекулярные нуклеиновые кислоты для этой же цели применяют электрофорез. Хроматографией на бумаге и другими распределительными методами, а также ионообменной хроматографией удалось выделить продукты гидролиза нуклеиновых кислот. Определяя концентрации выделенных оснований, нуклеозидов, моно- и олигонуклеотидов, в настоящее время проводят количественный анализ с очень небольшим количеством гидролизата. [c.437]

        Количественное определение нуклеиновых кислот. Принцип метода основан на выделении рибонуклеиновых (РНК) и дезоксирибонуклеиновых (ДНК) кислот и на дальнейшем их анализе прямыми и косвенными методами. К прямым методам относятся такие, которые включают гидролиз нуклеиновых кислот с последующим выделением из гидролизатов пуринов и пиримидинов и определение их хроматографическим методом. Хроматография позволяет производить точный микроанализ нуклеиновых кислот. Исследование пуринов и пиримидинов проводят в ультрафиолетовом свете, наблюдая флуоресценцию пятен на хроматограммах или в экстрактах, полученных из соответствующих участков хроматограмм. Кроме хроматографического метода, применяют также способ электрофореза на бумаге. [c.60]


        Среди лабораторных методов очистки, фракционирования и анализа структуры белков, нуклеиновых кислот и их компонентов совокупность различных хроматографических методов занимает центральное место. Ни один другой метод не может сравниться с хроматографией по широте количественного диапазона. Начиная от препаративных колонок объемом в несколько литров, на которых можно вести фракционирование граммовых количеств препарата на первых этапах выделения фермента, через разделение близких по своей природе компонентов очищенной смеси веществ, количество которых измеряется миллиграммами или долями миллиграмма, этот диапазон простирается до микроанализа аминокислотного состава белка, когда на колонку вносят сотые доли микрограмма исходного гидролизата. Вне конкуренции остается и разнообразие физико-химических параметров, по которым может осуществляться хроматографическое фракционирование молекулярные размеры, вторичная или третичная структура биополимеров, растворимость, адсорбционные характеристики молекул, степень их гидрофоб-ности, электрический заряд и, наконец, биологическое сродство к другим молекулам. [c.3]

        Помимо ряда вирусных нуклеиновых кислот, большинство выделенных полирибонуклеотидов, бесспорно, представляют собой сложные смеси, содержащие полимеры с различной длиной цепи, нуклеотидной последовательностью и составом оснований (присутствие или отсутствие минорных оснований). Существует ряд приемов для частичного фракционирования, однако, пока не разработаны удовлетворительные методы характеристики, трудно определить степень чистоты или гомогенности рибонуклеиновых кислот. В основу оценки чистоты транспортных РНК, этих сравнительно низкомолекулярных полирибонуклеотидов, может быть положена их ферментативная реакция с аминокислотами (через аминоациладенилаты), что, конечно, позволяет оценить и их биохимическую однородность. [c.365]

        Современное развитие химических и биологических наук истребовало более глубокого проникновения в существо изучаемых процессов, детального анализа химического состава разнообразных смесей и биологических объектов. Кроме того, для химического и биотехнологического ироизводства, в том числе для промышленности лекарственных средств, характерны постоянное возрастание требований к чистоте выпускаемых продуктов, ужесточение методов контроля, тенденция к использованию количественных критериев ири оценке качества. Поэтому помимо оценки интегральных характеристик, присущих объекту исследования в целом, часто требуется детальное изучение содержания отдельных компонентов, определяющих состояние биологических систем либо качество химических продуктов. Рещение этих задач, как правило, невозможно без применения достаточно эффективных методов разделения сложных смесей. Среди таких методов доминирует хроматография. Бурно развиваясь в последние десятилетия, этот метод открыл возможности разделения смесей, содержащих десятки и сотни компонентов, их качественного и количественного анализа, препаративного выделения индивидуальных веществ. Принципы хроматографии весьма универсальны, благодаря чему она оказалась пригодной для изучения объектов самой различной природы — от нефти и газов атмосферы до белков, нуклеиновых кислот и да

    Более быстрое выделение нуклеиновых кислот из тканей FFPE | Thermo Fisher Scientific

    Applied Biosystems улучшила протокол для набора для выделения общей нуклеиновой кислоты Ambion® RecoverAll ™ для тканей FFPE, что привело к значительному сокращению времени обработки. Никакие реагенты или составы не изменились - только объемы дозирования, время инкубации и температуры. Конечным результатом является сокращенный протокол с эквивалентным выходом нуклеиновых кислот и производительностью по сравнению с исходным протоколом.

