• Выделение плазмидной днк


    Тема 5. ВЫДЕЛЕНИЕ ПЛАЗМИДНОЙ И ФАГОВОЙ ДНК


    ⇐ ПредыдущаяСтр 2 из 11Следующая ⇒

     

    Плазмида – внехромосомный самовоспроизводящийся генетический элемент (фактор наследственности) бактерий и некоторых других организмов, в частности дрожжей. Все векторы для клонирования ДНК получены на основе плазмид либо вирусов. Векторы составляют основу как генетической, так и белковой инженерии. Кроме того, рекомбинантную ДНК, т.е. ДНК вектора, объединённую с нужной исследователю ДНК, применяют в клеточной инженерии, инженерной энзимологии, генной терапии и др.

     

    Плазмида представляет собой кольцевую (очень редко – линейную) двухцепочечную молекулу ДНК, способную к автономной репликации в клетке организма-хозяина. Векторная плазмида – переносчик ДНК.

     

    Среди методов выделения плазмидной ДНК наиболее распространены разновидности метода щелочного лизиса клеток бактерий, разработанного Бирнбоймом и Доли в 1979 году (Birnboim, Doly, 1979). Они позволяют легко отделить плазмидную ДНК от высокомолекулярной хромосомной ДНК. Пептидогликан (муреин) клеточной стенки разрушают лизоцимом, а мембрану клетки-хозяина растворяют детергентом SDS в щелочных условиях при значении рН около 12,5. Хромосомная ДНК при этом фрагментируется и денатурирует необратимо. Плазмидная ДНК также денатурирует, но не фрагментируется ввиду её небольшого размера и обе цепи ДНК остаются сцепленными. При понижении рН после добавления раствора ацетата калия с рН 5,0, обе цепи плазмиды ренатурируют друг с другом. Одноцепочечные фрагменты хромосомы из разных клеток ренатурируют (регибридизуются) случайным образом и образуют высокомолекулярный творожистый осадок.

     

    Этот осадок легко отделяется центрифугированием от оставшейся в растворе плазмиды, которую затем осаждают этанолом. Поскольку in vivo ДНК не бывает свободной от белков, то необходима депротеинизация образца.

     

    Репликативная форма фагов, существующая внутри инфицированных клеток бактерий, также представляет собой молекулы двухцепочечной кольцевой ДНК и легко выделяется методом щелочного лизиса клеток.

     

     

    Работа 5.1. Минипрепаративное выделение плазмидной ДНК

    (минипреп)

    Приведённый протокол представляет собой одну из модификаций метода щелочного лизиса клеток бактерий. Это один из лучших методов для получения плазмидной ДНК высокого качества. Его достоинствами являются простота и высокая скорость, сравнимая только с выделением ДНК на микроколонках. Количества ДНК достаточно для нескольких рестрикций. При масштабных проектах используют процедуру максипреп (работа 4.2).

    Плазмида pBR322, препарат ДНК которой предполагается получить, – один из первых векторов молекулярного клонирования (Bolivar et al ., 1977).

    Материалы и оборудование

    Штамм E . coli XL1–Blue (StratageneTM), трансформированный плазмидой pBR322 (см. прил. 1, 4), микроцентрифуга, шейкер.

     

    Растворы

    -Раствор Iдля выделения плазмидной ДНК: 50мМ глюкоза; 100мМ   Tris–HCl, pH 8,0; 10мМ ЭДТА. Хранить при +4°С, перед использованием добавить лизоцим до 5 мг/мл.

    -Раствор IIа.0,2N NaOH; 1% SDS. Готовить свежий раствор перед использованием, допускается лишь непродолжительное хранение при комнатной температуре в плотно закрытой пластиковой посуде.

    -Раствор III.3М ацетат калия, рН 5,0. На 100 мл: 5M ацетат калия – 60 мл; CH3COOH ледяная – 11,5 мл; H2O – 28,5 мл.

    -Смесь фенолхлороформ  (работа 1.1)

    -Смесь хлороформизоамиловый спирт(работа 1.1).

    -Ампициллин.Раствор 100 мг/мл в воде. 

    Методика

    1. Вырастить культуру клеток E.coli с плазмидой pBR322 в 5 мл питательной среды 2YT (тема 1), содержащей 100 мкг/мл антибиотика ампициллина, в течение 16–24 ч на термостатируемой роторной качалке-шейкере при температуре 37°С и скорости 200–300 об/мин.

