• Выделение рнк из дрожжей


    НУКЛЕОПРОТЕИДЫ. ВЫДЕЛЕНИЕ НУКЛЕОПРОТЕИДОВ ИЗ ДРОЖЖЕЙ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИХ СОСТАВА.

    Нуклеопротеиды - сложные белки, простетической группой которых являются нуклеиновые кислоты (дезоксирибонуклеиновая - ДНК и рибонуклеиновая - РНК). Они представляют собой слож­ные агрегаты, построенные из 1-2 молекул нуклеиновой кислоты и большого числа прикрепленных к ним белковых субъединиц. Связь между белком и нуклеиновыми кислотами осуществляется за счет ионных, водородных и гидрофобных взаимо­действий.

    Нуклеиновые кислоты характеризуют­ся определенным составом и распадаются:

    - при неполном ферментатив­ном гидролизе РНК и ДНК, щелочном гидролизе РНК (ДНК не гидролизуются под действием щелочей) до структурных единиц нуклеиновых кислот – мононуклеотидов.

    - при полном гидролизе мононуклеотидов до пуриновых (аденина, гуанина) и пиримидиновых (цитозина, тимина – только в ДНК, урацила – только в РНК) азотистых оснований, пентоз (рибозы – в РНК, дезоксирибозы – в ДНК) и фосфорной кислоты.

    Нуклеопротеидами богаты печень, селезенка, поджелудочная железа, почки. Доступным и удобным объектом, особенно богатым нуклеопротеидами, являются дрожжи. Нуклеопротеиды извлекаются из дрожжевых клеток при механическом разрушении клеток. Дальнейшее их выделение связано со свойством нуклеопротеидов растворяться в разбавленных растворах щелочей и легко осаждаться при подкислении раствора. При непродолжительном гидролизе дрожжевой массы или выделенных из нее нуклеопротеидов последние распадаются на полипептиды, пуриновые и пиримидиновые основания, рибозу и дезоксирибозу , фосфорную кислоту.

    Продукты гидролиза нуклеопротеидов могут быть обнаружены в гидролизате специфическими для каждого соединения реакциями.

    Реактивы и оборудование: дрожжи, диэтиловый эфир, 5%-ный раствор уксусной кислоты, 0,4, 10, 30%-ные растворы гидроксида натрия, 10%-ный раствор серной кислоты, 25%-ный раствор аммиака, 1%-ный раствор нитрата серебра, 1, 7%-ные растворы сульфата меди, этанол, молибденовый реактив (3,75 г молибдата аммония растворяют в 50 мл воды и добавляют 50 мл 32%-ного раствора азотной кислоты), ступки с пестиками, центрифуга, центрифужные пробирки, технические весы, пипетки, стеклянный лом, стеклянные палочки, фарфоровые чашки, бумажные фильтры, воронки, воздушный холодильник, электрическая плитка, спиртовки, пробирки.

    Выполнение работы.

    I. Извлечение нуклеопротеидов из дрожжей.

    Навеску 1 г сухих дрожжей помещают в ступку, добавляют туда 0,5 г стеклянного лома, диэтилового эфира и воды по каплям и тщательно растирают до образования пластичной массы. Затем в ступку добавляют 5 мл 0,4%-ного раствора едкого натрия и продолжают растирать еще в течение 15-20 минут. Содержимое ступки центрифугируют в течение 10 минут (при 2000 оборотах в минуту). После центрифугирования надосадочную жидкость осторожно пипеткой переносят в фарфоровую чашку и по каплям прибавляют 2 мл 5%-ного раствора уксусной кислоты. При добавлении уксусной кислоты происходит выпадение нуклеопротеидов в осадок, который отделяют центрифугированием. Затем надосадочную жидкость сливают, а осадок используют для дальнейшего гидролиза.

    II. Кислотный гидролиз нуклеопротеидов.

    В колбу для гидролиза (с обратным воздушным холодильником) помещают осадок нуклеопротеидов, заливают 10-15 мл 10%-ного раствора серной кислоты и кипятят в течение 1,5 ч, поддерживая только слабое кипение. После кипячения колбу охлаждают, содержимое ее фильтруют через бумажный фильтр, а фильтрат подвергают дальнейшему анализу.

    III. Анализ гидролизата.

    Охлажденный гидролизат используют для качественного анализа на полипептиды, пуриновые основания, пентозы и фосфорную кислоту.

    Белки обнаруживают с помощью биуретовой реакции.

    Пуриновые основания обнаруживают по их реакции с аммиачным раствором нитрата серебра.

    10 капель гидролизата нейтрализуют по каплям 25%-ным раствором аммиака (до рН=4 по универсальному индикатору, так как серебрянный комплекс пуриновых оснований выпадает в слабокислой среде) и затем добавляют 5 капель 1%-ного раствора нитрата серебра. Наблюдается образование комплекса серебра с пуриновыми основаниями в виде желтовато-белого аморфного осадка.

    Пентозы обнаруживают по реакции Троммера.

    5 капель гидролизата нейтрализуют 15 каплями 30%-ного раствора гидроксида натрия (до рН=9), затем добавляют 1 каплю 7%-ного раствора сульфата меди (избыток сульфата меди меняет окраску). Раствор при этом окрашивается в фиолетовый цвет, так как образуется алкоголят меди. Пробирку с раствором нагревают до кипения и наблюдают выпадение бурого осадка, так как медь (II) окисляется до оксида меди (I), имеющего красно-кирпичный цвет.

    Фосфорную кислоту обнаруживают по реакции с молибдатом аммония:

    12(NH4)2MoO4 + H3PO4 + 21HNO3 → (NH4)3PO4·12MoO3↓ + 21NH4NO3 + 12H2O.

    К 1-2 мл гидролизата приливают 2-3 мл молибденового реактива, нагревают до кипения. Образуется желтый осадок фосфоромолибдата аммония (NH4)3PO4·12MoO3.

    Контрольные вопросы.

    1. Что такое нуклеопротеиды? К какому классу биомолекул они относятся?

    2. В каких участках клетки локализуются нуклеопротеиды?

    3. При каких условиях нуклеопротеиды распадаются на нуклеиновые кислоты и белки?

    4. Какие продукты полного гидролиза нуклеопротедов? Какими качественными реакциями их можно обнаружить?

     

    ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА 6.

    КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ

    В БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТАХ.

     

    Для количественного определения белков применяют биологические, физические и химические методы.

    Биологические методы количественного определения белков основаны на измерении степени биологической активности препарата и, поэтому, применимы лишь к белкам, обладающим ферментативной и гормональной активностью. Эти методы не дают абсолютных результатов.

    Более точными являются физические методы количественного определения белков. Наибольшее распространение из них получили три: рефрактометрический (по показателю преломления белковых растворов), спектрофотометрический (по интенсивности светопоглощения в ультрафиолетовой области спектра) и полярографический (по полярографическим кривым, показывающим зависимость между силой тока и напряжением, приложенным к системе, содержащей белок).

    Химические методы количественного определения белков разнообразны. Самым распространенным и наиболее точным является фотоколориметрический метод. Он основан на измерении интенсивности светопоглощения, которая зависит от количества белка в исследуемой пробе.

    КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ

    РЕФРАКТОМЕТРИЧЕСКИМ МЕТОДОМ

    Рефрактометрический метод анализа белка основан на измерении показателя преломления белкового раствора, зависящего от его кон­центрации, температуры, длины волны падающего света и природы ве­щества.

