• Выделение рнк из крови


    Очистка РНК — наборы для выделения и очистки РНК

    Более 40  наборов на выделение  РНК для различных приложений,  включая сложные задачи: выделение циркулирующей РНК из крови и мочи, тотальной РНК из почвы, парафиновых блоков, цитоплазматической и ядерной рибонуклеиновой кислоты из культур клеток и тканей.   А также, наборы для концентрирования и очистки уже выделенных  образцов, экстракции микроРНК и др. 

    Выделение тотальной РНК включая микроРНК

    Наборы Total RNA Purification

    Наборы Total RNA Purification Plus

    Набор Total RNA Purification Micro

    Набор Total RNA Purification Plus Micro

    Набор Animal Tissue RNA Purification

    Набор microRNA Purification

    Набор Single Cell RNA Purification

    Набор Fatty Tissue RNA Purification

    Очистка и концентрация микроРНК и тотальной рибонуклеиновой кислоты

    Набор RNA Clean-Up and Concentration для работы с РНК

    Набор RNA Clean-Up and Concentration Micro-Elute Kit

    Набор CleanAll RNA/DNA Clean-Up и Concentration

    Набор Oligo Clean-Up и Concentration Kit

    Выделение РНК из растений и окружающей среды

    Набор Plant/Fungi Total RNA Purification

    Набор Plant microRNA Purification

    Набор Plant RNA/DNA Purification

    Набор Soil Total RNA Purification

    Наборы Water RNA/DNA Purification- 0.45 µm и 0.22 µm

    Выделение РНК и микроРНК из парафиновых блоков

    Наборы FFPE RNA Purification

    Набор FFPE RNA/DNA Purification Plus

    Выделение рибонуклеиновой кислоты и микроРНК из мочи

    Наборы Urine Cell-Free Circulating RNA Purification (Mini, Midi, Maxi)

    Комбинированные наборы Urine Cell-Free Circulating и Viral Nucleic Acid Purification  (Mini, Midi, Maxi)

    Набор Urine Exfoliated Cell RNA Purification для работы с РНК

    Набор Urine microRNA Purification

    Набор Urine Total RNA Purification Maxi (жидкий формат)

    Набор Urine Exosome RNA Isolation

    Выделение РНК из крови/плазмы/сыворотки

    Наборы Plasma/Serum RNA Purification (Mini, Midi, Maxi)

    Набор Plasma/Serum RNA/DNA Purification Mini

    Наборы Plasma/Serum Circulating и Exosomal RNA Purification (Mini, Maxi)

    Наборы Plasma/Serum Cell-Free Circulating and Viral Nucleic Acid Purification (Mini, Midi, Maxi)

    Наборы Plasma/Serum Circulating Nucleic Acid Purification (Mini, Maxi)

    Наборы Leukocyte RNA Purification

    Набор Preserved Blood RNA Purification I (для использования с пробирками Tempus™ Blood RNA)

    Набор Preserved Blood RNA Purification II (для использования с пробирками PAXgene™ Blood RNA)

    Выделение цитоплазматической и ядерной РНК

    Набор Cytoplasmic and Nuclear RNA Purification

    Выделение н.к. из фекалий

    Набор Stool Total RNA Purification

    Набор Stool Nucleic Acid Isolation

    #13 Очистка нуклеиновых кислот: многообразие методов и подходов

    25.06.2020

    Одной из базовых методик практически в любом эксперименте является выделение нуклеиновых кислот. Причем, зачастую, от качества выделенной нуклеиновой кислоты зависит успех всего дальнейшего эксперимента, поэтому к подбору реагентов для экстракции НК стоит подходить ответственно. Мы решили рассмотреть различные технологии выделения НК, их особенности, преимущества и недостатки, чтобы вы смогли подобрать идеальное решение для ваших индивидуальных задач.

    Методы выделения НК, применяемые в современных коммерческих наборах

    Впервые нуклеиновые кислоты были выделены швейцарским физиологом Фридрихом Мишером в 1869 году. Он изучал химический состав животных клеток и заметил, что из ядер лейкоцитов можно выделить некое неизвестное ранее вещество – «нуклеин». Позже, благодаря кислотным свойствам этого вещества, его стали называть «нуклеиновая кислота». Технология выделения НК Фридриха Мишера была очень трудоемкой, она включала много сложных этапов и занимала несколько дней.

    Спустя 100 лет после открытия нуклеиновых кислот исследователи по всему миру стали широко использовать технологию фенол-хлороформного выделения.

    Рис.1 Схема протокола выделения НК фенол-хлороформным методом.

    В данной методике образец лизируют, а затем лизат смешивают с фенолом, хлороформом и изоамиловым спиртом. После центрифугирования эта смесь разделяется на две фазы, причем в нижней органической фазе остаются все жиры и липиды, в интерфазе – белки, а в верхней водной фазе – нуклеиновые кислоты (Рис.1). Для повышения чистоты экстракта эти действия повторяют несколько раз и таким образом получают выделенные и очищенные НК.

    Метод фенол-хлороформной экстракции широко распространен благодаря своей дешевизне, но он всё же уступает другим технологиям по качеству и выходу НК, а также требует сложных и длительных манипуляций, которые могут привести к контаминации и потере образца, а сам процесс трудно автоматизировать.

    В 1979 году американские учёные продемонстрировали, что при определённых условиях НК способны связываться с силикатами, что позволяет отделить все остальные компоненты клетки от частиц силики, со связанными НК. Их открытие легло в основу двух технологий: выделения НК на спин-колонках и на магнитных частицах.

    Спин-колонки сконструированы таким образом, что при нанесении лизированного образца на колонку и последующем центрифугировании НК остаются на кремниевой мембране колонки, а все остальные компоненты образца проходят сквозь неё (Рис.2). Затем НК можно промыть и элюировать в пробирку для сбора образца.

    Рис.2 Схема протокола выделения НК на спин-колонках.

    Основные преимущества метода - чистота и высокое качество выделенных нуклеиновых кислот, высокая воспроизводимость и простота по сравнению с выделением фенол-хлороформом. Однако также большое количество манипуляций может привести к контаминации, а выделение коротких фрагментов ДНК на спин-колонках может быть затруднено.

    Спустя 20 лет после появления метода выделения на спин-колонках становится популярным более быстрый способ выделения на магнитных частицах. Технология этого способа экстракции основана на связывании нуклеиновой кислоты с веществом, покрывающим магнитные частицы.

    Рис.3 Схема протокола выделения НК на магнитных частицах.

    К лизированному образцу добавляют такие магнитные частицы и перемешивают для связывания НК с ними. После этого пробирку ставят в магнитный штатив или подносят к магниту, фиксируя таким образом твердую фазу. После отбора супернатанта нуклеиновые кислоты на частицах промывают и элюируют (Рис.3).

    Этот метод так же хорош, как и выделение на спин-колонках, но для экстракции на магнитных частицах не нужно сложное оборудование (например, центрифуга), а сам процесс легко автоматизировать, и многие автоматические станции выделения основаны именно на этой технологии.

    Вы можете найти наборы для выделения НК от SkyGen у следующих брендов:

    Наборы для выделения НК от компании New England Biolabs

    Американская компания New England Biolabs представляет линейку наборов Monarch® для выделения и очистки нуклеиновых кислот:

    T3010 L/S

    Набор Monarch® для выделения геномной ДНК
    (150/50 реакций)

    T1030 L/S

    Набор Monarch® для очистки ДНК-продуктов ПЦР и ферментативных реакций
    (250/50 реакций)

    T1020 L/S

    Набор Monarch® для выделения ДНК из агарозного геля
    (250/50 реакций)

    T1010 L/S

    Набор Monarch® для выделения плазмидной ДНК, 20 мкг
    (150/50 реакций)

    T2030, T2040, T2050 L/S

    Набор Monarch® для очистки РНК-продуктов ферментативных реакций
    (100/10 реакций)

    Все наборы основаны на технологии выделения НК на спин-колонках и позволяют получить экстракт очень высокого качества.

    Основываясь на собственном опыте и отзывах наших клиентов, мы рекомендуем использовать набор Monarch® (Т3010 L/S) для выделения геномной ДНК для дальнейшего секвенирования на платформах Oxford Nanopore Technology (MinION, GridION, PromethION).

    Вы можете узнать подробнее об особенностях и преимуществах этого набора в нашем обзоре.