    2. Осадить клетки из культуральной среды. Для этого поместить 1,5 мл «ночной культуры» E.coli в 1,7 мл микроцентрифужную пробирку и центрифугироватьв течение 2 мин при 10000 об/мин. Удалить супернатант выливанием через край. Повторить осаждение в эту пробирку ещё 2 раза.

    3. Центрифугировать 10 с дополнительно, отобрать остатки культуральной среды микропипеткой.

    4. Ресуспензировать осадок в 200 мкл раствора I с помощью микропипетки или вортекса. Оставить при комнатной температуре на 5 мин б.

    5. Добавить 400 мкл раствора II, сразу же резко встряхнуть, перевернуть 5 раз.Происходит лизис бактерий и щелочная денатурация ДНК. Поместить образцы на лёд (0°С) на 5 мин в.

    6. Добавить 300 мкл холодного раствора III, 5 раз перевернуть пробирку и оставить на льду на 5 минг.

    7. Центрифугировать в течение 5 мин при максимальной скорости центрифуги для осаждения хромосомной ДНК.

    8. Супернатант, содержащий плазмидную ДНК, перенести микропипеткой в новую пробирку, содержащую 500 мкл изопропанола, смешать переворачиванием пробирки, оставить на 10 мин на столе.

    9. Осадить плазмиду центрифугированием в течение 10 мин при максимальной скорости центрифуги, супернатант затем вылить через край, а остатки после короткого центрифугирования отобрать микропипеткой.

    10. Плазмидный осадок растворить в 100 мкл TE-буфера (можно 200 мкл).

    11. Раствор плазмидной ДНК необходимо подвергнуть дальнейшей очистке – провести фенольную депротеинизацию образца. Для этого добавить в пробирку равный объём смеси фенол–хлороформ, хорошо перемешать и разделить фазы центрифугированием (10 мин, 10000 об/мин).

    12. Перенести верхнюю водную фазу в новую пробирку, добавить равный объём смеси хлороформ–изоамиловый спирт (помимо денатурации протеинов она удаляет остатки фенола), хорошо перемешать и разделить органическую и водную фазы центрифугированием в течение 3 мин.

    13. Отобрать верхнюю водную фазу, добавить 1/10 объёма холодного раствора 3М ацетата калия, pH 5,0 и высадить ДНК этанолом. Для этого добавить в пробирку 1 мл холодного (–20°С) этанола и поместить образец на лёд или в морозильник не менее чем на 15 мин. На этой стадии можно прерваться: под спиртом очищенная ДНК, в принципе, может храниться годами. Но все три формы плазмиды, судя по опыту, перейдут в линейную форму.

    14. Осадить плазмидную ДНК центрифугированием (10 мин, 10000 об/мин).

    15. Добавить к осадку 1 мл 70% этанола для промывки осадка ДНК и центрифугировать 3 мин.

    16. Слить супернатант, перевернуть пробирки на фильтр и подсушить осадок на воздухе в течение 0,5 ч. Растворить в 50–100 мкл воды. На электрофорез следует взять 5–10 мкл образца.

    17. Провести при необходимости обработку образца рибонуклеазой для удаления РНК. Следует добавить к полученному препарату плазмиды 1/100 объёма раствора РНКазы А (10 мг/мл в 10 мМ Tris–HCl (рН 7,4), 15 мМ NaCl) и выдержать 0,5–1 ч при 37°С. РНКазу затем можно удалить с помощью фенола, если нужно. На ДНК этот фермент влияния не оказывает. 

    Примечания

    а Раствор II должен быть свежеприготовленным. Хранить его можно лишь ограниченное время, сроком до нескольких недель. Важно, чтобы в процессе хранения CO2 из воздуха не нейтрализовал NaOH. Ёмкость должна быть с плотно завинчивающейся крышкой, лучше пластиковой, поскольку щёлочи растворяют стекло.

    б  Это время необходимо для работы лизоцима, ослабляющего пептидогликановый слой. Если фермент не добавлен (клетки кишечной палочки удовлетворительно лизируются и без лизоцима), можно сразу переходить к следующему пункту.

    в Превышение времени денатурации чревато тем, что плазмида денатурирует необратимо – одно кольцо сдвинется относительно другого так далеко, что достигнет локально устойчивого состояния. Необратимо денатурированные плазмиды вполне годятся для сиквенса, но они не режутся рестриктазами и обладают аномальной подвижностью.