    Ткани FFPE обильны, но сложны

    Многие стандартные методы консервации образцов биологических тканей используют формалин или параформалин для поддержания структуры ткани и предотвращения гниения.Однако такой тип консервирования затрудняет проведение молекулярного анализа образцов, поскольку нуклеиновые кислоты захватываются и модифицируются значительными сшивками белок-белок и белок-нуклеиновая кислота. Исследователи из Applied Biosystems узнали, что сам процесс фиксации не обязательно приводит к фрагментации нуклеиновых кислот [1]. Вместо этого процесс заделки, который требует высоких температур и вакуума для проникновения парафина в ткань, ускоряет химические реакции, которые впоследствии изменяют РНК и ДНК.Эти модификации со временем приводят к фрагментации.

    Более быстрый рабочий процесс изоляции

    В Набор для выделения общей нуклеиновой кислоты Ambion RecoverAll для тканей FFPE эффективно изолирует все нуклеиновые кислоты, включая миРНК, из тканей, фиксированных формалином или параформалином и залитых парафином (FFPE).За одну реакцию можно обработать до четырех срезов по 20 мкм или до 35 мг несекционированных образцов керна. Недавние усовершенствования протокола набора сокращают рабочее время и упрощают рабочий процесс, так что выделение нуклеиновых кислот из ткани FFPE проще и на 67% быстрее. Хотя степень фрагментации РНК и ДНК, которая уже произошла в тканях FFPE, не может быть отменена, нуклеиновые кислоты, экстрагированные из тканей FFPE, все еще функциональны и могут быть проанализированы с помощью ПЦР. Условия переваривания модифицированной протеазой, используемые в улучшенном протоколе RecoverAll Kit, предназначены для ускорения высвобождения максимального количества нуклеиновой кислоты всего за 30 минут для РНК или за ночь для ДНК (рис. 1).
    Рис. 1. Ускоренный рабочий процесс набора для выделения общей нуклеиновой кислоты RecoverAll ™.

    Более быстрое восстановление без ущерба для результатов

    Улучшенный рабочий процесс RecoverAll продолжает предоставлять нуклеиновые кислоты с высокой функциональностью в последующих приложениях.Исследование, проведенное на тканях груди, легких и толстой кишки, показало, что, хотя выход нуклеиновых кислот, основанный на показаниях оптической плотности при 260 нм, варьировался между блоками тканей FFPE из-за возраста, размера ядра и типа ткани, общие данные выхода с новым RecoverAll Набор был эквивалентен оригинальному набору (данные не показаны). Коэффициент вариации общих данных об урожайности исходного протокола RecoverAll Kit по сравнению с улучшенным протоколом остается неизменным. Кроме того, РНК, выделенная с помощью нового протокола, лучше работает при анализе ПЦР в реальном времени (рис. 2).Мы предполагаем, что более короткое время инкубации при более высоких температурах приводит к очистке более чистой РНК, которая лучше работает в последующих реакциях.


    Рис. 2. Новый, более быстрый протокол набора для изоляции RecoverAll ™ дает РНК с лучшими характеристиками ПЦР в реальном времени, чем исходный протокол. RT-PCR в реальном времени была проведена для 4 мишеней (GAPDH, GUSB, miR-16 и miR-155) с РНК, выделенной из ткани FFPE молочной железы, легких и толстой кишки, с использованием нового протокола RecoverAll Isolation Kit или исходного протокола.Во всех случаях РНК, выделенная с помощью нового протокола, показывает эквивалентную или более низкую C Значения T (лучшая производительность), чем РНК, выделенная по исходному протоколу.