    В каталог  Продукция на сайте NEB  Линейка Monarch    

    Видеобиблиотека  Брошюра

    Продукция для выделения НК от компании Analytik Jena

    Все наборы для выделения НК от немецкой компании Analytik Jena основаны на технологии двойной химии (Dual Chemistry Technology, DC-Technology), которая была разработана и запатентована в 2005 году. Она основана на использовании буферов с содержанием хаотропных и нехаотропных солей с низкой ионной силой в определенной комбинации. Это позволяет НК прочнее связываться с твердой фазой, а также сокращать время выделения благодаря более эффективному лизису.

    innuPREP и blackPREP - линейки наборов для выделения НК на спин-колонках из широкого спектра образцов. В линейке blackPREP представлены колонки чёрного цвета, других отличий от innuPREP у этой линейки нет.

       

    В данных линейках представлены наборы для выделения НК из следующих типов биологических образцов:

    • Кровь
    • Ткани, клетки и мазки
    • Бактерии
    • Криминалистические образцы
    • Вирусные НК из биологических жидкостей, тканей и мазков
    • Растения
    • Фекалии
    • Образцы пищи
    • Клещи
    • Фрагменты хвостов грызунов
    • Мазки буккального эпителия
    • Парафиновые срезы = FFPE
    • Гели и смеси

    Для использования наборов innuPREP и blackPREP потребуется следующее оборудование:

    • Дозаторы
    • Вортекс
    • Термошейкер
    • Центрифуга до 10.000 g (~ 12.000 rpm)

    innuSPEED – линейка наборов для выделения НК на спин-колонках из сложнолизируемых образцов. Данная панель адаптирована под этап механического лизиса на гомогенизаторе (можно заменить на вортекс) в специальных пробирках с шариками. Такие пробирки со стеклянными, керамическими или стальными шариками различного размера уже входят в состав наборов, а также их можно приобрести отдельно и комбинировать с любыми другими наборами.


    Наборы innuSPEED позволяют выделять НК из следующих образцов:

    • Бактерии и грибы
    • Растения
    • Ткани
    • Почва

    Для использования наборов innuSPEED потребуется следующее оборудование:

    • Дозаторы 
    • Вортекс 
    • Гомогенизатор SpeedMill (или любой другой, а также можно заменить на вортекс) 
    • Термошейкер 
    • Центрифуга до 10.000 g (~ 12.000 rpm)

    Наряду с DC-Technology компания Analytik Jena разработала технологию SmartExtraction, которая основана на связывании НК с частицами с особой смарт-поверхностью. Это обеспечивает более эффективное связывание высокомолекулярной ДНК, а также уменьшение стресс-факторов за счет отсутствия этапов вортексирования и центрифугирования. Методика основана на выделении НК при помощи систем дозирования жидкостей. Для экстракции используют специальные наконечники с «умными» частицами, которые надеваются на дозатор. При заборе лизированного образца в наконечник нуклеиновая кислота из раствора связывается с частицами, затем следуют этапы промывки и элюции, в результате чего получается очищенная нуклеиновая кислота высокого качества (Рис.4).

    Рис.4 Схема протокола выделения НК при помощи технологии SmartExtraction.

    Так выглядит схема автоматической экстракции, но в портфолио Analytik Jena также присутствуют два набора для ручного выделения ДНК на магнитных частицах с такой «умной» поверхностью из крови и клеток и тканей.

    Каталог реагентов

    При больших потоках образцов и для упрощения этапа экстракции НК можно использовать автоматические решения от Analytik Jena:

    InnuPure C16 touch

    CyBio SELMA

    CyBio Felix

    Предназначена для эффективной и воспроизводимой экстракции ДНК/РНК при помощи технологий выделения на магнитных частицах, а также SmartExtraction. Полуавтоматическая компактная дозирующая система для раскапки 96- и 384-луночных планшетов.

    Можно адаптировать для выделения НК.

    Автоматическая дозирующая станция с гибкой модульной системой, которую легко трансформировать под индивидуальные задачи.

    Продукция для выделения НК от компании QIAGEN

    В нашем портфолио есть широкий спектр наборов для выделения НК от компании QIAGEN, причем особенность этих реагентов заключается в том, что можно подобрать набор под очень узкоспециализированную задачу в зависимости от типа выделяемой НК и биологического материала.

    Такие реагенты лучше всего подойдут пользователям с нестандартными задачами, например в каталоге QIAGEN есть наборы для выделения сцДНК, митохондриальной и космидной ДНК или микроРНК.

    Также есть наборы для элюции образца в очень малых объемах, для работы с архивными и сложнолизируемыми образцами, для выделения на спин-колонках, магнитных частицах или ферментативной экстракции в одной пробирке.

    Подробнее изучить наборы QIAGEN вы можете в каталоге на официальном сайте.

    В портфолио QIAGEN есть и автоматические станции для выделения НК:


           

    QIAcube Connect

    QIAcube HT

    QIAsymphony

    • Аналог ручного колоночного выделения
    • До 12 образцов одновременно
    • Совместим более чем с 80 наборами для выделения НК
    • Технология сорбции на кремниевой мембране
    • 24-96 образцов одновременно
    • Совместим с 7 наборами для выделения НК
    • Технология сорбции на магнитных частицах
    • 24 - 96 образцов одновременно
    • Совместим с модулем для ПЦР
    • Есть РУ

    Продукция для выделения НК от компании MicroGEM

    Новозеландская компания MicroGEM представляет уникальную технологию ферментативного температурно-зависимого выделения НК в одной пробирке. Она начинается со смешивания буфера и особых ферментов с биологическим образцом. При последующей инкубации при 75°C протеиназы разрушают клетки и высвобождают нуклеиновые кислоты. Дальнейшее нагревание до 95°C дезактивирует протеиназы, и после этого образец готов для дальнейшего исследования (Рис.5).

    Рис.5 Схема протокола ферментативного температурно-зависимого выделения НК.

    Эта технология очень простая и быстрая, и здесь отсутствуют потери НК, что позволяет работать даже с небольшим количеством образца. Однако, от этой технологии стоит отказаться, если для вас важна чистота выделяемой НК.

    Узнать больше о данной технологии вы можете в нашем обзоре.

    Наша команда научной поддержки может помочь с подбором идеального набора для ваших задач, для этого необходимо заполнить форму:

    Подобрать набор


    Топ-5 современных методик выделения нуклеиновых кислот

    Впервые нуклеиновые кислоты пытались выделить в середине XIX века, когда ещё практически ничего не было известно об этих молекулах. Однако с момента открытия структуры и свойств ДНК технологии её выделения непрерывно модифицируются и совершенствуются. В данной статье рассматриваются самые распространенные и прогрессивные методики, используемые для экстракции нуклеиновых кислот.

    Выделение фенол-хлороформом

    Рис.1. Схема протокола выделения фенол-хлороформным методом.

    Первое упоминание об использовании этого метода встречается в статье 1967 года 1, и с тех пор эта технология является одним из самых распространённых способов выделения нуклеиновых кислот.

    Суть методики заключается в смешивании клеточного лизата с фенолом, хлороформом и изоамиловым спиртом в пропорции 25:24:1 и последующем перемешивании и центрифугировании смеси. После проведения этих манипуляций получается раствор с двумя фазами: водной и органической, причем все липиды и жиры находятся в органической (нижней) фазе, белки — на границе фаз, а нуклеиновые кислоты — в водной (верхней) фазе 2 (Рис.1). Для повышения чистоты экстракта эти действия повторяют несколько раз. Если раствор будет иметь низкий pH, то ДНК перейдёт в органическую фазу, а РНК останется в водной фазе, что позволяет выделять РНК отдельно от ДНК.

    Данный метод используется повсеместно, поскольку он не требует дополнительного сложного оборудования и имеет невысокую стоимость. Однако нуклеиновые кислоты, полученные таким образом, обладают невысоким качеством и зачастую требуют дополнительной очистки. Также эта технология имеет существенно меньший выход нуклеиновых кислот в сравнении с другими методиками.

    Помимо качества экстракта, этот метод обладает ещё несколькими недостатками: он требует сложных манипуляций, которые могут привести к контаминации и потере образца, а сам процесс трудно автоматизировать. Также весь протокол занимает достаточно много времени 3

    Выделение на спин-колонках

     

    Рис.2. Схема протокола выделения на спин-колонках.