    Между показателем преломления (n) и концентрацией белка в растворе характерна прямо пропорциональная зависимость. Поэтому концентрацию белка в исследуемом растворе находят по показателю преломления с помощью калибровочной кривой, построенной по стандартному раствору белка.

    Измерения проводят с помощью специального прибора – рефрактометра, с устройством которого можно ознакомиться по инструкции, прилагаемой к прибору.

    Реактивы и оборудование: стандартный раствор белка, раствор исследуемого белка, рефрактометр, пипетки мерные на 1, 2, 5 мл, колба мерная на 100 мл, стеклянные палочки, фильтровальная бумага.

    Выполнение работы. В колбах на 100 мл готовят серию (5-6) стандартных растворов белка с концентрациями 1 – 8 мг/мл, измеряют их показатели преломления (n) с помощью реф­рактометра, предварительно установив ноль по воде (показатель преломления воды при температуре 20°С равен 1,333). Если во время проведения измерений температура не равна 20°С, то в полученное значение показателя преломления вносят поправку 0.0001 на каждый градус. В случае более низкой температуры поправку вычитают, более высокой – прибавляют. После этого строят график зависимости в координатах n - f (c). Затем, измерив показатель преломления исследуемого раствора, по построенной калибровочной кривой определяют его концент­рацию. Результат пересчитывают на 100 г продукта.

     

     Протокол Стьюдента

    для выделения РНК из дрожжей

    Протокол Стьюдента для выделения РНК из дрожжей

    Выделение общей РНК из Дрожжи



    На основе раздаточного материала д-ра Карен Бернд, Дэвидсон-колледж
    http://www.bio.davidson.edu/Biology/GCAT/protocols/GCATRNA.html
    Редакция д-ра Терри Райф
    Назад в расписание лаборатории Bio 480

    Этот протокол позволит вам выделить достаточное количество общей РНК из дрожжи для маркировки для наших экспериментов с микрочипами.Есть пять основные шаги, которые мы пройдем - 1. Выращивание дрожжевых культур, 2. Подготовка дрожжевых сферопластов, 3. Подготовка дрожжевой РНК, 4. Определение концентрации дрожжевой РНК, 5. Проверка РНК на деградацию с помощью гель-электрофореза.

    Помните, когда вы выполняете эту процедуру, есть РНКазы (ферменты, расщепляющие РНК) везде. Ваши руки и дыхание - два основных источника. Вы следует носить перчатки во время этих процедур и избегать использования перчатки, чтобы во время процедур касаться кожи или волос.Не делайте дышите напрямую или разговаривайте по трубкам. Нет ничего ненужным на скамейках и продумайте протокол перед тем, как начать.

    Ваши скамейки следует мыть специальным моющим средством под названием RNAZap (Ambion), который поможет избавиться от Rnases перед началом протокол.


    Рост дрожжей Культуры

    Культуры дикого типа и дрожжей, содержащие различные мутации, будут начинать накануне эксперимента. В день эксперимента культуры будут оцениваться, чтобы убедиться, что и мутантные, и клетки дикого типа будут иметь одинаковое количество дрожжей к моменту начала занятия.Каждый раздел будет дана одна культура дрожжей дикого типа и культура содержащий одну из мутантных разновидностей, которые мы обсуждали в учебный класс.

    Дрожжи выращиваются так же, как и бактерии. Как бактерии, у них разные фазы роста. Три фазы роста называются лаг-фазой, лог-фазой и стационарной фазой. Дрожжи запускаются в так называемой лаг-фазе, это называется лаг-фазой, потому что клеткам требуется некоторое время, чтобы включить гены, необходимые для начала роста. Затем они начинают экспоненциально удваиваться, это называется фазой регистрации.Наконец, когда питательные вещества в питательной среде израсходованы, дрожжи переходят в так называемую стационарную фазу, когда их рост прекращается. Читая абсорбция культуры на спектрофотометре при 600 нм - это способ, которым вы можете определить, в какой фазе цикла роста дрожжей вы находитесь и как у вас много ячеек. Результаты этих показаний измеряются в единицах оптической плотности или O.D. Мы хотим собрать дрожжевые клетки в поздней логарифмической фазе, потому что нам нужны дрожжи, которые все еще растут, и максимальное количество дрожжей, которое мы можем иметь в нашей культуре.Гаплоидные дрожжевые клетки содержат примерно 1,2 пг РНК на cell, поэтому нам нужно много клеток, чтобы получить мкг РНК, с которыми нам нужно работать! Ниже приведены некоторые результаты эксперимента с кривой роста, проведенного Бобби Истом, учеником предыдущего класса. Он начал как дикий тип, так и культуру нокаута ZMS2 в O.D. 0,3. Через сколько часов дрожжи в его эксперименте перестанут расти и войдут в стационарную фазу? Если мы начнем отключать дрожжи при OD 0,3 в 8:30 утра, будут ли они в фазе поздней регистрации на 2 р.м. когда мы собираем их для нашего класса? Дайте мне знать, если вы думаете, что нам следует изменить наши сроки?

    Время роста дрожжей (минуты)

    OD 600 WT OD 600 ZMS2 Выбивной
    0 0.3 0,27
    231 мин. (~ 4 часа) 0,579 0,537
    281 мин. (~ 4,5 часа) 0,813 0.744
    326 мин. (~ 5,4 часа) 0,909 0,912
    356 мин. (~ 6 часов) 0,957 0,942
    386 мин.(~ 6.5 часов) 1.02 1.03
    416 мин. (~ 7 часов) 1.06 1.07
    466 мин. (~ 7,7 часов) 1.09 1.09


    Подготовка дрожжевых клеток путем изготовления Сферопласты


    Дрожжи содержат твердую клеточную стенку. Сферопласты - это дрожжевые клетки, в которых клеточная стенка подверглась ферментативной деградации. Эти сферопласты очень хрупкие, поэтому с ними нужно быть осторожнее. однажды у нас есть сферопласты, дрожжевые клетки лизировать и быстро высвободить РНК и белки в клетке в контролируемый среда, в которой мы можем временно удерживать клеточные РНКазы от деградируя РНК.Мы не хотим лизировать клетки до того, как они попадут в это контролируемая среда.

    1) Поместите пробирки на 50 мл, содержащие 30 мл дрожжевых культур, в соответствующий O.D. чтение в центрифуге по соседству (убедитесь, что сбалансированный). Центрифуга при 2500 об / мин (1500 x G) в течение 5 минут для осаждения клетки. Пожалуйста, поделитесь центрифугой, так как она только одна.

    Следующие 3 шага называются стиркой - они служат для перемещения ячеек. из питательной среды в раствор, который правильно забуферен для следующая процедура.
    2) Удалите пробирки из центрифуги. Осторожно вылейте супернатант в контейнер для жидких отходов. Старайтесь не беспокоить пеллеты. Добавьте 1 мл Калий фосфат / сорбитоловый буфер (1,2 М сорбит, 10 мМ фосфат калия, pH = 7,2) и ресуспендировать осадок путем пипетирование.

    3) Перенесите клетки из каждой конической пробирки в отдельные Микроцентрифужные пробирки на 2 мл (окрашенные). Вращение на 80% в течение 3мин.