    RecoverAll Kit превосходит конкурентов

    Набор для выделения общей нуклеиновой кислоты Ambion RecoverAll для тканей FFPE сравнивали с наборами FFPE конкурентов.РНК экстрагировали из FFPE-блоков груди и легких с использованием набора Ambion RecoverAll и наборов от конкурентов Q, R и S. Восстановление РНК из обоих типов образцов с помощью набора RecoverAll, измеренное по оптической плотности при 260 нм, было установлено на 100%. . Восстановление комплектов конкурентов варьировалось от 33-83% по сравнению с комплектом RecoverAll. Результаты ПЦР в реальном времени подтвердили эти данные: эквивалентные или более высокие количества miRNA, обнаруженные в образцах, извлеченных с помощью набора RecoverAll, по сравнению с 3 конкурентами.

    Кроме того, набор Ambion RecoverAll Kit выполняет ровно 17 шагов для завершения выделения РНК из образцов ткани FFPE с общим временем восстановления РНК 1–1,5 часа.

    Выделение ДНК с помощью набора RecoverAll

    Новый протокол Ambion RecoverAll Kit содержит инструкции по восстановлению РНК и ДНК из ткани, обработанной FFPE.Конкурент Q предлагает отдельные наборы для восстановления РНК или ДНК, в то время как конкуренты R и S не предлагают наборы для восстановления ДНК.

    Научные участники

    Эмили Зерингер, Тим Барта, Рик Конрад • Applied Biosystems

    .

    % PDF-1.5 % 365 0 объект > endobj xref 365 40 0000000016 00000 н. 0000002165 00000 н. 0000002322 00000 п. 0000002839 00000 н. 0000003260 00000 н. 0000003697 00000 н. 0000003734 00000 н. 0000003905 00000 н. 0000004019 00000 н. 0000004392 00000 п. 0000004875 00000 н. 0000005218 00000 н. 0000005668 00000 н. 0000006554 00000 н. 0000007362 00000 н. 0000008132 00000 н. 0000008733 00000 н. 0000009515 00000 н. 0000010108 00000 п. 0000010896 00000 п. 0000011611 00000 п. 0000014260 00000 п. 0000014335 00000 п. 0000014432 00000 п. 0000014581 00000 п. 0000016826 00000 п. 0000018760 00000 п. 0000018873 00000 п. 0000018948 00000 п. 0000019261 00000 п. 0000019316 00000 п. 0000019432 00000 п. 0000019556 00000 п. 0000019631 00000 п. 0000019944 00000 п. 0000020019 00000 п. 0000020332 00000 п. 0000028203 00000 п. 0000075467 00000 п. 0000001096 00000 н. трейлер ] / Назад 979697 >> startxref 0 %% EOF 404 0 объект > поток hb``b`yh Ā

    .

    Нуклеиновая кислота

    Нуклеотиды

    Возможно, первые биомолекулы, поддерживающие жизнь, нуклеиновые кислоты хранят и передают клеточную информацию и передают энергию всем живым организмам. Дезоксирибонуклеиновая кислота, более известная как ДНК, хранит наследственную информацию в небольших сегментах, называемых генами, внутри длинных полимерных цепей. Рибонуклеиновая кислота (РНК) доставляет информацию о генах из ДНК для создания функциональных продуктов. Другие молекулы РНК представляют собой активные трехмерные продукты, которые обеспечивают ферментативные или регуляторные функции внутри клеток.Огромное количество доказательств предполагает, что РНК была исходной молекулой жизни из-за способности РНК как хранить наследственную информацию, так и обеспечивать функциональную активность в качестве ферментов.