    Технология выделения на спин-колонках — это усовершенствованный метод экстракции на частичках силики, предложенный американскими учёными в 1979 году 4. Они продемонстрировали, что в щелочных условиях и при повышенных концентрациях соли ДНК связывается с силикатами, и это позволяет отделить все остальные компоненты клетки от частиц силики со связанной ДНК. Спин-колонки сконструированы таким образом, что при нанесении клеточного лизата на колонку и последующем центрифугировании ДНК остаётся на колонке, а всё лишнее проходит сквозь неё (Рис.2). Затем ДНК промывают несколько раз и элюируют в пробирку для сбора образца.

    Преимущества такого метода заключаются в повышенной чистоте и хорошем качестве выделенных нуклеиновых кислот, высокой воспроизводимости и простоте по сравнению с выделением фенол-хлороформом. Однако также большое количество манипуляций может привести к контаминации, а выделение коротких фрагментов ДНК на спин-колонках может быть затруднено 5.

    Экстракция на спин-колонках может занять от 20 минут в зависимости от биоматериала и сложности его лизиса. 

    На рынке этот метод представлен большим разнообразием наборов от таких производителей, как Qiagen, Analytik Jena, NEB, ThermoFisher и других. Стоимость одного выделения здесь значительно выше, чем у предыдущего метода, поскольку на каждую реакцию необходима своя колонка, несколько пробирок для сбора фильтрата и элюата и, конечно, реагенты.

    Выделение на магнитных частицах

     

    Рис.3. Схема протокола выделения на магнитных частицах.

    Спустя 20 лет после появления метода выделения на спин-колонках начинает набирать популярность более быстрый способ выделения на магнитных частицах 6. Технология этого способа выделения основана на связывании нуклеиновой кислоты с веществом, покрывающим магнитные частицы (целлюлоза, сефадекс, сефакрил, dT-олигонуклеотиды, специфичные олигонуклеотиды и др.). К клеточному лизату добавляют такие магнитные частицы и перемешивают для связывания ДНК с ними. После этого пробирку ставят в магнитный штатив или подносят к магниту, фиксируя таким образом твердую фазу. После отбора супернатанта нуклеиновые кислоты на частицах промывают и элюируют 7 (Рис.3).

    Этот метод имеет те же преимущества, что и выделение на спин-колонках, но для экстракции на магнитных частицах не требуется сложное лабораторное оборудование (например, центрифуга). Более того, процесс выделения на магнитных частицах легко автоматизировать, и многие автоматические станции выделения основаны именно на этой методике 3. Однако здесь также присутствует риск контаминации и потерь образца.

    Данный протокол выделения займет немного меньше времени благодаря отсутствию этапов центрифугирования, но количество манипуляций будет примерно таким же. Также стоимость одной реакции обычно выше, чем при выделении на колонках, а панели наборов предоставляют Qiagen, Analytik Jena,  ThermoFisher и другие.

    Умное выделение (Smart Extraction)

    Рис.4. Схема протокола умного выделения. Протокол основан на принципе работы наборов для выделения компании Analytik Jena.

    Методики выделения нуклеиновых кислот не перестают совершенствоваться: в 2005 году специалисты из компании Analytik Jena доказали, что для связывания нуклеиновых кислот с неорганической твёрдой фазой можно использовать не только хаотропные соли, но и смесь из хаотропных и нехаотропных солей с низкой ионной силой, эту технологию они назвали Dual Chemistry 8.

    Позднее они усовершенствовали технологию Dual Chemistry при помощи немагнитных частиц с «умной» поверхностью 9. Для выделения используются специальные наконечники с этими частицами, которые надеваются на дозатор. При заборе клеточного лизата в наконечник нуклеиновая кислота из раствора связывается с частицами, затем следуют этапы промывки и элюции, в результате чего получается очищенная нуклеиновая кислота высокого качества (Рис.4).

    Эта технология значительно ускоряет процесс выделения, а благодаря особенностям «умной» поверхности выход и качество нуклеиновых кислот значительно превосходит все предыдущие методы. Данный способ экстракции очень легко автоматизировать, ведь носики со связывающими частицами подходят как для обычных лабораторных дозаторов, так и для различных автоматических станций выделения нуклеиновых кислот.

    Ферментативное температурно-зависимое выделение

     

    Рис.5. Схема протокола ферментативного температурно-зависимого выделения. Протокол основан на принципе работы наборов для выделения компании MicroGEM. * — несмотря на невысокую степень очистки, образец отлично подходит для дальнейшего использования в ПЦР, секвенировании и STR.

    Все вышеперечисленные методики имеют общую лимитирующую стадию — этап лизиса. Во всех технологиях используется SDS и протеиназа K для разрушения клеточных стенок и высвобождения нуклеиновых кислот. SDS является ингибитором ПЦР, именно поэтому необходимы множественные стадии промывки, которые повышают риск контаминации и приводят к потерям образца. Также более сложные для лизиса образцы могут требовать дополнительную долгую и трудозатратную пробоподготовку.

    Специалисты из новозеландской компании MicroGEM ликвидировали проблемы, связанные с длительным и сложным лизисом и использованием вредных химикатов, благодаря применению очень эффективной термофильной протеиназы EA1 вместе с мезофильными гидролазами 10.

    Процесс ферментативного температурно-зависимого выделения начинается со смешивания буфера и ферментов с образцом. При последующей инкубации при комнатной температуре гидролазы деградируют клеточные стенки. После этого пробирку нагревают до 75°C, что активирует работу протеиназы EA1, которая разрушает все белки и высвобождает нуклеиновые кислоты. Последующее нагревание до 95°C дезактивирует EA1, и после этого образец готов для дальнейшего исследования (Рис.5). Для особо загрязненных образцов вроде почвы или растений можно добавить этап очистки на колонке для избавления от ингибиторов.

    Данная технология оптимальна для работы с малым количеством биоматериала, поскольку нет потерь нуклеиновых кислот. Также эту методику легко автоматизировать, она самая быстрая среди всех упомянутых способов выделения (от 7 минут) и включает меньше всего манипуляций. Стоимость одной реакции невысока, поскольку кроме реагентов не требуется никаких специальных расходных материалов.

    Обзор подготовлен при поддержке компании SkyGen — официального дистрибьютора продукции Analytik Jena, MicroGEM, Qiagen, NEB и других производителей.

    Источники

    1. Rae, P. M. M., Barnett, T. R. & Babbitt, D. G. Factors influencing the yield of satellite DNA in extractions from Drosophila virilis and Drosophila melanogaster adults and embryos. BBA Sect. Nucleic Acids Protein Synth. (1976) doi:10.1016/0005-2787(76)90157-X.

    2. Patrinos, G. P., Danielson, P. B. & Ansorge, W. J. Molecular Diagnostics: Past, Present, and Future. in Molecular Diagnostics: Third Edition (2016). doi:10.1016/B978-0-12-802971-8.00001-8.

    3. Ali, N., Rampazzo, R. D. C. P., Costa, A. Di. T. & Krieger, M. A. Current Nucleic Acid Extraction Methods and Their Implications to Point-of-Care Diagnostics. BioMed Research International (2017) doi:10.1155/2017/9306564.

    4. Vogelstein, B. & Gillespie, D. Preparative and analytical purification of DNA from agarose. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. (1979) doi:10.1073/pnas.76.2.615.

    5. Green, M. R. & Sambrook, J. Molecular Cloning, 3-Volume Set : A Laboratory Manual. Cold Spring Harbour Laboratory Press (2012).

    6. Trevor Hawkins. DNA PURIFICATION AND ISOLATION USNG MAGNETIC PARTICLES. United States Pat. (#5,705,628 ) 9, 2989–2997 (1998).

    7. Tan, S. C. & Yiap, B. C. DNA, RNA, and protein extraction: The past and the present. Journal of Biomedicine and Biotechnology (2009) doi:10.1155/2009/574398.