    4) Слить супернатант (не трогая осадок). удалять оставшийся супернатант с помощью пипетки Ресуспендировать осадок в 1 мл калия Фосфатно-сорбитовый буфер.

    5) Поднесите трубки к вытяжному шкафу. Добавить:

    • 3 мкл b меркаптоэтанола (a восстановитель с очень неприятным запахом)
    • 320 мкл 1 мг / мл литиказы (фермент, разлагающий компоненты клеточной стенки)

    6) Поместите пробирки в шейкер при 30 ° C на 15 минут.
    Клетки превратились в сферопласты. Без клеточной стенки они живы но структурно намного слабее.

    Непосредственно перед тем, как сломать ячейки, мы должны избавиться от литиказа и b-MeOH.
    7) Вращение в микроцентрифуге при 40% в течение 3 мин.удалять супернатант с помощью пипетки (выбросить в вытяжной шкаф, чтобы сдержать запах).

    8) Добавьте 500 мкл буфера фосфат / сорбит калия. Повторите шаг 7 (один раз).

    9) Во время центрифугирования приготовьте ведерко для льда. содержащий:

    2 пробирки для микроцентрифугирования со стеклянными шариками, 1 пробирка с Раствор 1 (1,6 мл), 1 пробирка с Раствором 2 (400 мкл), 1 пробирка изопропанол (1,6 мл), 1 пробирка раствора 3 (400 мкл)

    БУДЬТЕ ОСТОРОЖНЫ РНАС ЗДЕСЬ !!!!!!

    Изоляция РНК

    Выделение РНК будет выполнено с использованием набора RNAsafe от Qbiogen.Растворы 1 и 2 содержат ионы и детергенты, которые инактивируют клеточные РНКазы, которые высвобождаются при лизировании клеток и помогают прорваться через клеточную мембрану. В конце концов, вы перемешаете смесь и избавитесь от всего белки в растворе и 900 мкл, взятые на шаге 15 должен содержать в основном нуклеиновые кислоты. Следующие несколько шагов помогут удалить ДНК из раствора.

    10) Ресуспендируйте гранулы из шага 9 в 800 мкл раствора 1 осторожно щелкающая трубка.

    11) Вылейте стеклянные шарики из пробирки в ведерке для льда в пробирку, содержащую клетки.

    12) Добавьте 200 мкл раствора 2 в каждую ячейку + пробирку с шариками. Решение 1 и 2 содержат буферы и хаотропы, которые помогут стабилизировать РНК в растворе).

    13) Вихревые ячейки на высокой скорости в течение 10 циклов встряхивания / чередование льда (1 цикл = 30 секунд встряхивания / а затем 30 секунд на льду). На этом этапе дрожжи вскрываются грубо сила.

    14) Инкубируйте пробирки в течение 2 минут на льду.

    15) Центрифуга 95% в течение 10 мин.

    16) Перенесите 900 мкл супернатанта в чистую пробирку (если Вы не можете получить столько, это нормально, просто отрегулируйте количество изопропанола на следующем шаге).

    ИЗБЕГАЙТЕ ВСЕГО МУСОРА на дне трубы, а также слоя грязи на вершине. Лучше брать меньше 900 мкл и избегать "гадости". Обломки содержат мембраны, неразрушенные клетки и белки. поскольку дрожжи содержат клеточные РНКазы (белок), что важно отделите их от своей РНК.

    17) Добавьте 900 мкл изопропанола в каждую пробирку. Смешать переворачивание трубок. Затем дайте настояться при комнатной температуре на 2 мин.

    18) Центрифужные пробирки при 95% в течение 5 минут для осаждения РНК осадок.

    19) Осторожно слейте супернатанты, перевернув пробирку и решительно щелкнув по нему, чтобы удалить весь супернатант.

    20) Снова прокрутите пробирки в течение 30 секунд и удалите все остатки. супернатант пипеткой.

    21) Ресуспендируйте каждый осадок в 200 мкл раствора 3. Убедитесь, что гранула ресуспендирована - щелкни по ней, перемешай на вортексе, убедись, что гранула ушел.

    22) Добавьте 40 мкл Раствор 4 к образцам. Смешать встряхивание в течение 10 секунд (раствор 4 содержит смолу, связывающую ДНК, но не РНК)

    23) Инкубируйте в стойке при комнатной температуре в течение 5 минут.

    24) Отжим 90% в течение 2мин.

    25) Осторожно ПЕРЕМЕСТИТЕ SUPERNATANT до правильной трубка. Убедитесь, что он хорошо промаркирован, так как вам нужно будет хранить это в морозилке до следующей недели. Всегда держите РНК включенной лед !!!


    Количественная оценка РНК

    Концентрация РНК считывается путем измерения оптической плотности образец при А260 на спектрофотометре. Образец РНК помещается в кварцевой кювете для измерения оптической плотности (OD).Общие стекло и пластик также поглощают на этой длине волны, поэтому особые используются кварцевые кюветы, не поглощающие свет на этой длине волны для измерения поглощения РНК. Будьте с ними очень осторожны, так как они очень дорогие.

    Вам нужно будет использовать его для определения концентрации вашего РНК. Ученые определили коэффициент поглощения до используйте для определения концентрации РНК в вашем образце подготовка. РНК с концентрацией 40 мкг / мл имеет оптическая плотность 1 при A260.Когда вы прочтете свой образец, вы можете использовать эту информацию, чтобы узнать, сколько РНК вы иметь.

    Для получения результата поместите 20 мкл образца в 1 мл воды и поместите его в кварцевую кювету. Как только вы получите чтение уравнения следует использовать, чтобы помочь вам определить ваш образец концентрация

    О.Д. показание x ((40 мкг / 1000 мкл) / 1 единица OD) x разбавление коэффициент = концентрация в мкг / мкл

    Коэффициент разбавления в этом случае будет 1000/20 = 50, так как вы растворить 20 мкл в 1000 мкл воды.

    Ученые часто измеряют оптическую плотность своего образца РНК при A280, а также A260. И белки, и нуклеиновые кислоты поглощают свет при 280 нм. Таким образом, получая соотношение A260 / A280, ученые могут получить представление о чистоте их образца РНК. Для чистой РНК без большого количества белка это соотношение должно быть 1,9-2,2.


    Проверка РНК на наличие разложение с использованием гель-электрофореза

    Вы будете использовать 2 мкг РНК для работы в 1,2% агарозном геле при 100 В в течение 1/2 часа.

    К каждому образцу РНК добавить соответствующее количество загрузочного красителя. и 1 мкл бромистого этидия

    Не забудьте надеть перчатки и защитные очки, поскольку бромистый этидий мутаген.

    Несколько групп могут работать на одном геле. Мы ищем полосы рибосомной РНК. Они должны выглядеть очень отчетливо, а не деградировали для получения РНК лучшего качества. См. Картинку ниже для пример с использованием РНК крысы.

    1 = деградированная РНК

    2 = Хорошая РНК

    3 = хорошая РНК


    rifetk - Последнее изменение ноя.13, 2001

    .