    Каждый компонент структуры нуклеиновой кислоты играет важную роль в способности ДНК и РНК хранить и передавать информацию в течение жизни клетки и доставлять копию потомству. Нуклеиновые кислоты - это полимеры отдельных нуклеотидных мономеров. Каждый нуклеотид состоит из трех частей: 5-углеродного сахара, фосфатной группы и азотистого основания.В природе встречаются только два 5-углеродных сахара: рибоза и дезоксирибоза. Дезоксирибоза представляет собой производное рибозы, в котором атом кислорода отсутствует у одного углерода; углерод был дезоксигенирован. ДНК содержит нуклеотиды дезоксирибозы, а РНК - нуклеотиды рибозы. ДНК более стабильна, чем РНК, из-за уменьшения количества активных атомов кислорода.

    5-углеродный сахар (рибоза или дезоксирибоза) образует центральную молекулу в нуклеотиде. По соглашению, атомы углерода в сахаре нумеруются от исходного положения карбонила в цепи с использованием числа и символа штриха (‘).Например, азотистое основание присоединено к позиции углерода 1 ’(произносится как« один простой »), которая изначально была карбонильной группой сахара. Фосфатная группа присоединена к 5’-углеродному положению, атому углерода, который находится за пределами сахарного кольца.

    Каждый нуклеотид включает одно азотистое основание, присоединенное к 1 ’атому углерода. Азотистое основание - это органическая молекула, содержащая атомы углерода и азота. Название азотистое основание означает, что несколько атомов азота действуют как основания в растворе.В нуклеиновых кислотах азотистые основания содержат либо одно кольцо, либо два конденсированных кольца. Пурины представляют собой азотистые основания с двойным кольцом, встречающиеся в природе, и включают аденин и гуанин. Тимин, цитозин и урацил - это пиримидины, азотистые основания с одним кольцом, встречающиеся в природе.

    Сахар и азотистое основание, присутствующие в нуклеотиде, определяют нуклеотид и его функциональную роль. Поскольку сахар и фосфат являются схожими структурными компонентами всех нуклеотидов, ученые часто используют сокращенную запись для идентификации нуклеотида, называя только уникальное присутствующее азотистое основание.Например, «аденин» может относиться только к азотистому основанию или к нуклеотиду, содержащему аденин, в зависимости от контекста. Точно так же нуклеотид часто называют «основанием», сокращенно для обозначения присутствия азотистого основания в структуре нуклеотида.

    Подобно моносахаридам, нуклеотиды и короткие нуклеотидные цепи выполняют важные клеточные функции. Аденозинтрифосфат (АТФ) является важным энергоносителем в живых организмах. АТФ состоит из аденина, сахара рибозы и трех последовательно связанных фосфатных групп.Соединение трех анионных фосфатных групп в ряд заставляет несколько отрицательных ионов находиться в непосредственной близости, что является неблагоприятным состоянием. Реакции, которые удаляют крайнюю фосфатную группу (образуя аденозиндифосфат или ADP), высвобождают энергию для использования в других химических реакциях. Динуклеотиды, такие как NAD +, NADP + и FAD, действуют как коферменты, доставляя энергию, передавая электроны от одной реакции к другой.

    Строительные нуклеотиды

    В этом упражнении вы выберете компоненты нуклеотида и разместите их в правильном положении для образования ковалентных связей.

    Структура и функция нуклеиновой кислоты

    ДНК-полимера хранят наследственную информацию для каждого живого организма. Уникальная структура полимера ДНК обеспечивает шаблон для идентификации и доставки информации внутри каждого гена и для точной репликации ДНК во время деления клетки. Полимеры РНК выполняют множество клеточных функций, включая доставку сообщений ДНК для синтеза белков и действия в качестве ферментов или регуляторных молекул во многих клеточных процессах.Хотя полимеры РНК менее сложны, чем структура белка, они часто образуют трехмерные структуры, специфичные для их функции. Взаимодействия между азотистыми основаниями в полимерах ДНК и РНК составляют основу структуры, функции и точной репликации нуклеиновых кислот.