    8. http://www.dual-chemistry.com/

    9. https://www.analytik-jena.com/products/kits-assays-reagents/extraction-technology/

    10. https://microgembio.com/pdqex/

    #14 Выделение микроРНК, РНК и ДНК с использованием phenol-free колоночных наборов от Bioline

    23.01.2015

    Мы продолжаем расширять нашу линейку для колоночного выделения нуклеиновых кислот из самых разных образцов. Сегодня мы хотим обратить внимание всех, кто работает с микроРНК, тотальной РНК, а также с образцами тканей в парафине на новинки для колоночного выделения:

  • Набор для выделения РНК из биологических жидкостей позволяет выделить РНК высокого качества из физиологических жидкостей - крови/сыворотки, мазков изо рта, клеточных культур, вирусов.
  • Набор для выделения микро РНК и набор для выделения микро РНК из растений позволяют получить тотальную РНК и микроРНК из самых различных образцов (см. Табл.1 в тексте обзора).
  • Набор для выделения РНК/ДНК из тканей, зафиксированных формалином в парафине позволяет получить геномную ДНК и тотальную РНК хорошего качества из проблемных образцов.
  • Набор для выделения ДНК/РНК/протеинов позволяет выделить три различных типа макромолекул из одного образца без этапа экстракции органическими растворителями.
  • Преимущества линейки наборов для выделения РНК от ISOLATE II

  • Безопасность: простой протокол, без использования токсичных химикатов (без фенола)
  • Достоверные результаты: возможность очистить как микро РНК, так и малые РНК (длиной до 200 нуклеотидов) без разрушения, вызываемых использованием фенола
  • Быстрый протокол: без трудоемкого этапа разделения фаз и осаждения спиртом
  • Надежность: без инициируемого фенолом разрушения образцов
  • Использование для дальнейших экспериментов: РНК готова к дальнейшему использованию в большинстве экспериментов
  • Было показано, что малые РНК с малым содержанием GC могут быть селективно потеряны при очистке с использованим фенола (Kim et al., Molecular Cell 46(6): 2012).

    Таблица 1. Типы образцов, из которых возможно выделять микро РНК, РНК, ДНК и протеины при помощи наборов для выделения ISOLATE II

    Давайте подробнее остановимся на каждом из рассматриваемых наборов.

    1. Набор для выделение РНК из биологических жидкостей и из вирусов

    Типы выделяемой РНК:

  • большие фрагменты мРНК
  • вирусная РНК
  • рибосомальная РНК (rRNA)
  • малые РНК, такие как микроРНК (miRNA) и короткие интерферирующие РНК (siRNA)
  • Откуда выделяется РНК?

  • кровь/плазма/сыворотка
  • семенная жидкость
  • слюна
  • цереброспинальная жидкость (CSF)
  • вирусы
  • Откуда выделяется вирусная РНК?

    Кроме перечисленных выше типов образцов, также из культивируемых клеток и тканей.

    Принцип выделения:

    Колоночное выделение с использованием аффинного полимера, связывающего РНК разного размера (используется новый тип silica, к которой преимущественно присоединяются малые РНК). Набор не использует фенол и хлороформ.

    Образцы подвергаются лизису в присутствии гуанидиниум тиоционата, и хаотропных солей, которые деактивируют эндогенные РНКазы и позволяют выделить неповрежденную РНК. Затем, геномная ДНК захватывается колонками и удаляется. Добавляется этанол, и РНК переносится в колонку для выделения РНК. Далее, тотальная РНК задерживается колонкой и может быть избавлена от примесей при промывании.

    Полученная высокочистая РНК может быть использована в следующих экспериментах:

  • реал-тайм ПЦР (qPCR)
  • реакция обратной транскрипции
  • синтез кДНК
  • секвенирование следующего поколения
  • Nothern blotting
  • 2. Набор для выделения РНК/ДНК из тканей, зафиксированных формалином в парафине

    Набор обеспечивает выделение и очистку геномной ДНК и тотальной РНК (включая микроРНК) из образцов тканей в парафине. Зафиксированные в парафине ткани характеризуются образованием связок между нуклеиновыми кислотами и белками, и друг с другом. Фиксация также часто характеризуется фрагментацией ДНК с течением времени. Набор позволяет частично избавиться от модификаций, вызванных формалином, увеличивая качество и выход нуклеиновых кислот.

    Разделительный матрикс в составе колонок позволяет отделять РНК и ДНК от других компонентов клеток. Набор не требует использования хлороформа и фенола.

    На первом этапе избавляются от парафина при помощи промывки ксиленом и этанолом, далее образцы разлагаются с использованием Протеиназы К и специального буфера. Растворимый лизат собирается для очистки РНК, а оставшийся образец разлагается для выделения ДНК. Лизирующий буфер и этанол добавляются в лизат, содержащий ДНК и РНК и переносят в микроколонки для выделения РНК и ДНК. Связанные нуклеиновые кислоты промываются. Очищенные РНК и ДНК могут использоваться для широкого спектра экспериментов.

    3. Набор для выделения микроРНК и набор для выделения микроРНК из растений

    Набор был разработан для выделения обогащенной микроРНК (размер составляет <200 нуклеотидов), выделение происходит из следующих образцов:

  • культивируемые клетки
  • ткани млекопитающих
  • бактерии
  • кровь
  • другие биологические жидкости
  • Какие типы малых РНК выделяются:

  • регуляторные молекулы РНК (такие например как микроРНК (miRNA)
  • короткие интерферирующие РНК (siRNA),
  • транспортные РНК (tRNA)
  • РНК из 5Sсубъединицы (rRNA)
  • Малые РНК, имеющие длину 20-25 нуклеотидов, вовлечены в регуляцию генной экспрессии при помощи связывания с мессенджер РНК (mRNA)

    Принцип выделения

    РНК прикрепляется к колонки при помощи аффинного связывания,при этом при помощи размера пор возможно разделить РНК по размеру.

    Тотальная РНК, в растворе этанола проходит через связывающую колонку, где большие фрагменты РНК остаются связанными, а малые смываются в супернатант. Далее супернатант, содержащие малые РНК проходит через колонку для выделения малых РНК, где связываются малые молекулы.

    4. Набор для выделения ДНК/РНК/протеинов

    Набор позволяет выделить и очистить с высоким качеством одновременно следующие три компонента, из одного образца

  • тотальную РНК (включая малые РНК),
  • геномную ДНК
  • белки
  • Выделение может проводиться из следующих образцов:

  • культивируемые клетки
  • ткани млекопитающих
  • биологические жидкости (включая слюну, мочу, семенную жидкость и кровь)
  • бактерии
  • дрожжи,
  • грибы
  • растения
  • Особенно набор подходит для исследователей, которые выделяют макромолекулы из особенно ценных, труднодоступных образцов (таких как результаты биопсии), - потому что это позволяет не проводить фракционирование образца. Также, анализ становится более достоверным, вследствие того, что РНК, ДНК протеины получаются из одного и того же образца.

    Протокол предотвращает деградацию РНК (при помощи перемешивания образца с гуанидинумом тиоцианатом. Геномная ДНК захватывается и отделяется при помощи ДНК колонки. Оставшийся супернатант погружается в колонку для выделения РНК/протеинов. Далее тотальная РНК (включая микроРНК) связывается с поверхностью колонки, в то время как протеины остаются в растворе. Протеины, оставшиеся в промывном растворе - могут быть нанесены непосредственно на SDS-PAGE гель, для визуального анализа, или очищаться. Набор не содержит фенол и хлороформ.

    Становится возможным исследовать одновременно геном, транскриптом и проводить протеомные исследования в одном образце. Очищенная РНК может быть использована для реал-тайм ПЦР, ПЦР с обратной транскрипцией, Nothern Blotting, экспериментах по секвенированию и экспрессии.Полученная ДНК может быть использована для ПЦР, реал-тайм ПЦР, NGS секвенирования, генотипирования. Белки могут быть использованы для SDS-PAGE, Цуыеукт Идщеештпб 2-D гелей, масс-спектрометрии.

    Заключение

    Мы надеемся, что новая альтернатива представленным на рынке методам и продуктам для выделения РНК (и микроРНК) позволит упросить и удешевить проведение экспериментов с использованием РНК. По всем возникаюшим вопросам, пожалуйста, обращайтесь по электронной почте [email protected]!

    Как работают наборы для выделения ДНК

    В наши дни большинство лабораторий используют коммерческие наборы для выделения ДНК, в которых используются спин-колонки, для выделения ДНК и РНК, которые содержат кремнеземную смолу, избирательно связывающую нуклеиновые кислоты, в зависимости от факторов, влияющих на метод экстракции. Наборы для выделения ДНК делают весь процесс намного проще и быстрее, чем старые методы, но недостатком их использования является то, что если вы не понимаете, что находится в черном ящике набора, он делает поиск проблем и ошибок намного сложнее.

    Итак, в этой статье я подробно объясню, как работают наборы для извлечения НК и что происходит на каждом этапе, а также о некоторых типичных проблемах, связанных с использованием колонок с силикагелем в экстракции ДНК, которые можно преодолеть или избежать, лишь немного разобравшись.