    Основы: выделение РНК | Thermo Fisher Scientific

    showcase.par.5325.image.0.0.1

    Получение высококачественной РНК является первым и часто наиболее важным этапом в выполнении многих молекулярных методов, таких как ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени (RT-qPCR), анализ транскриптома с использованием секвенирования следующего поколения, матричный анализ, цифровая ПЦР, Нозерн-анализ и построение библиотеки кДНК.Для получения наиболее чувствительных и биологически значимых результатов процедура выделения РНК должна включать некоторые важные шаги до, во время и после фактической очистки РНК. В следующих примечаниях к применению обсуждаются различные передовые методы сбора, хранения и извлечения образцов РНК для максимального увеличения выхода и качества образцов РНК, многие из которых связаны с использованием технологий Invitrogen ™ Ambion ™.

    Популярные статьи о выделении РНК: десять основных способов улучшить изоляцию РНК
    Что можно и чего нельзя делать при выделении тотальной РНК

    Оптимизация подготовки и анализа РНК

    Наши текущие исследования по оптимизации подготовки и анализа РНК выявили несколько моментов в процессе, которые обычно можно улучшить и которые часто упускаются из виду:

    • Обработка образцов и обращение с ними перед выделением РНК
    • Выбор технологий, используемых для получения РНК
    • Хранение приготовленного образца РНК

    Большинство традиционных процедур очистки РНК происходит в присутствии агентов, ингибирующих РНКаз (обычно сильные денатуранты, такие как соли гуанидина, додецилсульфат натрия (SDS) или соединения на основе фенола, которые предназначены для снижения риска деградации РНК в образце).Однако, как правило, до и после экстракции целостность РНК подвергается наибольшему риску.

    Шаг 1. Сбор и защита проб

    Поиск наиболее подходящего метода разрушения клеток или тканей для вашего конкретного исходного материала важен для максимизации выхода и качества вашего препарата РНК.Во время разрушения образца для выделения РНК крайне важно, чтобы литический агент или денатурирующий агент контактировал с клеточным содержимым в тот момент, когда клетки разрушаются. Это может быть проблематично, когда ткани или клетки твердые (например, кость, корни), когда они содержат капсулы или стенки (например, дрожжи, грамположительные бактерии, споры), когда рабочие процессы предотвращают обработку сразу после сбора (например, транспортировка из место сбора в другое место для обработки), или когда образцов много (что затрудняет быструю обработку).Распространенным решением этих проблем является замораживание ткани / клеток в жидком азоте или на сухом льду. Замороженные образцы часто предварительно обрабатывают для выбора желаемой массы или для частичного измельчения образца перед воздействием денатурирующего агента. Хотя замораживание и предварительная обработка позволяют исследователю лучше контролировать условия очистки, наш опыт и отзывы клиентов подтверждают, что это сложный, длительный и трудоемкий процесс.

    Invitrogen ™ RNA позже ™ и Invitrogen ™ RNA позже Стабилизирующие растворы для РНК ™ -ICE предоставляют больше гибкости и времени, позволяя исследователю отложить очистку РНК на несколько дней, недель или даже месяцев после сбора ткани без ущерба для целостности РНК.Вскрытые ткани, биологические жидкости или собранные клетки просто вводятся в раствор РНК , затем раствор при комнатной температуре или в раствор РНК , затем раствор -ICE, если он заморожен. Раствор проникает в клетки и стабилизирует РНК. Затем образцы хранят при 4 ° C с использованием реагента RNA , позже или при –20 ° C, если используют RNA позже -ICE RNA Stabilization Solution. Образцы можно транспортировать на влажном льду или даже при комнатной температуре, если они отправляются на ночь. На рисунке 1 показана целостность РНК, выделенной из тканей, хранящихся в РНК , а затем в реагенте при 4 ° C, комнатной температуре и даже при 37 ° C в течение продолжительного времени.Образцы, хранящиеся при 4 ° C, генерируют неповрежденную РНК даже после хранения в течение месяца.

    Рис. 1. Качество РНК, выделенной из ткани, хранящейся в РНК позже реагент . Ткани хранили в реагенте RNA , а затем в реагенте в течение указанного времени, и РНК очищали из тканей с использованием реагента Invitrogen ™ TRIzol ™. Эквивалентные массовые количества каждого образца РНК анализировали с помощью прибора Agilent® 2100 Bioanalyzer ™. На верхней панели показаны 2100 следов очищенной РНК с помощью биоанализатора.Нижняя панель показывает урожай на основе измерения A260.


    Использование РНК позже Раствор для хранения тканей совместим с большинством процедур выделения РНК. Ткани, хранящиеся в РНК , а затем в растворе просто удаляются и обрабатываются путем гомогенизации с помощью гомогенизатора Даунса, Polytron (Brinkmann), разрыва гранул или другого механического устройства в буфере для лизиса, указанном в вашей процедуре выделения РНК. На рисунке 2 показана РНК, выделенная из ткани, хранящейся в растворе РНК позже с использованием нескольких методов, и показано, что на качество РНК, выход и обнаружение сигнала в RT-qPCR с помощью анализа Applied Biosystems ™ TaqMan® не влияет последующее хранение в RNA раствор.


    Рис. 2. Совместимость различных методов выделения РНК с тканями, хранящимися в реагенте RNA позже . Свежесеченные целые печень и сердце мыши разделяли и либо немедленно обрабатывали, либо помещали в раствор РНК , а затем раствор и хранили при 4 ° C в течение трех дней перед обработкой с реагентом TRIzol или набором Invitrogen ™ PureLink ™ или Applied Biosystems ™ MagMAX ™ - Набор из 96 тотальных РНК. Равные массовые количества (X мкг) каждого очищенного образца ткани с РНК анализировали с помощью прибора Agilent 2100 Bioanalyzer.На верхней панели показаны следы очищенных образцов от прибора 2100 Bioanalyzer. Нижняя панель показывает выход каждого образца РНК на основе измерения A260

    Широко доступен ряд технологий получения РНК, которые можно разделить на четыре основных метода: методы органической экстракции, форматы спиновых корзин, методы магнитных частиц и методы прямого лизиса.Несмотря на то, что все они могут быть использованы для получения высококачественной РНК, подходящей для широкого спектра методов анализа, при выборе правильной технологии очистки необходимо учитывать несколько факторов.

    Является ли образец особенно трудным в управлении?

    • Ткани с высоким содержанием нуклеаз или жировых тканей, а также образцы с высоким содержанием ингибиторов могут представлять особые проблемы.

    Сколько пробы нужно обработать?

    • Для образцов большего размера требуются наборы с масштабируемым химическим составом.Как правило, чем больше образец, тем ниже производительность.

    Какая требуется пропускная способность?

    • Некоторые форматы особенно хорошо подходят для более высоких уровней производительности и автоматизации.

    Органические методы экстракции

    Методы органической экстракции считаются золотым стандартом для получения РНК.Во время этого процесса образец гомогенизируется в фенолсодержащем растворе, а затем образец центрифугируется. Во время центрифугирования образец разделяется на три фазы: нижнюю органическую фазу, среднюю фазу, содержащую денатурированные белки и гДНК, и верхнюю водную фазу, содержащую РНК. Верхнюю водную фазу выделяют, а РНК собирают путем осаждения спиртом и регидратации.