    Нуклеиновые кислоты образуются в результате повторяющихся реакций синтеза дегидратации между нуклеотидами. Во время дегидратационного синтеза образуется фосфодиэфирная связь между фосфатной группой одного нуклеотида и сахаром другого нуклеотида.Согласно химическому соглашению о нумерации атомов углерода в нуклеотидах, фосфатная группа является 5 ’конца нуклеотида, потому что она связана с 5’ атомом углерода сахара. Фосфодиэфирные связи образуются между 5 ’концом одного нуклеотида и 3’ гидроксильной группой другого нуклеотида, образуя полимер с одним открытым 5 ’концом и одним открытым 3’ концом.

    Внутри клеток синтез нуклеиновой кислоты происходит путем образования новых фосфодиэфирных связей на 3 ’конце растущего полимера. Хотя все полимеры биомолекул синтезируются только в одном направлении, природа полимеров нуклеиновых кислот от 5 ’к 3’ имеет особое значение для многих клеточных процессов, включая репликацию ДНК, синтез белка и восстановление повреждений ДНК.Понимание того, как образуются полимеры ДНК, жизненно важно для анализа репликации ДНК и экспрессии генов в живых клетках.

    Фосфодиэфирные связи образуются между фосфатными и сахарными сегментами каждого нуклеотида, оставляя азотистые основания свободными для взаимодействия друг с другом. Поскольку некоторые азотистые основания помимо азота содержат кислород, водородные связи легко образуются между отдельными основаниями по определенной схеме. Полимеры ДНК образуют парные нити, в которых азотистые основания действуют как застежка-молния, связывая две нити вместе.

    Структурно азотистые основания в полимере имеют тенденцию образовывать пары антипараллельно, что означает, что две спаренные цепи нуклеиновой кислоты расположены в противоположных направлениях. Если смотреть на одну нить от 5 ’конца к 3’ концу, другая нить будет располагаться от 3 ’до 5’, чтобы образовать максимальное количество водородных связей. Пары нуклеотидов на противоположных цепях, которые образуют водородные связи, часто называют парами оснований. В ДНК полимеры почти всегда встречаются в длинных парных антипараллельных цепях, образующих знаменитую двойную спираль.

    Все нуклеотиды ДНК содержат дезоксирибозу сахара и одно из четырех различных азотистых оснований: аденин, гуанин, цитозин или тимин. Имея всего четыре различных нуклеотида, кажется невозможным, чтобы ДНК могла кодировать достаточно информации для производства миллионов различных белков и функциональных молекул РНК, которые дают такое огромное разнообразие живых организмов. Однако порядок и выбор нуклеотидов допускают почти бесконечное количество возможных последовательностей. Представьте себе создание 5-нуклеотидной цепи, используя только 4 нуклеотида ДНК.При этих параметрах существует до 1024 возможных полимеров. Представьте себе, сколько различных полимерных последовательностей возможно для самой короткой хромосомы человека, длина которой составляет пятьдесят миллионов нуклеотидов!

    нуклеотидов РНК определяются сахарной рибозой и содержат несколько иной набор азотистых оснований: аденин, гуанин, цитозин и урацил. Молекулы РНК не содержат тимин. В отличие от ДНК, РНК обычно присутствует в одноцепочечной форме. Многие одноцепочечные молекулы РНК изгибаются и скручиваются в трехмерную структуру, которая включает в себя водородные связи между нуклеотидами в одной цепи.Как и в случае со структурой белка, трехмерная структура молекулы РНК определяет уникальную функцию в клетках, включая ферментный катализ.

    Присоединение Нуклеотидов

    В этом упражнении вы выберете нуклеотид и положение для образования фосфодиэфирной связи.

    Нуклеиновые кислоты: ДНК и РНК

    Используйте это упражнение, чтобы сравнить и сопоставить структурные и функциональные атрибуты, обычно обнаруживаемые в ДНК и РНК.

    .