    г Происходит нейтрализация щелочной среды. Хромосомная ДНК регибридизуется случайным образом, образуя большие сети, кольцевая же плазмидная ДНК благополучно ренатурирует «сама на себя». Важно, чтобы нейтрализация была полной, не оставалось областей с вязким раствором. Нужно смешивать раствор вначале мягко, чтобы не фрагментировать геномную ДНК, но после того как она уже ассоциирует (приблизительно через 1 мин) надо встряхнуть посильнее. Растворы I, II, III для достижения нужного результирующего значения pH используются в объёмной пропорции 1:2:1,5.

     

     

    Работа 5.2. Выделение плазмидной ДНК в больших объёмах (максипреп)

     

    Метод предназначен для получения значительных количеств плазмидной ДНК высокого качества. Это бывает необходимо при продолжительной масштабной работе с определёнными векторами, рекомбинантными конструкциями или клонированными генами. Приведённый ниже метод также представляет собой модификацию метода шелочного лизиса бактериальных клеток. В определённом смысле процедура выделения ДНК сводится к пропорциональному увеличению количества исходного материала и объёмов реагирующих растворов.

    В данной работе предполагается получить в значительных количествах ценную векторную ДНК. Фагмида pBluescript II KS+ – это вектор компании StratageneTM , используемый для клонирования, секвенирования и экспрессии. Кроме того, эта фагмида (от слов фаг + плазмида) в отличие от обычных плазмид способна «упаковываться» в фаговые частицы в присутствии в клетке фага-помощника, поскольку она имеет ori фага М13, а фаговые белки для сборки вирионов поставляет хелпер. Вектор pBluescript II характеризуется более высоким числом копий на клетку чем плазмида pBR322 (см. прил. 1, 5).

    Материалы и оборудование

    Центрифуга для больших объёмов, весы, штамм кишечной палочки E.coli XL1–Blue, содержащий фагмиду pBluescript II KS+.

    Растворы

    - Раствор I(работа 4.1).

    - Раствор II(работа 4.1).

    - 10 М ацетат аммония.Растворить770 г в 800 мл воды, довести до 1 л.

    - Ампициллин(работа 4.1).

    Методика

    1. Вырастить ночную культуру бактерий при 37°С в 100–500 мл богатой питательной среды 2YT, содержащей 100 мкг/мл ампициллина в течение          20–24 ч при скорости роторной качалки-шейкера 200–300 об/мин.

    2. Центрифугировать при 4000 об/мин 10–15 мин при 4°С, слить среду.

    3. Центрифугировать при 4000 об/мин в течение 1 мин, отобрать микропипеткой остатки жидкости.

    4. Ресуспензировать осаждённые клетки в 10 (или 5) мл раствора I.

    5. Добавить 1 мл (или 0,5) свежеприготовленного раствора I c лизоцимом. Оставить на столе на 15 мин. (Клетки E . coli лизируются и без лизоцима).

    6. Добавить 20 (или 10) мл раствора II, сразу интенсивно перемешать. Оставить на льду при 0°С на 5 мин.

    7. Добавить 10 (или 5) мл холодного 10М ацетата аммония а (добавлять микропипеткой по каплям), смешать. Оставить при 0°С на 5 мин.

    8. Центрифугировать при 5000 об/мин в течение 10 мин при +4°С.

    9. Супернатант отобрать микропипеткой, разделить на две центрифужные пробирки, добавить к каждой по 12,5 мл изопропанола. Делать это нужно на весах. Оставить на столе на 10 мин для высаживания ДНК.

    10. Центрифугировать при 5000 об/мин, 4°С, 10 мин, отбросить супернатант.

    11. Центрифугировать при комнатной температуре 3 мин, отобрать остатки жидкости. Осадок плазмидной ДНК не подсушивать!

    12. Растворить осадок в каждой микроцентрифужной пробирке в 400 мкл 2M ацетата аммония, объединить в одной 1,7 мл пробирке. Оставить при комнатной температуре на 5 мин (осаждение полисахаридов, белков).

    13. Центрифугировать при комнатной температуре 10 мин.

    14. Супернатант перенести в пробирку с равным объёмом (800 мкл) изопропанолаб. Оставить на столе на 10 мин.

    15. Центрифугировать при комнатной температуре 5 мин.

    16. Сполоснуть осадок 70% этанолом.

    17. Растворить плазмидную ДНК в 0,2–1 мл Н2O. Для электрофореза достаточно взять 5–10 мкл раствора в.