    Преимущества органической экстракции

    • Быстрая денатурация нуклеаз и стабилизация РНК
    • Масштабируемый формат

    Недостатки органической экстракции

    • Использование и попутные отходы хлорорганических реагентов
    • Трудоемкая и ручная обработка
    • Сложно автоматизировать

    Форматы вращающейся корзины на основе фильтров

    Форматы вращающихся корзин на основе фильтров используют мембраны (обычно из стекловолокна, дериватизированного кремнезема или ионообменные мембраны), которые устанавливаются на дне небольшой пластиковой корзины.Образцы лизируются в буфере, который содержит ингибиторы РНКазы (обычно соли гуанидина), и нуклеиновые кислоты связываются с мембраной, пропуская лизат через мембрану с использованием центробежной силы. Промывочные растворы затем пропускают через мембрану и выбрасывают. Применяется соответствующий элюирующий раствор, и образец собирается в пробирку центрифугированием. Некоторые форматы можно обрабатывать центрифугированием или вакуумом с использованием специализированных коллекторов. Также существуют гибридные методы, сочетающие эффективность органической экстракции с простотой сбора, промывки и элюирования образцов с вращающейся корзиной.

    Преимущества форматов вращающихся корзин

    • Удобство и простота использования
    • Подходит для обработки одного образца и 96-луночной обработки
    • Возможность автоматизации
    • Возможность изготовления мембран различных размеров

    Недостатки форматов спиннинговых корзин

    • Склонность к засорению твердыми частицами
    • Удержание крупных нуклеиновых кислот, таких как гДНК
    • Фиксированная переплетная способность в производственном формате
    • При автоматизации, требования для сложных вакуумных систем или центрифугирования

    Методы магнитных частиц

    В методах магнитных частиц используются малые (0.5–1 мкм) частицы, которые содержат парамагнитное ядро ​​и окружающую оболочку, модифицированную для связывания с интересующими объектами. Парамагнитные частицы мигрируют под воздействием магнитного поля, но сохраняют минимальную магнитную память после удаления поля. Это позволяет частицам взаимодействовать с интересующими молекулами на основе модификаций их поверхности, быстро собираться с использованием внешнего магнитного поля, а затем легко ресуспендировать после удаления поля. Образцы лизируют в растворе, содержащем ингибиторы РНКазы, и позволяют связываться с магнитными частицами.Магнитные частицы и связанный с ними груз собираются путем приложения магнитного поля. После нескольких циклов высвобождения, ресуспендирования в промывочных растворах и повторного улавливания РНК высвобождается в элюирующий раствор, и частицы удаляются.

    Преимущества очистки с помощью магнитных частиц

    • Нет риска засорения фильтра
    • Кинетика связывания на основе раствора увеличивает эффективность захвата цели
    • Магнитный формат позволяет быстро собирать / концентрировать образец
    • Повышенная простота внедрения на инструментальных платформах
    • Возможность автоматизации
    • Широкий выбор химического состава поверхности

    Недостатки магнитных частиц

    • Потенциальный перенос магнитных частиц в элюированные образцы
    • Медленная миграция магнитных частиц в вязких растворах
    • Улавливание / высвобождение частиц вручную может быть трудоемким

    Методы прямого лизиса

    Методы прямого лизиса

    осуществляют подготовку образца (не очистку) с использованием составов буфера для лизиса, которые разрушают образцы, стабилизируют нуклеиновые кислоты и совместимы с последующим анализом.Обычно образец смешивают с лизирующим агентом, инкубируют в течение некоторого времени в определенных условиях, а затем используют непосредственно для последующего анализа. При желании образцы часто можно очистить от стабилизированных лизатов. Устраняя необходимость связывания и элюирования с твердых поверхностей, методы прямого лизиса могут избежать смещения и эффектов эффективности восстановления, которые могут возникнуть при использовании других методов очистки.

    Преимущества методов прямого лизиса
    Очень быстро и просто

    • Максимальный потенциал для точного представления РНК
    • Может работать с очень маленькими образцами
    • Поддается простой автоматизации
    • Масштабируемый

    Недостатки методов прямого лизиса

    • Невозможность использовать традиционные аналитические методы, такие как спектрофотометрическое измерение урожайности
    • На основе разбавления (наиболее полезно для концентрированных образцов)
    • Потенциал неоптимальной производительности, если не будет разработан / оптимизирован с последующим анализом
    • Возможна остаточная активность РНКазы при неправильном обращении с лизатами

    Наборы для выделения РНК Invitrogen ™ Ambion ™ обеспечивают гибкость в отношении размера, типа и формата образца, а также включают наборы для выделения общей или поли (A) РНК.Для получения дополнительной информации о том, сколько примерно общей или поли (A) РНК можно восстановить из определенного количества ткани или клеток, см. Техническую информацию, прилагаемую к каждому набору, или обратитесь в службу технической поддержки Thermo Fisher Scientific.

    Шаг 3: Количественное определение изолированной РНК

    Количественный анализ

    РНК - важный и необходимый шаг перед большинством методов анализа РНК.Здесь мы обсуждаем три общих метода, используемых для количественного определения РНК, и советы по оптимизации каждого из этих методов.

    УФ-спектроскопия

    Традиционным методом оценки концентрации и чистоты РНК является УФ-спектроскопия. Поглощение разбавленного образца РНК измеряется при 260 и 280 нм.Концентрация нуклеиновой кислоты рассчитывается с использованием закона Бера-Ламберта, который предсказывает линейное изменение оптической плотности с концентрацией (рис. 3).

    Рис. 3. Закон Бера-Ламберта для расчета УФ-поглощения нуклеиновой кислотой.

    Используя это уравнение, значение A 260 , равное 1,0, эквивалентно ~ 40 мкг / мл одноцепочечной РНК. Отношение A 260 / A 280 используется для оценки чистоты РНК. Соотношение A 260 / A 280 равно 1.8–2.1 указывает на высокоочищенную РНК. УФ-спектроскопия - наиболее широко используемый метод количественного определения РНК. Он прост в исполнении, и УФ-спектрофотометры доступны в большинстве лабораторий. У метода есть несколько недостатков, но их можно минимизировать, следуя этим советам:

    • Этот метод не делает различий между РНК и ДНК, и рекомендуется сначала обработать образцы РНК ДНКазой, не содержащей РНКаз, для удаления загрязняющей ДНК.
    • Другие загрязнители, такие как остаточные белки и фенол, могут влиять на показания абсорбции, поэтому при очистке РНК необходимо соблюдать осторожность, чтобы удалить их.
    • Показания пробы снимаются в кварцевых кюветах. Грязные кюветы и частицы пыли вызывают рассеяние света на длине волны 320 нм, что может повлиять на поглощение на длине волны 260 нм. Поскольку ни белки, ни нуклеиновые кислоты не поглощают при 320 нм, выполните коррекцию фона, сняв показания с холостого образца (только для разбавителя) при 320 нм, а также при 260 нм и 280 нм.
    • Отношение A 260 / A 280 зависит как от pH, так и от ионной силы. По мере увеличения pH A 280 уменьшается, в то время как A 260 не изменяется.Это приводит к увеличению отношения A 260 / A 280 [1]. Поскольку вода часто имеет кислый pH, она может снизить соотношение A 260 / A 280 . Мы рекомендуем использовать буферный раствор со слабощелочным pH, например TE (pH 8,0), в качестве разбавителя (и в качестве холостого опыта) для обеспечения точных и воспроизводимых показаний. Пример изменения соотношения A 260 / A 280 при различных значениях pH показан на рисунке 4.
    • Убедитесь, что разведение вашей РНК находится в линейном диапазоне вашего спектрофотометра.Обычно значения оптической плотности должны находиться в диапазоне от 0,1 до 1,0. Растворы, которые дают показания за пределами этого диапазона, не могут быть точно измерены. Обычно наибольшая ошибка происходит при более низких концентрациях.