    Первый шаг в экстракции РНК и ДНК: лизис

    Лизирующий буфер Invitrogen ProcartaPlex

    Формулы лизиса могут варьироваться в зависимости от того, хотите ли вы извлечь ДНК или РНК, но общим знаменателем является лизирующий буфер, содержащий высокую концентрацию хаотропной соли. Хаотропы дестабилизируют водородные связи, силы Ван-дер-Ваальса и гидрофобные взаимодействия. Белки дестабилизируются, в том числе нуклеазы, нарушается связь нуклеиновых кислот с водой, что создает условия для перехода к кремнию. Хаотропные соли включают гуанидин HCl, гуанидинтиоцианат, мочевину и перхлорат лития.

    Помимо хаотропов, в буфере для лизиса обычно есть детергенты, которые улучшают солюбилизациею и лизис белка. Также могут быть ферменты, используемые для лизиса, в зависимости от типа образцов. Протеиназа К является одним из них и на самом деле очень хорошо работает в этих денатурирующих буферах; чем больше денатурирован белок, тем лучше работает протеиназа К. Лизоцим не работает при денатурировании, и поэтому обработку лизоцимом обычно проводят перед добавлением денатурирующих солей.

    Один комментарий о плазмидных препаратах: лизис сильно отличается от экстракции для выделения РНК или геномной ДНК, потому что плазмида должна быть сначала отделена от геномной ДНК, и если вы добавите хаотропы, вы высвободите все сразу и не будете иметь возможность отделить маленькую кольцевую ДНК от высокомолекулярной хромосомы. Таким образом, в плазмидных препаратах хаотропы не добавляются до тех пор, пока не происходит лизис, и соли не используются для связывания.

    После извлечения ДНК происходит очистка: связывание ДНК с колонкой

    Хаотропные соли имеют решающее значение для лизиса, а также для связывания нуклеиновых кислот с колонкой. Кроме того, для усиления и влияния на связывание нуклеиновых кислот с диоксидом кремния также добавляют спирт. В большинстве случаев это этанол, реже — изопропанол. Процент этанола и объем имеет большое значение.  Слишком много, и вы получите много разложившихся нуклеиновых кислот и мелких частиц, которые будут влиять на показания поглощения света и снижать выход эксперимента. Слишком мало – возникнут при смывании всей соли с мембраны. Важным моментом здесь является то, что этанол влияет на связывание, и добавленное количество оптимизируется для любого набора, который вы используете. Изменение этого шага может помочь изменить то, что вы восстанавливаете, поэтому, если у вас возникли проблемы и вы хотите устранить неполадки восстановления, это может быть шагом для дальнейшей оценки.

    Еще один способ диагностики проблем — сохранить поток после связывания и ускорить его, чтобы увидеть, можете ли вы найти искомые нуклеиновые кислоты. Если вы использовали SDS-содержащее моющее средство при лизисе, попробуйте использовать NaCl в качестве осадителя, чтобы избежать загрязнения ДНК или РНК моющим средством.

    Отмывка ДНК (или РНК)

    Набор для выделения геномной ДНК Invitrogen PureLink Pro 96

    Ваш лизат был центрифугирован через силикагелевую мембрану, и теперь ваша экстрагированная ДНК или РНК должна быть связана с колонкой, а примеси, белок и полисахариды должны были пройти. Но мембрана все еще загрязнена остаточными белками и солью. Если образец был взят из растений, на мембране все еще будут присутствовать полисахариды, возможно, некоторые пигменты.

    Этапы промывки служат для удаления этих примесей. Обычно есть две промывки, хотя это может варьироваться в зависимости от типа образца. Первая промывка часто содержит небольшое количество хаотропной соли для удаления белка и цветных загрязнений. За этим всегда следует промывка этанолом для удаления солей. Если в препарате недостаточно белка для начала, (плазмидные препараты или очистка продуктов Полимеразная цепная реакция), тогда необходима только промывка этанолом.

    Удаление хаотропных солей имеет решающее значение для получения высоких выходов и чистоты нуклеиновых кислот. Некоторые наборы даже дважды промывают колонку этанолом. Если соль останется, элюирование нуклеиновой кислоты будет плохим, и показание A230 (поглощение света с длиной волны 230 нм) будет высоким, что приведет к низким отношениям 260/230. Для ДНК и РНК, не содержащих этанол, вам нужна сухая колонка. После промывки этанолом большинство протоколов имеют стадию центрифугирования для высушивания колонки. Это необходимо для удаления этанола и важно для чистого элюента. Когда для элюирования на мембрану наносят 10 мМ Трис-буфера или воду, нуклеиновые кислоты могут гидратироваться и высвобождаться из мембраны. Если в колонке все еще есть этанол, то нуклеиновые кислоты не могут быть полностью регидратированы.

    Пропуск этапа сушки приводит к загрязнению этанолом и низким выходам. Если вы не видете абсорбции этанола на Nanodrop, то он не будет отображаться в ваших показаниях. Основные признаки проблемы состоят в том, что при попытке загрузить образец в агарозный гель ДНК не утонет. Даже при наличии красителя. Другим показателем является то, что если вы поместите образец в -20°C, он не замерзнет.

    Экстракция РНК и ДНК, последний рубеж: элюция

    Последним этапом в протоколе экстракции ДНК является освобождение чистой ДНК или РНК из силикагеля.

    Для приготовления ДНК обычно используют 10 мМ Трис при рН 8-9. ДНК более стабильна при слегка щелочном pH и быстрее растворяется в буфере. И это применимо также для гранул ДНК. Вода имеет тенденцию иметь низкий pH, так как 4-5 и высокомолекулярная ДНК могут не полностью регидратироваться за короткое время, используемое для элюции. Элюция ДНК может быть максимизирована, если позволить буферу сидеть в мембране в течение нескольких минут перед центрифугированием.

    РНК элюируется хорошо при слегка кислом pH, и поэтому вода является предпочтительным разбавителем. РНК легко растворяется в воде.

    Что еще может пойти не так?

    Низкий выход: если выход ДНК/РНК ниже, чем вы ожидали для образца, есть много факторов, которые стоит проанализировать. Обычно это проблема лизиса — неполный лизис является основной причиной низкого выхода. Это также может быть вызвано неправильными условиями связывания. Обязательно используйте свежий высококачественный этанол для разбавления буферов или для добавления на стадии связывания. Возможно, этанол низкого качества или в старые запасы попала вода и они имеют неправильную концентрацию. Если буфер для промывки сделан неправильно, возможно, вы смываете извлеченную ДНК или РНК.

    Низкая чистота: если извлеченная ДНК загрязнена белком (низкое соотношение  260/280), возможно, вы начали с слишком большого количества образца, и белок не был полностью удален или растворен. Если ДНК имеет плохое отношение 260/230, проблема обычно заключается в соли из связующего или промывочного буфера. Убедитесь, что этанол высочайшего качества использовался для приготовления промывочных буферов, и, если проблема не исчезнет, ​​дайте колонке дополнительную промывку.

    Некоторые образцы имеют гораздо больше ингибиторов по сравнению с другими. Образцы окружающей среды особенно подвержены проблемам с чистотой, потому что гуминовые вещества растворяются во время экстракции. Хьюмик ведет себя подобно ДНК и его трудно удалить из колонки с диоксидом кремния. Для этого типа образца  существуют специальные методы для удаления белка и гуминов перед стадией колонки.

    Деградация:  В основном при экстракции РНК деградация происходит из-за неправильного хранения образца или неэффективного лизиса, при условии что вы элюировали водой без РНКазы. Для экстракции ДНК деградация не является большой проблемой, потому что для ПЦР ДНК можно разрезать, и она работает нормально. Но если вы надеялись не иметь слишком много сдвинутой ДНК, возможно, вы использовали слишком сильный метод лизиса.

    Особые замечания по очистке для ПЦР: Очистка продуктов ПЦР сама по себе не является методом выделения ДНК, но это приятный и простой метод, потому что это просто добавление высокой концентрации связывающих солей (обычно между 3-5 объемами соли на объемы реакции) и центрифугирование через колонку. Поэтому, когда наборы для очистки ПЦР выходят из строя, это может быть особенно неприятно. Первый вопрос, который я задаю людям: «Вы проверили результаты ПЦР на геле?», Потому что вы не можете проверить реакцию ПЦР в УФ-свете и получить точные показания. В 260-й реакции ПЦР поглощается слишком много ультрафиолетового излучения: нуклеотиды, детергенты, соли и праймеры. По моему опыту, отказ комплекта для очистки ПЦР работать часто вызван неудачной реакцией. Но если вы знаете, что у вас был сильный продукт ПЦР, Наилучший подход — просто сохранить свою долю потока после связывания. Если ДНК не связывается, вот где она. Вы всегда можете спасти его, а затем очистить снова. А затем позвоните в техподдержку и попросите заменить комплект.