    Примечания

    а  Использование ацетата аммония вместо ацетата калия в качестве раствора III позволяет существенно уменьшить объёмы при центрифугировании. Кроме того, в присутствии ацетата аммония осаждаются полисахариды из раствора, а также белки (см. п.12). Это позволяет исключить из протокола работу с фенолом.

    б Использование изопропанола для высаживания ДНК из раствора позволяет уменьшить объёмы. При масштабных работах важно минимизировать расход реагентов. Обычно используют равный объём изопропанола (минимум 0,6 V, для этанола – 2 V).

    в   Подвижность плазмидных форм для небольших плазмид приведена в прил. 9. Сначала идёт суперспиральная форма, при очень высоких концентрациях перед ней можно увидеть сверхсуперспираль. Затем движется линейная (встречается в старых препаратах или при нарушении протоколов) и потом релаксированная форма плазмиды (кольцевая двухцепочечная с разрывом в одной цепи). Это три основные формы. Выше над этими формами в концентрированных препаратах можно видеть димерную суперспиральную форму. Ещё выше по направлению к лунке иногда видны остатки хромосомной ДНК. При рестрикции все формы переводятся в одну полосу, соответствующую линейной форме (остатки хромосомы штамма-хозяина дают шлейф из фрагментов, чаще всего невидимый).

     

     

    Работа 5.3. Выделение репликативной формы RF фага М13

    Бактериофаги (фаги) – вирусы бактерий; размножаются внутри клеток, что вызывает обычно их лизис. С химической точки зрения представляют нуклеопротеидные комплексы: фаг состоит из белковой оболочки (капсида), покрывающей одно- или двухцепочечную молекулу ДНК, или, реже, РНК.

     

    Близкородственные нитевидные фаги М13, f1, fd и др. с вирионами, содержащими одноцепочечную ДНК относятся к умеренным – они не лизируют клетки, на которых размножаются (паразитируют). Векторы на основе нитевидных фагов удобны для секвенирования, поскольку из фаговых частиц можно выделить одноцепочечную ДНК +-цепей.

     

    Интерес к этим фагам обусловлен ещё и тем, что они составляют основу метода фагового дисплея – одного из основных аффинных методов белковой инженерии для изучения белок-белковых взаимодействий наряду с дрожжевыми двугибридными системами и белковыми микрочипами.

     

    Клонирование генов осуществляют в двухцепочечную ДНК нитевидного фага, существующую внутри клеток инфицированной популяции бактерий как плазмида. Если при клонировании «сшить» какой-либо ген c фаговым геном III (или VIII), кодирующем белок капсида gp3 (gp8), то полученный при трансляции гибридный белок будет презентирован на поверхности зрелого вириона в виде фьюжен-конструкта (англ. fusion – слияние, сплав). Такой фаг, а равно и библиотека генов в векторе М13 называется «фаг-дисплей», поскольку это дисплей пептидов на поверхности фаговых частиц (McCafferty et al ., 1990).

     

    Выделение двухцепочечной кольцевой репликативной (RF) формы фага М13 из клеток E . coli может быть проведено по любому из методов, используемых при выделении плазмид. Фаг М13 инфицирует только F+ штаммы кишечной палочки, поскольку сорбируется на F-пилях.

    Приведена методика заражения (трансфекции) клеток E . coli фагом М13 c последующей наработкой RF-формы для получения двухцепочечной ДНК.

    Материалы и оборудование

    F+ штамм кишечной палочки E . coli XL1–Blue (TG-1, JS5 или другой), фаг M13 K07 в буфере ТЕ с титром 1013 частиц /мл, центрифуга, шейкер.

    Растворы

    -Раствор I(работа 4.1)

    -Раствор II(работа 4.1)

    -10 М ацетат аммония.Растворить770 г в 800 мл воды и довести до 1 л.

    -Канамицин.Раствор 100 мг/мл в воде.

    Методика

    1. Вырастить культуру клеток F+ штамма E.coli в 5 мл жидкой среды 2YT в течение ночи. Число клеток при этом может достичь 1010 клеток/мл.

    2. Заразить культуру фагом в соотношении 10:1 (на 1 бактериальную клетку должно приходиться порядка 10 фаговых частиц). Для этого необходимо в пробирку к клеткам добавить 10 мкл суспензии фаговых частиц.