    Рис. 4. Влияние pH на соотношение A 260 / A 280 .

    Флуоресцентные красители

    Некоторые флуоресцентные красители, такие как реагент РНК Invitrogen ™ Quant-iT ™ RiboGreen ™, проявляют значительное усиление флуоресценции при связывании с нуклеиновыми кислотами.Всего лишь 1 нг / мл РНК можно обнаружить и количественно определить с помощью реагента RiboGreen со стандартным флуорометром, флюоресцентным микропланшетным ридером или фильтром-флуорометром. Для точного количественного определения РНК неизвестные значения наносятся на стандартную кривую, полученную с образцом известной концентрации, обычно на основе его поглощения при 260 нм. Линейный диапазон количественного определения с реагентом RiboGreen может увеличиваться на три порядка (от 1 нг / мл до 1 мкг / мл) при использовании двух различных концентраций красителя. Кроме того, анализы Quant-iT RiboGreen RNA Reagent относительно нечувствительны к загрязнителям, не связанным с нуклеиновыми кислотами, которые обычно встречаются в препаратах нуклеиновых кислот, поэтому линейность сохраняется.Этот метод количественного определения РНК можно оптимизировать, используя следующие советы:

    • Помимо РНК, реагент Quant-iT RiboGreen RNA Reagent может связываться с ДНК и флуоресцировать. Перед количественным анализом рекомендуется обработать образцы РНК ДНКазой, не содержащей РНКаз, для удаления загрязняющих ДНК.
    • Реагент Quant-iT RiboGreen для РНК может адсорбироваться на стенках пробирки. Это можно свести к минимуму, приготовив растворы в полипропиленовой пластиковой посуде, не содержащей нуклеазы.
    • Защитите реагент RiboGreen RNA Reagent от фотодеградации, обернув контейнер фольгой, и используйте реагент в течение нескольких часов после приготовления.
    • Избегайте повторных циклов замораживания-оттаивания стандартов РНК. Это может вызвать разрыв цепи РНК, что приведет к снижению связывания красителя. Кроме того, нуклеиновые кислоты могут абсорбироваться в пробирки с повторяющимися циклами замораживания-оттаивания. Это явление становится более выраженным при более низких концентрациях.

    Биоанализатор Agilent 2100

    В приборе Agilent 2100 Bioanalyzer используется комбинация микрофлюидики, капиллярного электрофореза и флуоресцентного красителя, который связывается с нуклеиновой кислотой, для оценки концентрации и целостности РНК.После заполнения лабораторного чипа Bioanalyzer ™ разделительной матрицей, лестницу РНК и образцы загружают в определенные лунки на чипе. Информация о размере и массе обеспечивается флуоресценцией молекул РНК, когда они движутся по каналам чипа. Программное обеспечение прибора автоматически сравнивает площади пиков неизвестных образцов РНК с объединенной площадью шести пиков лестничной РНК Agilent® RNA 6000 для определения концентрации неизвестных образцов. Система Agilent® RNA 6000 Nano имеет широкий динамический диапазон и может количественно определять 25–500 нг / мкл РНК, а система Agilent® RNA 6000 Pico Chip System может определять 50–5000 пг / мкл РНК.

    Возможно, наиболее мощной особенностью прибора Agilent 2100 Bioanalyzer является его способность предоставлять информацию о целостности РНК. Когда каждый образец РНК анализируется, программа генерирует гелеобразное изображение и электрофореграмму. При анализе общей РНК используется алгоритм анализа для оценки целостности образца РНК (число целостности РНК или RIN) с максимальным значением 10. Значительное уменьшение RIN указывает на деградацию общей РНК.

    Шаг 4: Хранение изолированной РНК

    Последним шагом в каждом протоколе выделения РНК, будь то для получения общей или мРНК, является ресуспендирование осадка очищенной РНК.После кропотливой подготовки образца РНК крайне важно, чтобы РНК была приостановлена ​​и хранилась в безопасной среде, свободной от РНКаз. Мы рекомендуем хранить РНК при –80 ° C в одноразовых аликвотах, ресуспендированных в одном из нескольких растворов для хранения РНК, предназначенных для этой цели:

    • Invitrogen ™ Раствор для хранения РНК (1 мМ цитрат натрия, pH 6,4 ± 0,2)
    • 0,1 мМ ЭДТА (в сверхчистой воде, обработанной DEPC)
    • TE Buffer (10 мМ трис-HCl, 1 мМ EDTA, pH 7,0)
    • Invitrogen ™ RNA secure ™ Resuspension Solution

    TE и 0.Растворы 1 мМ ЭДТА часто указываются в общих протоколах выделения и анализа РНК. Эти решения для хранения идеальны для исследователей, которые уже используют их, но хотели бы, чтобы они были заранее изготовлены и не содержали РНКазы в удобстве и безопасности.

    Мы также представили THE RNA Storage Solution, буфер, который обеспечивает большую стабильность РНК, чем 0,1 мМ EDTA или TE. Раствор для хранения РНК имеет две особенности, которые сводят к минимуму гидролиз РНК основанием: низкий pH и цитрат натрия, который действует как буфер pH и хелатирующий агент (двухвалентные катионы катализируют гидролиз оснований РНК).Раствор для хранения РНК совместим со всеми распространенными приложениями РНК, такими как обратная транскрипция, трансляция in vitro, северный анализ и тесты на защиту от нуклеаз.

    Invitrogen ™ RNA secure ™ Inactivation Reagent - уникальный неферментативный реагент для необратимой инактивации РНКаз в ферментативных реакциях. Он поставляется в 25-кратной концентрации и может быть добавлен к образцам для инактивации РНКаз. RNAsecure Resuspension Solution содержит те же активные ингредиенты, что и RNAsecure Reagent, но поставляется в рабочей концентрации для прямого ресуспендирования гранул РНК.Для инактивации РНКаз осадок РНК ресуспендируют в растворе для ресуспендирования RNAsecure и нагревают до 60 ° C в течение 10 минут. Уникальной особенностью решения RNAsecure является то, что повторный нагрев после начальной обработки реактивирует агент, разрушающий РНКазы, чтобы минимизировать любые новые загрязнения.

    Мы постоянно изобретаем способы упростить анализ РНК. Мы тесно сотрудничаем с нашими клиентами и коллегами, чтобы предоставить уникальные продукты для решения проблем, с которыми часто сталкиваются исследователи при работе с РНК.Технология Invitrogen Ambion лежит в основе РНК , а затем и решения , наборов для выделения РНК и растворов для хранения РНК. Решения Invitrogen Ambion для анализа РНК разработаны для совместной работы и проведут вас на всем пути от сбора образцов до приложения для анализа РНК. Если у вас есть предложения по дополнительным продуктам, которые могут быть полезны в вашем исследовании РНК, свяжитесь с нами.

    1.Wilfinger WW, Mackey K, и Chomczynski P (1997) Влияние pH и ионной силы на спектрофотометрическую оценку чистоты нуклеиновых кислот. Биотехники 22: 474481.

    Только для исследовательских целей. Не предназначен для использования в лечебных или диагностических целях на людях или животных.

    .