    Как ученые, конечно, мы хотим точно знать, что происходит с нашими экспериментами, и иметь возможность устранять неполадки, не обращаясь в службу технической поддержки.

    Я надеюсь, что эта статья поможет прояснить некоторые научные аспекты метода спин-фильтрации с силикагелем для экстракции РНК и ДНК, чтобы вы могли самостоятельно поставить диагноз и исправить его. Таким образом, когда вы звоните в службу технической поддержки, вы сначала дважды проверили несколько наиболее вероятных причин проблем, и вместо того, чтобы пройти через множество ошибок, вы сможете быстрее найти решение. Даже если это бесплатный набор для замены ДНК!

    Выделение микробных ДНК/РНК | БиоАналит

    innuPREP Bacteria DNA Kit

    Набор предназначен для выделения ДНК из грамм+ и грамм- бактерий. Процедура экстракции включает лизис клеток лизоцимом, обработку протеиназой К и связывание геномной ДНК с поверхностью центрифужного фильтра. На последнем этапе связанную ДНК промывают и элюируют.

    INSTANT Virus RNA Kit

    Набор предназначен для выделения вирусной РНК из сыворотки, плазмы крови или других жидкостей, не содержащих клетки, а также из тканей, парафина, ватных тампонов, клеточных культур.

    INSTANT Virus DNA Kit

    Набор предназначен для выделения вирусной ДНК из сыворотки, плазмы крови или других жидкостей, не содержащих клетки, а также из тканей, парафина, ватных тампонов, клеточных культур. Экстракция ДНК проста, занимает немного времени и состоит из следующих этапов: чрезвычайно быстрый лизис, связывание геномной ДНК с поверхностью центрифужного фильтра и, наконец, элюция ДНК.

    INSTANT Mycobacteria DNA Kit

    Набор предназначен для выделения ДНК из микобактерий, содержащихся в слюне, бронхоальвеолярном лаваже и лимфатической жидкости. Процедура экстракции включает стадию предобработки N-ацетилцистеином (необязательный этап), осаждение бактерий центрифугированием и последующие лизис бактерий лизоцимом, обработку протеиназой К, связывание ДНК с поверхностью центрифужного фильтра. Заключительный этап - промывка и элюция ДНК.

    INSTANT Bacteria DNA Kit

    Набор предназначен для выделения ДНК из грамм+ и грамм- бактерий после культивации. Процедура экстракции включает лизис клеток лизоцимом, обработку протеиназой К и связывание геномной ДНК с поверхностью центрифужного фильтра. На последнем этапе связанную ДНК промывают и элюируют.

    innuPREP Virus DNA/RNA Kit

    Набор предназначен для одновременного выделения вирусной РНК и ДНК из различных исходных клинических материалов.

    innuPREP Virus RNA Kit

    Набор предназначен для выделения вирусной РНК из сыворотки, плазмы крови, образцов тканей, парафина, ватных тампонов и клеточных культур.

    innuPREP Virus DNA Kit

    Набор предназначен для  выделения вирусной ДНК из сыворотки и плазмы крови, образцов тканей, парафина, ватных тампонов и клеточных культур. Для экстракции ДНК применяется принципиально новый подход - использование новых химических реагентов в комбинации с чрезвычайно быстрым лизисом, связыванием ДНК с поверхностью центрифужного фильтра и, наконец, промывкой и элюцией ДНК.

    innuPREP Mycobacteria DNA Kit

    Набор предназначен для выделения ДНК из микобактерий, содержащихся в слюне, бронхоальвеолярном лаваже и лимфатической жидкости. Процедура экстракции включает стадию предобработки N-ацетилцистеином (необязательный этап), осаждение бактерий центрифугированием и последующие лизис бактерий лизоцимом, обработку протеиназой К, связывание ДНК с поверхностью центрифужного фильтра. Заключительный этап - промывка и элюция ДНК.

    innuPREP Stool DNA Kit

    Набор предназначен для выделения ДНК из образцов стула. Высокоэффективный лизис исходного материала сопровождается фильтрацией с целью удаления частиц, не подвергшихся лизису. Следующих шаг - перенос образца в пробирку с центрифужным фильтром и связывание с ним ДНК. Заключительный этап - промывка и элюция ДНК.

    INSTANT Influenza RNA Kit

    Набор предназначен для выделения РНК вируса гриппа из первичных образцов (например из различных мазков). После лизиса вирусная РНК связывается с поверхностью центрифужного фильтра, а затем ее промывают и элюируют.

    Очистить РНК прямо из цельной крови | Thermo Fisher Scientific

    Дон Обермоллер, Ambion, Inc.

    • Из крови до РНК менее чем за час - нет необходимости изолировать лейкоциты
    • РНК позже ® включен для стабилизации РНК
    • Образцы можно хранить в течение нескольких дней при температуре окружающей среды
    • Восстанавливает особо чистую РНК, подходит для требовательных приложений


    Процедура Ambion RiboPure ™ -Blood решает проблемы, связанные с выделением интактной РНК из цельной крови.В прошлом исследователям обычно приходилось выделять лейкоциты (WBC) из цельной крови до выделения РНК, чтобы справиться с множеством загрязняющих веществ, присутствующих в крови. Одна из проблем, связанных с выделением РНК из крови, заключается в том, что белые кровяные тельца составляют лишь небольшую часть (около 0,2%) клеток крови. Красные кровяные тельца, которые составляют подавляющее большинство клеток, присутствующих в крови, содержат большое количество гемоглобина, который ингибирует ОТ-ПЦР. Плазма, которая составляет ~ 60% крови, имеет высокую концентрацию РНКаз, как и некоторые подтипы лейкоцитов, поэтому необходимо быстро инактивировать РНКазы в образцах крови для сохранения РНК.Большое количество гемоглобина в цельной крови еще больше затрудняет очистку РНК из-за засорения фильтров, гранул и других твердофазных матриц, и в случае переноса будет мешать последующим применениям. Набор RiboPure-Blood Kit сочетает в себе два последовательных метода очистки РНК (рис. 1) для удаления всех этих потенциальных загрязнителей, что приводит к высоким выходам чистой РНК непосредственно из цельной крови (без предварительного фракционирования лейкоцитов), что идеально подходит для ОТ-ПЦР (рис. 2), микроматрицы или любое другое приложение с высокими требованиями к чистоте.


    Рис. 1. Схема процедуры RiboPure ™ -Blood.
    Рис. 2. ОТ-ПЦР в реальном времени на РНК, выделенную из крови RiboPure ™. Эксперимент ОТ-ПЦР в реальном времени, в котором транскрипты p53, BTK и GAPDH были обнаружены в РНК, выделенной с помощью процедуры RiboPure-Blood. Геномная ДНК не обнаруживалась в контрольных реакциях «без RT».

    РНК из цельной крови менее чем за час

    Простая процедура RiboPure-Blood состоит из трех этапов: 1) лизис свежей или РНК позже -обработанная цельная кровь в лизисном растворе на основе гуанидиния, 2) начальная очистка РНК путем экстракции фенолом / хлороформом и 3) окончательная очистка РНК на стекловолоконном фильтре.На этапе экстракции фенолом / хлороформом из образца удаляются белки, чтобы предотвратить засорение стекловолоконных фильтров и исключить загрязнение гемом. Затем можно провести постэлюционную обработку ДНКазой с помощью DNA- free ™ Реагенты включены в набор. Вся процедура, включая дополнительную обработку ДНКазой, может быть завершена менее чем за 1 час (рис. 1).

    Идеально подходит для сложных приложений

    Комбинируя экстракцию фенолом / хлороформом, очистку кремнеземной матрицы и обработку ДНКазой, процедура RiboPure-Blood удаляет белок, гем, геномную ДНК и РНКазы, что приводит к высоким выходам чистой РНК, которые идеально подходят для ОТ-ПЦР или матричного анализа.

    Стабилизировать РНК в цельной крови

    При отборе образцов крови для анализа РНК может потребоваться хранение образцов до выделения РНК. Набор RiboPure-Blood содержит РНК позже для стабилизации РНК в цельной крови.Добавление РНК позже образцов крови стабилизирует РНК и предотвращает ее деградацию. РНК позже обработанных образцов можно безопасно хранить при температуре окружающей среды в течение продолжительных периодов времени (до нескольких дней). В результате образцы можно безопасно транспортировать из точки сбора в удаленную лабораторию для выделения РНК без деградации РНК.