    3. Инкубировать без качания 1 ч при 37°С. За это время фаг М13 К07      сорбируется на F-пилях, проникнет в клетку и начнётся синтез его RF. Эффективнось трансфекции E . coli выше трансформации (тема 8).

    4. Добавить в 500 мл свежей среды 2YT необходимый антибиотика (500 мкл раствора канамицина с концентрацией 100 мг/мл), перелить туда заражённые фагом клетки E.coli.

    5. Растить культуру с аэрацией в течение ночи при 37°С.

    6. Клетки осадить центрифугированием при 4000 об/мин в течение 10–15 мин. Слить супернатант с культуральной средой в чистую колбу б.

    7. Выделить из осаждённых клеток двухцепочечную кольцевую ДНК репликативной формы фага по протоколу минипреп (работа 4.1).

    Примечания

    а  Фаг M13 K07 ( Viera , Messing , 1987) является рекомбинантным и имеет ген канамицин-устойчивости (см. прил. 1). Фаг М13 «дикого типа» растят без антибиотика.

    б В культуральной жидкости содержатся вышедшие из клеток фаговые частицы. Их легко можно выделить, как описано в работе 4.4, пропорционально увеличив при этом объёмы. Титр фаговых частиц определяют путём трансфекции клеток E.coli и последующего рассева клеток на агаризованную питательную среду с антибиотиком.


    Рекомендуемые страницы:

    Плазмидная изоляция - Центр обучения MyBioSource

    Введение

    Термин «плазмида» был придуман Джошуа Ледербергом в 1592 году. Первоначально произошедшие от бактерий, плазмиды представляют собой внехромосомные генетические элементы, присутствующие у большинства видов архей, эукарий и эубактерий, которые могут воспроизводиться независимо. Плазмиды представляют собой кольцевые двухцепочечные молекулы ДНК, которые отличаются от хромосомной ДНК клеток.

    Структурой и функцией бактериальной клетки управляет генетический материал, содержащийся в хромосомной ДНК.В некоторых случаях плазмиды обычно не важны для выживания бактерии-хозяина. Хотя это и не обязательно, плазмиды вносят значительный вклад в генетическое разнообразие и пластичность бактерий, кодируя функции, которые могут не определяться бактериальной хромосомной ДНК. Плазмиды определяют черты, которые позволяют хозяину сохраняться в средах, которые в противном случае были бы смертельными или ограничивающими для роста. Например, устойчивость к антибиотикам и экспрессия белка. Гены устойчивости к антибиотикам часто кодируются плазмидой, что позволяет бактериям сохраняться в среде, содержащей антибиотики, тем самым обеспечивая бактерии конкурентное преимущество перед видами, чувствительными к антибиотикам.В качестве инструмента плазмиды могут быть модифицированы для экспрессии интересующего белка (например, производство человеческого инсулина с использованием технологии рекомбинантной ДНК).

    Плазмиды послужили бесценными модельными системами для изучения таких процессов, как репликация ДНК, сегрегация, конъюгация и эволюция. Плазмиды сыграли ключевую роль в современной технологии рекомбинантной ДНК как инструмент клонирования генов и как средство экспрессии генов.

    Характеристики плазмиды

    Плазмиды, присутствующие в бактерии, различаются по своим физическим свойствам, таким как размер (kbp), геометрия и количество копий.

    Размер плазмиды

    Плазмиды имеют размер от 1 кб (килограмм пара оснований) до 1000 (килограмм пара оснований) мегаплазмид, размер которых составляет несколько сотен пар оснований.

    Геометрия плазмиды

    Хотя большинство плазмид обладают круговой геометрией, в настоящее время существует множество примеров линейных плазмид у различных бактерий. Плазмидная ДНК может иметь одну из пяти конформаций. разрезанная открытая кольцевая ДНК , имеющая разрез по одной нити, расслабленная кольцевая ДНК полностью интактна, обе нити не разрезаны, но ферментативно релаксирована, линейная ДНК имеет свободные концы, суперспиральная ДНК полностью неповреждена, обе нити не разрезаны, а суперспиральная денатурированная ДНК - это , как суперспиральная ДНК , но имеет непарные области, которые делают ее немного менее компактной.