    Рабочий процесс для определения эффективности сплайсинга пре-мРНК в масштабе всего генома на основе данных дрожжевой РНК-seq

    Сплайсинг пре-мРНК представляет собой важный регуляторный слой экспрессии эукариотических генов. В простых почкующихся дрожжах Saccharomyces cerevisiae около одной трети всех молекул мРНК подвергаются сплайсингу, и эффективность сплайсинга жестко регулируется, например, во время мейотической дифференцировки. S. cerevisiae отличается усовершенствованным, эволюционно высококонсервативным оборудованием для сплайсинга и служит популярной моделью для изучения различных аспектов сплайсинга.RNA-seq представляет собой надежный, универсальный и доступный метод опроса транскриптомов, который также можно использовать для изучения эффективности сплайсинга. Однако отсутствуют удобные инструменты биоинформатики для анализа эффективности сплайсинга из данных дрожжевой РНК-seq. Мы представляем полный рабочий процесс для расчета эффективности сплайсинга в масштабе всего генома в S. cerevisiae с использованием специфичных для цепи данных РНК-seq. Наш конвейер выполняет считывание секвенирования в формате FASTQ и предоставляет значения эффективности сплайсинга для 5 'и 3' сплайсинговых соединений каждого интрона.Конвейер основан на современных программных инструментах с открытым исходным кодом и требует очень ограниченного ввода от пользователя. Мы предоставляем все необходимые скрипты в готовом к использованию виде. Мы демонстрируем функциональность рабочего процесса с использованием наборов данных RNA-seq из трех мутантов сплайсосом. Рабочий процесс должен оказаться полезным для исследования мутантов сплайсинга дрожжей или регулируемого сплайсинга, например, в определенных условиях роста.

    1. Введение

    У эукариот кодирующие части генов, экзоны, прерываются некодирующими частями, интронами.Процесс, посредством которого интроны удаляются и экзоны соединяются вместе, называется сплайсингом. Это происходит через две последовательные реакции переэтерификации, которые катализируются сплайсосомой, большим динамическим рибонуклеопротеиновым комплексом, состоящим из пяти частиц snRNP (U1, U2, U4 / U6 и U5) и других связанных белковых комплексов, таких как Девятнадцатый комплекс (NTC в дрожжах ; CDC5L у млекопитающих) (обзор в [1]). Сплайсинг должен происходить очень точно, так как даже сдвиг одного нуклеотида может привести к сдвигу рамки считывания, что может вызвать множество заболеваний, включая рак [2, 3].Следовательно, регуляция сплайсинга играет важную роль в экспрессии генов.

    Интроны определяются коровыми последовательностями, включающими 5'-сайт сплайсинга, сайт разветвления и 3'-сайт сплайсинга. У многоклеточных животных необходимы дополнительные последовательности для набора различных регуляторных факторов, действующих на trans, , которые модулируют связывание субъединиц сплайсосомы и выбор и эффективность сайта сплайсинга, определяя результат сплайсинга. Это особенно важно для альтернативного сплайсинга (см. [4]).

    В отличие от высших эукариот, чьи гены обычно содержат несколько коротких экзонов, чередующихся с интронами длиной до нескольких килобаз [5], структура гена у почкующихся дрожжей Saccharomyces cerevisiae намного проще. Только пять процентов из почти 6000 генов дрожжей содержат интроны, обычно всего один [6]. Однако гены, содержащие интроны, очень сильно экспрессируются. В результате сплайсируется около трети всех транскриптов [7]. Консенсусные последовательности сигналов сплайсосомы ядра дрожжей хорошо определены (GUAUGU для 5'-сайта сплайсинга, UACUA A C для сайта ветвления с ветвлением A жирным шрифтом и AG для 3'-сайта сплайсинга) [6].Кроме того, существует лишь несколько случаев альтернативного сплайсинга у почкующихся дрожжей (рассмотрено в [8]), и регуляция эффективности сплайсинга играет более важную роль, например, во время мейоза [9] или при стрессе окружающей среды [10, 11]. Например, конститутивно транскрибируемый интрон, содержащий гены REC107 , AMA1 , SPO22 и MER3 , эффективно сплайсируется и процессируется с образованием функциональных мРНК только во время мейоза, когда фактор сплайсинга Mer1 экспрессируется [9, 12– 14].Кроме того, различные стрессы окружающей среды могут приводить к различным изменениям в эффективности сплайсинга в определенных группах генов: аминокислотное голодание ингибирует сплайсинг генов рибосомных белков, тогда как этанольный стресс не влияет на эту группу генов, но изменяет сплайсинг в другой группе [10, 11].

    Сплайсосома дрожжей состоит из ~ 90 белков, то есть примерно половины белков, идентифицированных в сплайсосоме человека. Однако почти все компоненты сплайсосом дрожжей имеют аналоги у человека.Поэтому было высказано предположение, что сплайсосома S. cerevisiae представляет собой эволюционно консервативное ядро ​​аппарата сплайсинга. Соответственно, многие из специфичных для человека сплайсосомных белков необходимы для регуляции альтернативного сплайсинга, функции, почти отсутствующей у почкующихся дрожжей [15]. Это, вместе с простотой культивирования и генетических манипуляций, привело к тому, что почкующиеся дрожжи стали излюбленной моделью для изучения основных механизмов сплайсинга пре-мРНК.

    Чтобы изучить влияние генетических нарушений или условий окружающей среды на сплайсинг, важно количественно оценить эффективность сплайсинга. Эффективность сплайсинга традиционно рассчитывается как количество мРНК, деленное на количество пре-мРНК. Золотым стандартом количественной оценки мРНК и пре-мРНК является использование количественной ПЦР (RT-qPCR) с праймерами, охватывающими соединения экзон-интрон и экзон-экзон (например, [16]). Однако этот подход применим для измерения уровней мРНК и пре-мРНК только для ограниченного числа генов.Напротив, сверхвысокопроизводительное секвенирование РНК (RNA-seq) позволяет проводить всесторонний анализ сплайсинга в масштабе всего генома [17-19]. Существует несколько парадигм для расчета эффективности сплайсинга на основе данных RNA-seq, которые основаны на сравнении счетчиков считывания секвенирования из интронных и экзонных областей или также учитывают считывания экзон-экзонных соединений (транс-считывания). Методы также различаются по длине рассматриваемого окна (например, 25 п.н. вокруг сайта сплайсинга по сравнению с целым экзоном) [17, 18, 20–24].RNA-seq - это простой, надежный и доступный метод, и сейчас существует множество общедоступных наборов данных RNA-seq [25, 26]. Все вместе это делает RNA-seq удобным методом для определения эффективности сплайсинга в масштабе всего генома, хотя биоинформатический анализ может оказаться сложной задачей для неспециалистов. Здесь мы представляем полный и документированный современный рабочий процесс для полуавтоматического расчета эффективности сплайсинга в масштабе всего генома на основе данных цепочки специфичных РНК-seq в S. cerevisiae .

    2. Материалы и методы
    2.1. Наборы данных RNA-seq

    Секвенирование считывает из нити-специфического профилирования транскриптома сплайсинговых мутантов ( prp45 (1-169), prp4-1 и prp40-1 ) и их соответствующих S. cerevisiae дикого типа штамма [17, 24] были загружены из Европейского архива нуклеотидов (http://www.ebi.ac.uk/ena) в формате FASTQ (более подробную информацию о различных форматах файлов, используемых в этом исследовании, можно найти по адресу https: // геном.ucsc.edu/FAQ/FAQformat.html), а метаданные эксперимента были получены из ArrayExpress (https://www.eabi.ac.uk/arrayexpress/). Соответствующие номера доступа к базе данных приведены в таблице 1. Важно отметить, что для упрощения последующего анализа из наборов данных секвенирования с парным концом использовались только файлы FASTQ «чтение 1».