    нуклеиновых кислот | Определение, функции, структура и типы

    Нуклеиновая кислота , химическое соединение природного происхождения, способное расщепляться с образованием фосфорной кислоты, сахаров и смеси органических оснований (пуринов и пиримидинов). Нуклеиновые кислоты являются основными молекулами клетки, несущими информацию, и, управляя процессом синтеза белка, они определяют унаследованные характеристики каждого живого существа. Двумя основными классами нуклеиновых кислот являются дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) и рибонуклеиновая кислота (РНК).ДНК - это главный план жизни и генетический материал всех свободноживущих организмов и большинства вирусов. РНК - это генетический материал некоторых вирусов, но она также обнаружена во всех живых клетках, где играет важную роль в определенных процессах, таких как создание белков.

    полинуклеотидная цепь дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК)

    Часть полинуклеотидной цепи дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК). На вставке показаны соответствующие пентозный сахар и пиримидиновое основание в рибонуклеиновой кислоте (РНК).

    Encyclopædia Britannica, Inc.

    Популярные вопросы

    Что такое нуклеиновые кислоты?

    Нуклеиновые кислоты - это природные химические соединения, которые служат в клетках в качестве основных молекул, несущих информацию. Они играют особенно важную роль в управлении синтезом белка. Двумя основными классами нуклеиновых кислот являются дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) и рибонуклеиновая кислота (РНК).

    Какова основная структура нуклеиновой кислоты?

    Нуклеиновые кислоты - это длинные цепочечные молекулы, состоящие из ряда почти идентичных строительных блоков, называемых нуклеотидами.Каждый нуклеотид состоит из азотсодержащего ароматического основания, присоединенного к пентозному (пятиуглеродному) сахару, которое, в свою очередь, присоединено к фосфатной группе.

    Какие азотсодержащие основания встречаются в нуклеиновых кислотах?

    Каждая нуклеиновая кислота содержит четыре из пяти возможных азотсодержащих оснований: аденин (A), гуанин (G), цитозин (C), тимин (T) и урацил (U). A и G относятся к пуринам, а C, T и U называются пиримидинами. Все нуклеиновые кислоты содержат основания A, C и G; Однако T находится только в ДНК, а U - в РНК.

    Когда были открыты нуклеиновые кислоты?

    В этой статье рассматривается химия нуклеиновых кислот, описываются структуры и свойства, которые позволяют им служить передатчиками генетической информации. Для обсуждения генетического кода см. Наследственность , а для обсуждения роли нуклеиновых кислот в синтезе белка см. Метаболизм .

    Нуклеотиды: строительные блоки нуклеиновых кислот

    Основная структура

    Нуклеиновые кислоты - это полинуклеотиды, то есть длинные цепочечные молекулы, состоящие из ряда почти идентичных строительных блоков, называемых нуклеотидами.Каждый нуклеотид состоит из азотсодержащего ароматического основания, присоединенного к пентозному (пятиуглеродному) сахару, которое, в свою очередь, присоединено к фосфатной группе. Каждая нуклеиновая кислота содержит четыре из пяти возможных азотсодержащих оснований: аденин (A), гуанин (G), цитозин (C), тимин (T) и урацил (U). A и G классифицируются как пурины, а C, T и U вместе называются пиримидинами. Все нуклеиновые кислоты содержат основания A, C и G; Однако T находится только в ДНК, а U - в РНК. Сахар-пентоза в ДНК (2'-дезоксирибоза) отличается от сахара в РНК (рибоза) отсутствием гидроксильной группы (OH) на 2'-атоме углерода сахарного кольца.Без присоединенной фосфатной группы сахар, присоединенный к одному из оснований, известен как нуклеозид. Фосфатная группа соединяет последовательные сахарные остатки, соединяя 5'-гидроксильную группу одного сахара с 3'-гидроксильной группой следующего сахара в цепи. Эти нуклеозидные связи называются фосфодиэфирными связями и одинаковы в РНК и ДНК.