    Номера копий плазмид

    Число копий означает среднее или ожидаемое количество копий на одну клетку-хозяина. Плазмиды бывают с низким, средним или высоким числом копий. Перед началом эксперимента очень важно знать, к какой категории относится плазмида. При работе с плазмидой с низким числом копий, которая связана с низким выходом и поэтому может потребоваться создание большего количества культур. С другой стороны, если из плазмиды с большим количеством копий получается плохой выход, требуется устранение неполадок.У бактерий с плазмидами с высоким числом копий во время деления клеток плазмиды случайным образом разделяются в дочерних клетках, тогда как у бактерий с низким числом копий во время деления клеток и делятся плазмиды поровну в дочерних клетках. Преимущество большого количества копий - большая стабильность pla

    .

    Выделение плазмидной ДНК | Thermo Fisher Scientific

    Plasmid Isolation

    Изолировать плазмидную ДНК для каждого приложения

    Наши наборы для выделения плазмид Invitrogen предлагают варианты для устранения проблем, возникающих при обработке нескольких образцов.Мы разрабатываем наши продукты для экстракции плазмидной ДНК для выделения плазмидной ДНК необходимой вам чистоты и масштаба. Выбирайте из нашего широкого спектра высокопроизводительных и экономичных технологий очистки плазмид, разработанных, чтобы помочь вам преодолеть общие проблемы подготовки плазмид, такие как низкое извлечение и присутствие примесей. Узнайте о том, как очистить плазмидную ДНК с помощью наборов для экстракции Invitrogen PureLink и Thermo Scientific GeneJET, из наших видеороликов о протоколе выделения плазмид.

    Надежная очистка плазмидной ДНК в количестве и чистоте, необходимых для интересующего последующего применения, является ключевым этапом рабочего процесса экспрессии белка.Узнайте больше о том, как получить плазмиду степени трансфекции и использовать ее с системами временной экспрессии для млекопитающих Gibco ExpiCHO и Expi293.

    Загрузить руководство по ДНК Загрузить руководство по применению Загрузить руководство по выбору


    Какой набор для выделения и очистки плазмидной ДНК подходит вам?

    Быстрая изоляция качества молекулярной биологии Золотой стандарт сверхчистого,
    высокое качество
    Повышенная чистота для чувствительных приложений
    Степень чистоты Молекулярный Трансфекция Расширенная трансфекция
    Эндотоксин Стандарт (> 10 EU / мкг) Низкий эндотоксин (0.1–1 EU / мкг) Без эндотоксинов
    (<0,1 ЕЭ / мкг)
    Набор для очистки плазмидной ДНК
    GeneJET

    PureLink HiPure

    PureLink Fast

    PureLinkExpi
    Не содержит эндотоксинов
    Общее время протокола 15–60 мин 30–120 мин 30 мин 90–120 мин
    Размер препарирования Mini – Maxi Мини-Гига Миди, Макси Макси, Мега, Гига
    Доходность до 20 мкг – 1 мг 20 мкг – 15 мг 0.4 мг (миди преп) или 1,5 мг (макси преп) 1,5–15 мг
    Технологии Кремнеземная мембрана Анионный обмен Улучшенный диоксид кремния Анионообменная мембрана
    Приложения Нечувствительный
    • PCR
    • Клонирование (переваривание, лигирование)
    • Секвенирование
    Чувствительный
    • Трансфекция стандартных устойчивых клеточных линий
    • Все приложения молекулярной биологии
    Очень чувствительный
    • Первичная трансфекция и трансфекция стволовых клеток
    • Исследования генной терапии и вакцин (in vivo)
    • Все стандартные приложения для трансфекции
    • Все приложения молекулярной биологии
    Заказать сейчас Заказать Заказать Заказать

    Размеры препаратов плазмидной ДНК

    Миниреп Midiprep Максипреп Мегапреп. Гигапреп
    Ночной объем бактериальной культуры 1–5 мл 25–100 мл 100–500 мл 500 мл – 2.5 л 2,5–5 л
    Приблизительный ресурс До 40 мкг До 400 мкг до 1,5 мг До 5 мг До 15 мг

    Извлечение плазмидной ДНК с PureLink и GeneJet

    Как очистить плазмидную ДНК без эндотоксинов

    Как очистить плазмидную ДНК молекулярного уровня

    В этом видео показано, как очистить плазмидную ДНК молекулярного уровня за 15 минут с помощью нашего минипрепарата для плазмид GeneJET.Плазмидная ДНК молекулярного качества подходит для клонирования, мечения нуклеиновых кислот, ПЦР, секвенирования ДНК и трансформации.