    Все что тебе нужно

    Набор содержит достаточное количество реагентов для стабилизации и очистки РНК из 40 образцов цельной крови от 0 до 0.По 3-0,5 мл. Средний выход РНК составляет от 2 до 4 мкг / 0,5 мл цельной крови (вариации обусловлены различиями в количестве лейкоцитов, специфичными для доноров). РНК, очищенную с помощью набора RiboPure-Blood Kit, можно использовать в сложных приложениях, таких как ОТ-ПЦР и матричный анализ.

    .

    РНК высочайшего качества из образцов крови | Thermo Fisher Scientific

    Благодаря доступности и регенеративным свойствам кровь является одним из наиболее часто используемых типов образцов для выделения РНК, особенно в клинических условиях. Хотя кровь легче обрабатывать, чем твердые ткани, потому что она не требует механического разрушения, это создает уникальные проблемы для выделения высококачественной РНК. Здесь мы обсуждаем эти проблемы и методы, доступные для выделения высококачественной РНК из крови.

    Проблемы выделения РНК крови

    Поскольку кровь может быть собрана с использованием относительно неинвазивных процедур и она быстро регенерируется, кровь является одним из немногих типов образцов крови, которые обычно доступны для исследований экспрессии РНК и обнаружения биомаркеров.В результате кровь является наиболее часто используемым типом образца в клинических исследованиях, однако при выделении РНК возникает несколько проблем:
    1. Кровь часто собирают в клинических учреждениях, но обрабатывают для выделения РНК где-то еще. Это приводит к необходимости стабилизации РНК перед транспортировкой и очистки РНК.
    2. Кровь имеет сложный клеточный состав. Сложная клеточная природа крови затрудняет обнаружение дифференциальной экспрессии генов, которая встречается только в подмножестве типов клеток.Представляющие интерес клетки, содержащие РНК, лейкоциты, составляют <1% клеточной массы. Более 99% клеточной фракции крови состоит из красных кровяных телец, в том числе незрелых ретикулоцитов, которые содержат высокий уровень мРНК глобина. МРНК глобина может затруднить обнаружение других специфических мРНК лейкоцитов.
    3. Кровь содержит биохимические вещества, которые могут нарушить работу последующих приложений. Соединения, ингибирующие ферменты, такие как РНКаза, антикоагулянты и гем, присутствуют в крови в относительно высоких концентрациях по сравнению со многими другими тканями.Если они не удаляются должным образом во время выделения РНК, они могут значительно ухудшить последующие анализы, такие как микроматричный анализ и ОТ-ПЦР.

    Чтобы сделать возможным молекулярный анализ РНК из цельной крови, необходим строгий метод очистки РНК, который обеспечивает высокое качество РНК, лишенную ингибиторов. Applied Biosystems предлагает решения для каждого этапа рабочего процесса подготовки образца РНК крови (рис. 1), включая стабилизацию образца, выделение РНК и дополнительное уменьшение мРНК глобина.Имея множество вариантов, исследователи могут выбрать подход, который лучше всего соответствует их исследовательским потребностям.
    Рисунок 1. Рабочий процесс подготовки образца РНК крови.

    Стабилизация РНК в образцах крови

    Плазма крови чрезвычайно высока по активности рибонуклеазы (РНКазы), и минимизация этой активности имеет решающее значение для любой процедуры выделения РНК крови.Applied Biosystems предлагает два варианта стабилизации РНК в образцах крови; образцы крови можно брать непосредственно в пробирки Tempus ™ Blood RNA, которые содержат стабилизирующий реагент или РНК позже ® Сбор тканей: стабилизирующий раствор можно добавлять к образцам крови сразу после сбора.

    Пробирки для определения РНК крови Tempus
    Когда кровь набирается в пробирки Tempus Blood RNA и перемешивается, стабилизирующий реагент практически сразу же лизирует клетки. Одновременно инактивируются клеточные РНКазы и выборочно осаждается РНК, оставляя геномную ДНК и белки в растворе.Для выделения РНК система Tempus использует твердофазную стратегию очистки на основе диоксида кремния, которая доступна в конфигурациях на основе центрифугирования и вакуума (см. Ниже, Система выделения РНК крови Tempus ). РНК в крови, собранной в пробирки Tempus Blood RNA Tubes, стабильна до 5 дней при комнатной температуре и не менее 7 дней при 4 ° C.

    РНК позже Сбор ткани: стабилизирующий раствор
    Альтернативно, РНК позже Раствор защищает РНК от деградации без лизиса клеток крови.Образцы в растворе RNAlater можно безопасно хранить до 1 недели при 25 ° C или до 1 месяца при 4 ° C. Раствор RNAlater включен в несколько продуктов Applied Biosystems для очистки крови, специфичных для РНК, включая систему выделения общей РНК LeukoLOCK ™ и набор RiboPure ™ -Blood Kit.

    Пробирки Tempus Blood RNA и RNA позже Раствор эффективно стабилизирует профили экспрессии мРНК и устраняет необходимость выделения РНК сразу после сбора образца.

    Выбор набора для выделения РНК крови

    Основными факторами, которые следует учитывать при выборе системы для подготовки проб РНК крови, являются объем забора крови и первичное последующее применение (рисунки 2 и 3).Applied Biosystems предлагает на выбор 4 различные системы выделения РНК крови человека. РНК, выделенная с помощью любой из этих систем, подходит для анализа RT-PCR.


    Рис. 2. Основные факторы, определяющие выбор метода пробоподготовки РНК крови.
    * См. Протокол Ambion® GLOBINclear ™ - Набор для снижения уровня глобина в цельной крови человека.
    ** См. Протокол www.ambion.com/techlib/misc/leuko_iso.pdf
    *** См. Www.ambion.com/techlib/misc/ribo_miRNA.pdf для протокола

    Рисунок 3. Дерево принятия решений по выделению РНК крови.

    Система выделения РНК крови Tempus: упрощает сбор и обработку крови для анализа экспрессии генов

    Пробирки Tempus Blood RNA сконструированы для сбора и стабилизации цельной крови для выделения РНК, когда будет проводиться ОТ-ПЦР в реальном времени, микроматрицы или другие эксперименты, требующие высококачественной РНК. Используя методы центробежного фильтра (набор для выделения РНК Tempus Spin) или вакуумной фильтрации (набор для выделения РНК с 12 портами Tempus), лизат крови фильтруется через мембрану на основе диоксида кремния, которая захватывает РНК.Геномная ДНК, белок и другие клеточные остатки проходят через мембрану с очень низким удерживанием, что приводит к чрезвычайно чистой РНК.

    Набор RiboPure-Blood: адаптирован для самых строгих требований
    Набор RiboPure-Blood Kit очищает РНК непосредственно из цельной крови без фракционирования лейкоцитов. Доступны отдельные наборы для цельной крови человека или мыши / крысы. Сочетая экстракцию фенолом / хлороформом, очистку на основе стекловолоконного фильтра и обработку ДНКазой, процедура RiboPure-Blood удаляет белок, гем, геномную ДНК и РНКазы, что приводит к высоким выходам исключительно чистой РНК, идеально подходящей для любого последующего применения.Процедура проста и быстра - переход от крови к РНК менее 30 мин. Раствор RNAlater включен в набор RiboPure-Blood для стабилизации РНК в образце цельной крови перед обработкой на РНК. Набор идеально подходит для небольших объемов образцов, но также доступен в пользовательских форматах (например, для больших объемов образцов).

    Система выделения общей РНК LeukoLOCK: специально улавливает лейкоциты для матричного анализа
    Система выделения общей РНК LeukoLOCK - это инновационный метод клеточного фракционирования цельной крови, стабилизации и экстракции общей РНК из популяции лейкоцитов.Система LeukoLOCK оптимизирована для работы с человеческой кровью. Кровь - это кладезь клеточной информации; однако присутствие мРНК глобина в РНК, полученной из цельной крови, может помешать приложениям для профилирования экспрессии на основе микрочипов. В системе LeukoLOCK используется технология истощения лейкоцитов на основе фильтра для улавливания лейкоцитов из цельной крови и раствора RNAlater для стабилизации клеток на фильтре. Исключая эритроциты из процесса очистки РНК, РНК по своей природе обеднена мРНК глобина, что приводит к улучшенным результатам микроматрицы.