    Нуклеотиды синтезируются из легкодоступных предшественников в клетке. Рибозофосфатная часть пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов синтезируется из глюкозы через пентозофосфатный путь.Сначала синтезируется пиримидиновое кольцо из шести атомов, которое затем присоединяется к рибозофосфату. Два кольца в пуринах синтезируются, будучи присоединенными к фосфату рибозы во время сборки нуклеозидов аденина или гуанина. В обоих случаях конечный продукт представляет собой нуклеотид, несущий фосфат, связанный с 5'-атомом углерода на сахаре. Наконец, специальный фермент, называемый киназой, добавляет две фосфатные группы, используя аденозинтрифосфат (АТФ) в качестве донора фосфата, с образованием рибонуклеозидтрифосфата, непосредственного предшественника РНК.В случае ДНК 2'-гидроксильная группа удаляется из рибонуклеозиддифосфата с образованием дезоксирибонуклеозиддифосфата. Дополнительная фосфатная группа из АТФ затем добавляется другой киназой с образованием дезоксирибонуклеозидтрифосфата, непосредственного предшественника ДНК.

    Оформите подписку Britannica Premium и получите доступ к эксклюзивному контенту. Подпишитесь сейчас

    Во время нормального клеточного метаболизма РНК постоянно производится и разрушается. Остатки пурина и пиримидина повторно используются несколькими путями восстановления для создания большего количества генетического материала.Пурин спасается в форме соответствующего нуклеотида, тогда как пиримидин спасается как нуклеозид.

    .Разделение нуклеиновых кислот

    - Техническая платформа

    Разделение нуклеиновых кислот становится все более важным методом в молекулярной биологии. За последние несколько десятилетий были разработаны различные методы. Однако традиционные методы выделения нуклеиновых кислот требуют много времени и работы, основанные на нескольких этапах экстракции и центрифугирования. И они часто ограничиваются небольшими выходами, низкой чистотой или низкой концентрацией продукта. Поэтому, когда речь идет о некоторых ценных образцах со сверхнизкими концентрациями и объемом, эти методы могут столкнуться с риском отсутствия сбора продукта или чрезмерного разбавления продукта.

    В течение последних нескольких лет была разработана методика выделения нуклеиновых кислот на основе частиц, которая позволяет проводить быструю и эффективную очистку нуклеиновых кислот без каких-либо ограничений в отношении концентраций и объемов образцов. Эти частицы универсально построены из определенных материалов или характеризуются тонкими модификациями поверхности, которые позволяют им извлекать полную нуклеиновую кислоту или определенные РНК и ДНК непосредственно из сырых образцов.

    Среди всех частиц, которые были разработаны для разделения, магнитные частицы выделяются своим уникальным магнитным свойством.Магнитные частицы приобретают магнитный момент, когда их помещают в магнитное поле, и поэтому они могут перемещаться. Таким образом, эти частицы можно легко удалить с помощью приложения магнитного поля, что является быстрым, простым и эффективным способом отделения частиц от смесей и гораздо менее строгим методом, чем традиционные методы.

    Рис. 1. Схематическое изображение выделения нуклеиновых кислот с помощью магнитных шариков.

    Таблица 1. Фильтры и гранулы при выделении нуклеиновой кислоты


    Фильтры (твердая фаза) Гранулы
    Матрица Стационарная, нерегулярная плотность Подвижная дисперсия, обычная плотность
    Воздействие нуклеиновой кислоты Быстро, во время центрифуги Тщательное перемешивание в растворе
    Метод выделения Центрифуга Магнитная сила
    Элюция Требуется большой объем для эффективного элюирования Эффективное элюирование в малых тома

    Типы экстракции нуклеиновых кислот на основе частиц

    Суммарная ДНК и РНК могут быть разделены частицами посредством их взаимодействия с поверхностью этих частиц.Благодаря уникальному свойству диоксида кремния улавливать нуклеиновые кислоты посредством связывания их водорода с недериватизированной гидрофильной матрицей, частицы диоксида кремния и частицы, покрытые диоксидом кремния, широко используются для экстракции нуклеиновых кислот в целом.

    С целью удаления РНК из ДНК, РНК разрушается перед этапом разделения ДНК. И наоборот, РНК может быть отделена, если ДНК расщепляется ДНКазой.