    Как очистить плазмидную ДНК с помощью нашего набора megaprep

    Выделите плазмидную ДНК, пригодную для трансфекции, всего за 90 минут с помощью набора Invitrogen PureLink HiPure Expi Plasmid Megaprep Kit.Эта инновационная запатентованная анионообменная смола в этих наборах сочетает в себе большую емкость с высокой скоростью потока, высоким разрешением и эффективностью.

    Как очистить плазмидную ДНК степени трансфекции

    Узнайте, как очистить плазмидную ДНК степени трансфекции с помощью набора Maxiprep Plasmid Filter от Invitrogen PureLink HiPure.Плазмидная ДНК для трансфекции подходит для всех применений молекулярного уровня, а также для транскрипции и трансфекции in vitro.

    .

    PPT - Презентация PowerPoint для выделения плазмидной ДНК, скачать бесплатно

  • Выделение плазмидной ДНК

  • Цели эксперимента • Извлечение плазмидной ДНК из E. Coli. • Анализируйте плазмидную ДНК с помощью электрофореза в агарозном геле и спектрофотометра.

  • Введение • Многие типы бактерий содержат плазмидную ДНК. • Плазмиды - это внехромосомные двухцепочечные кольцевые молекулы ДНК, отделенные от хромосомной ДНК.• Некоторые плазмиды реплицируются независимо от хромосомной ДНК и могут присутствовать в сотнях копий на клетку. • Обычно содержит от 1000 до 100 000 пар оснований. • Даже самые большие плазмиды значительно меньше, чем хромосомная ДНК бактерии, которая может содержать несколько миллионов пар оснований.

  • Классификация плазмид по функциям Есть пять основных классов • Фертильность-F-плазмиды, способствующие бактериальной конъюгации • Резистентные-R-плазмиды, которые содержат гены, которые могут создавать устойчивость к антибиотикам или ядам.• Col-плазмиды, которые содержат гены, кодирующие бактериоцины, белки, которые могут убивать другие бактерии. • Разлагающие плазмиды, которые позволяют переваривать необычные вещества, например, салициловую кислоту. • Плазмиды вирулентности, которые превращают бактерии в патогены.

  • Плазмиды • Плазмиды, используемые при трансформации, обычно содержат три важных элемента: • Сайт клонирования (место для вставки чужеродных ДНК) • Источник репликации • Ген селектируемого маркера (например,грамм. устойчивость к ампициллину)

  • Применение плазмид

  • Выделение плазмидной ДНК • Выделение плазмидной ДНК из бактериальных клеток является важным этапом для многих процедур молекулярной биологии. • Опубликовано множество протоколов для крупномасштабного и мелкомасштабного выделения плазмид. • Процедуры очистки плазмиды, в отличие от процедур очистки геномной ДНК, должны включать удаление не только белка, но и другой важной примеси: бактериальной хромосомной ДНК.

  • Суспензия ночной культуры • Выберите одну колонию и инокулируйте в 5 мл LB (Лурия-Бертани), содержащего 20 мг / л ампицилина • Инкубируйте в течение ночи при 37 ° C • Центрифугируйте 1,5 мл бульона, содержащего клетки, в пробирке • Выбросьте супернатант

  • Выделение плазмидной ДНК • Инактивация бактерий • Лизис клеток / денатурация ДНК • Осаждение ДНК • Отделение плазмидной ДНК от загрязняющих примесей • Осаждение плазмидной ДНК • Осаждение белков • Осаждение плазмидной ДНК

  • 00 1- Инактивация бактерий • Ресуспендируйте осадок клеток в 100 мкл буфера GTE (50 мМ глюкоза, 25 мМ Трис-Cl и 10 мМ ЭДТА, pH 8) • Добавляют глюкозу для увеличения осмотического давления вне клеток • Трис - буферный агент • ЭДТА защищает ДНК от разрушающих ферментов • При необходимости осторожно перемешайте на вортексе

  • 2- Лизис клеток / денатурация ДНК Добавьте 200 мкл NaOH / SDS раствор для лизиса, перевернуть пробирку 6-8 раз 1.Додецилсульфат натрия • Растворяет мембраны • Связывает и денатурирует белки 2. NaOH • NaOH разрывает клетку, а также денатурирует ДНК на отдельные цепи