    90 056 прп4-1

    Генотип ArrayExpress в соотв. ENA в соотв. Длина чтения (нт) Общее количество чтений Чтений с MAPQ ≥ 10 % чтений с MAPQ ≥ 10

    WT E-MTAB-5149 ERR1709739 100 27 789 829 25 329 092 91,2%
    ERR1709740 100 22 000 062 20 402 556 92,7%
    прп45 (1-169) E-MTAB-5149 ERR1709737 100 27 842 215 25 491 566 91,6%
    ERR1709738 100 25 156 639 23 359 541 92,9%
    WT E-GEOD-44219 SRX233529 100 21012048 17 127 536 81,5%
    E-GEOD-44219 SRX233535 100 17 142 559 14 457015 84,3%
    WT E-GEOD-49966 SRR953535 101 35203 753 7 655225 21,8%
    prp40-1 E-GEOD-49966 SRR953537 101 17326529 3 596 304 20,8%

    номер для базы данных ArrayExpress (https: // www.ebi.ac.uk/arrayexpress/). Номер
    для Европейского архива нуклеотидов (http://www.ebi.ac.uk/ena).

    Конвейер требует, чтобы использовались данные чтения последовательности, специфичные для цепочки (верно для большинства генерируемых в настоящее время наборов данных RNA-seq). Поскольку о всеобъемлющей антисмысловой транскрипции сообщалось у многих эукариотических организмов, включая дрожжи [27], специфичность цепочки считывания секвенирования помогает разделить вклады потенциальных перекрывающихся смысловых / антисмысловых транскриптов.

    Качество считывания при секвенировании и потенциальное загрязнение адаптерами и / или праймерами для ПЦР проверяли с помощью FastQC 0.11.5 (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/). Все наборы данных были признаны подходящими для дальнейшего анализа. Однако при необходимости загрязненные и низкокачественные последовательности можно отфильтровать и / или обрезать с помощью таких инструментов, как Trimmomatic [28].

    2.2. Картирование считывания

    Считывания были сопоставлены с геномом S. cerevisiae (Ensembl R64-1-1) с помощью быстрого выравнивателя HISAT2 с поддержкой сплайсинга (версия 2.0.4) с использованием индекса генома S. cerevisiae , содержащего структуры транскриптов [29]. Параметры минимальной и максимальной длины интрона были установлены равными 20 и 10000 нуклеотидов соответственно. Более подробную информацию о настройках параметров HISAT2 можно найти в сценарии оболочки «workflow.sh» в дополнительных материалах, доступных в Интернете по адресу http://dx.doi.org/10.1155/2016/4783841.

    Впоследствии, samtools 1.3.1 использовались для фильтрации чтений по их показателю качества отображения (MAPQ ≥ 10), чтобы сохранять только те чтения, которые однозначно выровнены с одним локусом, а также для сортировки и индексации полученных файлов BAM [30].Отображение чтения также оценивалось визуально в браузере IGV 2.3.69 [31].

    Мы также попытались согласовать чтения из наборов данных, связанных с PRP45 , с TopHat2 [32], широко используемым предшественником HISAT2. По сравнению с TopHat2, этап выравнивания HISAT2 был примерно в 2 раза быстрее, а отображение поддерживало идентификацию примерно на 11% большего числа трансридеров и расчет эффективности сплайсинга для примерно 4% большего количества сайтов сплайсинга.

    2.3. Идентификация места сплайсинга и подсчет Transreads

    Предполагаемые события сплайсинга были обнаружены regtools 0.2.0 (https://regtools.readthedocs.io/en/latest/). Эти инструменты ищут предполагаемые трансчиты (считывания, охватывающие соединение экзон-экзон) в файлах BAM, составляют таблицу всех идентифицированных предполагаемых сайтов сплайсинга и их характеристик, а также предоставляют количество трансчиток, охватывающих эти сайты сплайсинга. Параметры минимальной и максимальной длины интрона были установлены равными 20 и 10000 нуклеотидов соответственно. Обнаруженные сайты сплайсинга также были аннотированы и классифицированы как известные или новые с использованием regtools и аннотации генома S. cerevisiae (Ensembl R64-1-1) в формате GTF.Выходные данные regtools были дополнительно обработаны, и координаты оснований на самых 5 'и 3' концах каждого известного интрона были извлечены (в формат BED) с помощью специального сценария R (версия R 3.3.1, https: //www.r -project.org/). См. Сценарии «workflow.sh» и «junctions.R» в дополнительных материалах для получения более подробной информации.

    2.4. Определение покрытия конца интрона 5 'и 3'

    Покрытие считыванием самого первого (5 'конец) и самого последнего (3' конец) основания каждого известного интрона определяли из всех файлов BAM параллельно с использованием программных средств 2.25.0 (постельные мультики) [33]. Очень важно установить параметр -split , чтобы избежать включения перечитываний в счетчик интронного чтения. Также важно правильно установить параметры -s / -S в соответствии с используемым протоколом подготовки библиотеки секвенирования, чтобы гарантировать, что будут учитываться только чтения, сопоставленные с «смысловой» цепью (см. Сценарий «workflow.sh» в дополнительном материале).

    2,5. Расчет эффективности сращивания

    Метод расчета эффективности сращивания был основан на методе «соотношения сайтов 3 'сращивания», описанном в [20].Для каждого интрона эффективность сплайсинга определяли отдельно для 5'-сайта сплайсинга и 3'-сайта сплайсинга с использованием следующих формул:

    .Выделение РНК

    и протокол: клетки в культуре

    Альтернативный подход к вышеупомянутому может включать следующее:

    Требуется всего 20 мкл смеси, не содержащей RT, на образец. Произвольно выберите два или три образца из группы и подготовьте контроли без ОТ, аликвотируя 28 мкл каждого образца в пробирки объемом 0,5 мл и добавляя 1 мкг РНК в каждую вместе с дополнительными 2 мкл обработанного DEPC H 2 O ( необязательно).

    К оставшейся мастер-смеси RT добавить 2 мкл MMLV RT на готовую пробу, перемешать встряхиванием и затем аликвотировать 30 мкл на пробирку для каждого образца.Например, если у вас всего 10 образцов, вы выполните обратную транскрипцию всех 10, но захотите дополнительно 2 или 3 образца для отсутствия контроля RT, чтобы гарантировать, что этап обработки ДНКазой сработал. Таким образом, вы должны умножить вышеупомянутый мастер-микс на 7 или 8. 1X мастер-микс предназначен для двух семплов.

    Таким образом, если вам нужно всего 12 реакций (как для RT, так и для реакций без RT), то вам понадобится коктейль мастер-микс 6X. После приготовления, аликвотируйте два образца без RT (28 мкл каждый), добавьте 20 мкл MMLV RT (2 мкл / образец) к мастер-миксу.Смесь перемешайте на вортексе, затем аликвотируйте 30 мкл на пробирку для 10 пробирок. К каждому добавьте соответствующий 1 мкг (10 мкл) РНК и инкубируйте, как указано выше.

    .

    Смотрите также