    Посмотреть наш продукт:
    Absolute Mag ™ Plain Silica Magnetic Particles

    • Селективный захват РНК и ДНК

    Из-за изменяемой поверхности частицы множественные лиганды, такие как последовательности ДНК или РНК и ДНК-связывающие белки, могут быть прикреплены к частицам для избирательного захвата интересующих нуклеиновых кислот.

    • Очистка индивидуальных олигонуклеотидов (опосредованная взаимодействием стрептавидин-биотин)

    Две комплементарные цепи ДНК / РНК могут связываться вместе посредством гибридизации. Таким образом, прикрепляя одноцепочечную ДНК / РНК с определенной последовательностью к частицам, их комплементарные олигонуклеотиды могут быть выделены путем применения центрифугирования или магнитного поля.

    Связывание стрептавидин-биотин является наиболее сильным из известных нековалентных взаимодействий между белком и лигандом, и оно использовалось для использования во многих процессах биосепарации.За счет мечения биотином 3'-конца ДНК / РНК интересующие комплементарные олигонуклеотиды могут быть легко захвачены частицами, модифицированными стрептавидином.

    Просмотр наших продуктов:
    Absolute Mag ™ Магнитные частицы авидина
    Absolute Mag ™ Стрептавидин Магнитные частицы

    Полиаденилирование происходит в процессе производства зрелой матричной РНК (мРНК). Таким образом, зрелая мРНК характеризуется поли (А) хвостом, который состоит из множества аденозинмонофосфатов. Чтобы выделить мРНК из смесей, олигонуклеотидные последовательности dT ковалентно связываются с поверхностью частицы или косвенно биотинилированными олигонуклеотидами и взаимодействием покрытых стрептавидином частиц.Эти олигонуклеотидные последовательности dT могут привлекать мРНК посредством гибридизации со стабильными поли (A) 3 -концами мРНК. Таким образом, захваченная мРНК может быть выделена центрифугированием или силой магнитного поля.

    Рис. 2. Схематическое изображение выделения мРНК с использованием магнитных частиц Absolute Mag ™ Oligo (dT)

    Посмотреть наш продукт:
    Absolute Mag ™ Oligo (dT) Магнитные частицы

    Дополнительный материал

    • Традиционный нуклеиновый выделение кислоты
    • Выделение нуклеиновых кислот в жидкой фазе

    Традиционное выделение нуклеиновых кислот в жидкой фазе является одним из наиболее часто используемых методов экстракции нуклеиновых кислот.Этот метод обычно основан на сложной серии стадий осаждения и промывки. (Рис. 3) Однако в этой изоляции используются высокотоксичные химические вещества, такие как фенол и хлороформ. Кроме того, из-за трудоемкого и длительного процесса образцы подвергаются деградации, потере и перекрестному загрязнению в течение всего процесса.

    Рис. 3 Схематическое изображение традиционного выделения нуклеиновых кислот в жидкой фазе.

    • Выделение нуклеиновой кислоты в твердой фазе

    Выделение нуклеиновой кислоты в твердой фазе было разработано как альтернативный вариант.Колонки на основе диоксида кремния и колонки с анионообменной смолой - две наиболее часто используемые колонки, используемые при выделении нуклеиновых кислот. Колонки на основе диоксида кремния улавливают нуклеиновые кислоты через их связывание с водородом с недериватизированной гидрофильной матрицей, а колонки с анионообменной смолой изолируют нуклеиновые кислоты через их связывание с группами DEAE. Однако при выделении нуклеиновой кислоты с помощью колонок по-прежнему существует риск потери образца. Между тем, для целевой элюции необходимо определенное количество буфера, что может привести к чрезмерному разбавлению продукта.

    Пожалуйста, не стесняйтесь обращаться к нам, если вам нужна бесплатная консультация и подробное предложение по вашему проекту. Наши представители по обслуживанию клиентов доступны 24 часа в сутки, с понедельника по воскресенье.

    .

    Смотрите также