  • 3- Осаждение ДНК • Немедленно добавьте 150 мкл 5 М раствора ацетата калия ( pH 4,8) 1. Раствор ацетата калия / уксусной кислоты • Нейтрализует NaOH (ренатурирующую плазмидную ДНК) • Преобразует растворимый SDS в нерастворимый PDS додецилсульфат натрия (SDS), додецилсульфат калия (PDS) • Осаждение геномной ДНК • Центрифуга в течение 1 минуты на высокой скорости

  • 4- Отделить плазмидную ДНК от примесей Отделить плазмидную ДНК от примесей центрифугированием • Супернатант содержит: - Плазмидную ДНК - Некоторые клеточные компоненты • Осадок содержит: - PDS - липиды - белки - хромосомную ДНК

  • 5- Осаждение плазмидной ДНК • Перенести слой супернатанта в чистую пробирку и добавить 0.5 мл изопропанола на льду в течение 10 минут • Центрифуга на максимальной скорости в течение 1 минуты. Добавьте 0,5 мл изопропанола в супернатант. Надосадочная жидкость. Центрифуга. Инкубируйте в течение 10 минут. на льду Гранулы • Удалите супернатант, растворите осадок в 0,4 мл буфера TE • Добавьте 10 мкл раствора РНКазы, перемешайте и инкубируйте при 37 ° C в течение 20–30 минут.

  • Тщательно перемешайте с равным объемом органического растворителя Водная центрифуга фенол, хлороформ, органический 6- Осаждение белков • Добавьте 300 мкл фенола / хлороформа / изоамилового спирта • Энергично перемешайте в течение 30 секунд • Центрифугируйте на полной скорости для 5 минут

  • Супернатант ДНК, осажденная абсолютным этанолом и ацетатом аммония, осажденная на центрифуге Осадка 7 - осаждение плазмидной ДНК • Удалите супернатант в чистую пробирку.5 M ацетат аммония и 1 мл абсолютного этанола для осаждения плазмидной ДНК, инкубируйте на льду • Перемешайте и затем центрифугируйте на полной скорости в течение 5 минут • Промойте осадок 75% этанолом (для удаления солей) и сухой осадок • Растворите осадок с ТЕ (или другим водным раствором)

  • Количественная оценка плазмидной ДНК • Количественная оценка ДНК с использованием УФ-поглощения • Пики УФ-поглощения ДНК при 260 нм • Пики УФ-поглощения белков при 280 нм • Отношение поглощения при 260 нм / 280 нм - мера чистоты образца ДНК от загрязнения белком; он должен быть между 1.7 и 2,0 • Отношение оптической плотности при 260 нм / 230 нм является мерой чистоты образца ДНК от органических веществ и / или солей; должно быть около 2,0. Низкое соотношение 260/230 указывает на загрязнение органическими веществами и / или солями

  • http://www.dnatube.com/video/994/Plasmid-Isolation • http://www.dnalc.org/resources/animations /transformation1.html • http://www.learnerstv.com/animation/animation.php?ani=167&cat=biology • http://resources.jorum.ac.uk/xmlui/bitstream/handle/123456789/13704/page83 .htm? sequence = 86 • http://www.sumanasinc.com/webcontent/animations/content/dna_library.swf • http://www.sumanasinc.com/webcontent/animations/content/plasmidcloning.html

  • .

    % PDF-1.5 % 365 0 объект > endobj xref 365 40 0000000016 00000 н. 0000002165 00000 н. 0000002322 00000 п. 0000002839 00000 н. 0000003260 00000 н. 0000003697 00000 н. 0000003734 00000 н. 0000003905 00000 н. 0000004019 00000 п. 0000004392 00000 п. 0000004875 00000 н. 0000005218 00000 н. 0000005668 00000 н. 0000006554 00000 н. 0000007362 00000 н. 0000008132 00000 н. 0000008733 00000 н. 0000009515 00000 н. 0000010108 00000 п. 0000010896 00000 п. 0000011611 00000 п. 0000014260 00000 п. 0000014335 00000 п. 0000014432 00000 п. 0000014581 00000 п. 0000016826 00000 п. 0000018760 00000 п. 0000018873 00000 п. 0000018948 00000 п. 0000019261 00000 п. 0000019316 00000 п. 0000019432 00000 п. 0000019556 00000 п. 0000019631 00000 п. 0000019944 00000 п. 0000020019 00000 п. 0000020332 00000 п. 0000028203 00000 п. 0000075467 00000 п. 0000001096 00000 н. трейлер ] / Назад 979697 >> startxref 0 %% EOF 404 0 объект > поток hb``b`yh Ā

    .

    Смотрите также