    Набор для выделения РНК крови MagMAX ™ -96: высокопроизводительное решение для вирусной и общей РНК
    Набор для выделения РНК крови MagMAX-96 разработан для быстрого (<1 часа) выделения РНК, включая вирусную РНК, из цельной крови млекопитающих в формате 96-луночного планшета. Клетки лизируются, и РНК очищается от лизата с использованием технологии на основе магнитных шариков Ambion® MagMAX. Магнитные шарики связывают РНК более эффективно, чем методы фильтрации из стекловолокна, что приводит к более высокому выходу РНК.Кроме того, выходы РНК более согласованы от эксперимента к эксперименту, что обеспечивает более надежные результаты последующих анализов. Вирусная и общая РНК, полученные с помощью набора MagMAX-96 Blood Kit, могут использоваться непосредственно в ОТ-ПЦР в реальном времени для идентификации вирусной РНК. Однако, поскольку в наборе не используется стабилизированная кровь, он не подходит для анализа экспрессии генов. Очистку РНК с помощью набора крови MagMAX-96 можно легко автоматизировать с помощью процессоров частиц MagMAX Express.

    Уменьшение мРНК глобина для превосходного анализа микрочипов

    До 70% мРНК (по массе) в цельной крови состоит из транскриптов глобина эритроцитов (эритроцитов).Эти «нежелательные» транскрипты глобина эффективно разбавляют популяцию мРНК и снижают чувствительность обнаружения менее распространенных мРНК с использованием технологии микрочипов. В анализах массивов показано, что высокий процент мРНК глобина в образцах крови:
    • Уменьшить текущие звонки
    • Уменьшить согласованность звонков
    • Увеличить вариацию сигнала

    Для решения этой проблемы Applied Biosystems предлагает два разных подхода, которые совместимы с протоколами амплификации и маркировки РНК (например,g., наборы Ambion MessageAmp ™):

    Система выделения общей РНК LeukoLOCK
    Система LeukoLOCK сохраняет профили экспрессии генов, удаляя при этом> 90% мРНК глобина за счет исключения эритроцитов из образца (см. Выше, Система выделения общей РНК LeukoLOCK).

    GLOBINclear ™ - Набор для уменьшения глобина цельной крови человека
    GLOBINclear Kit можно использовать для удаления> 95% нежелательной мРНК глобина из общей РНК цельной крови. Вместо использования жесткой обработки РНКазой H, которая может разрушать мРНК и изменять профили экспрессии, в этом наборе используется новая технология гибридизации, которая использует преимущества прочности связывания биотина / стрептавидина, специфичности гибридизации нуклеиновых кислот и удобства магнитного разделения.Эти особенности делают набор идеальным решением для удаления мРНК глобина из РНК крови, которая уже была выделена с помощью набора RiboPure-Blood или системы Tempus Blood RNA.

    Выделите микроРНК из крови

    Многие современные процедуры очистки РНК основаны на органической экстракции с последующим осаждением спиртом или адсорбцией молекул нуклеиновой кислоты на стекловолоконном фильтре или матрице из диоксида кремния.К сожалению, первая процедура требует осаждения спиртом, что занимает много времени и неэффективно восстанавливает малые РНК, а вторая процедура обычно приводит к потере значительных количеств малых РНК (

    Applied Biosystems предлагает несколько наборов, в которых используются оптимизированные буферы и промывки для выделения небольших РНК. РНК.Для выделения миРНК крови мы разработали дополнительные протоколы для набора RiboPure-Blood Kit и системы LeukoLOCK, чтобы адаптировать их для анализа миРНК.

    .Профиль экспрессии генов

    по образцам крови | Thermo Fisher Scientific

    Ambion предлагает интегрированные решения для профилирования экспрессии генов в цельной крови, включая сбор и стабилизацию образцов, фракционирование клеток крови, выделение РНК и удаление мРНК глобина (рис. 1). 70% общей мРНК в крови составляет мРНК глобина, и до 95% можно удалить с помощью этих инструментов. РНК, полученная по любому из этих протоколов, готова для амплификации и последующего анализа на микрочипах.


    Рис. 1. Инструменты Ambion для выделения РНК в образцах крови и профилирования экспрессии.

    Инструменты профилирования экспрессии, такие как микроматрицы и ОТ-ПЦР в реальном времени, предоставляют мощные средства идентификации биомаркеров РНК крови, связанных с патологическими состояниями [1–3]. Молекулярные признаки инфекции, воспаления и аутоиммунного заболевания находятся в циркулирующих лейкоцитах, включая B-клетки, T-клетки, нейтрофилы, моноциты и другие менее распространенные типы клеток.Однако большая часть мРНК глобина, полученная из ретикулоцитов, присутствующая в РНК, полученной из цельной крови, может снизить чувствительность профилирования микроматрицы. Следующие ниже инструменты для сбора и стабилизации образцов, фракционирования клеток крови, выделения РНК и удаления мРНК глобина позволяют получить РНК, которая будет лучше работать при анализе микрочипов.

    Сбор и стабилизация проб

    Полезно обеспечить стабилизацию РНК, храня образцы крови в RNAlater® Tissue Collection: Stabilization Solution.Раствор RNAlater защищает РНК от деградации и стабилизирует профиль мРНК, устраняя необходимость немедленного выделения РНК (рис. 2). Обработанные образцы можно безопасно хранить при температуре окружающей среды до трех дней (рис. 3). Для облегчения выделения РНК раствор RNAlater включен в продукты очистки специфической для крови РНК, систему выделения общей РНК LeukoLOCK ™ и набор RiboPure ™ -Blood Kit.
    Рис. 2. РНК позже ® стабилизирует более широкий набор транскриптов, чем система PAXgene®. Соотношение экспрессии 0-го дня к 3-му дню для всех генов на Affymetrix® Human Focus Arrays было рассчитано для образцов крови, обработанных раствором RNAlater, а затем RiboPure ™ -Blood Kit (RNAlater / RiboPure-Blood) и протоколом PAXgene ( PAX). (A) Соотношения экспрессии были упорядочены от высокого к низкому для образцов PAX, вместе с соответствующими сигналами от образцов, обработанных с помощью RNAlater / RiboPure-Blood. (B) Соотношения экспрессии были упорядочены от высокого к низкому для образцов RNAlater / RiboPure-Blood вместе с соответствующими сигналами от образцов PAXgene.
    Рисунок 3. РНК, стабилизированная в образцах крови.
    Образцы цельной крови объемом 0,5 мл, 0,4 мл и 0,3 мл собирали в пробирки Vacutainer®, содержащие ЭДТА. Аликвоты каждого образца либо добавляли непосредственно к 1,3 мл раствора RNAlater®, либо лизировали непосредственно в 0,8 мл раствора для лизиса из набора RiboPure ™ -Blood Kit. Образцы хранили при комнатной температуре (КТ) или при –20 ° C в течение 3 дней. Затем РНК выделяли с помощью набора RiboPure-Blood Kit (без обработки ДНКазой), и равные объемы выделенной РНК оценивали на денатурирующем агарозном геле.

    Выделение РНК из цельной крови

    Качество РНК может иметь значительное влияние на последующий анализ, такой как матричный анализ и ОТ-ПЦР в реальном времени. Чтобы избежать вмешательства со стороны ферментных ингибиторов, обнаруженных в цельной крови (например,g., гем) и из антикоагулянтов, используемых для анализа образцов крови (например, гепарина), очистка РНК из цельной крови требует строгого метода, который обеспечивает высокое качество РНК, лишенную ингибиторов и загрязняющих веществ. Ambion предлагает несколько продуктов для выделения специфичной для крови РНК, которые различаются размером образцов, которые нужно обработать, необходимостью очистки вирусной РНК или уменьшением мРНК глобина, а также требованием высокой производительности выделения.

    Малые объемы выборки (0.3–0,5 мл): Набор RiboPure-Blood очищает РНК непосредственно из цельной крови, не требуя фракционирования лейкоцитов. Комбинируя экстракцию фенолом / хлороформом, очистку на основе стекловолоконного фильтра и обработку ДНКазой, процедура RiboPure-Blood удаляет белок, гем, геномную ДНК и РНКазы, что приводит к высоким выходам чистой РНК, идеально подходящей для ОТ-ПЦР (рис. 4) . Процедура проста и быстра - переход от крови к РНК менее 30 мин. Раствор RNAlater включен в набор RiboPure-Blood для стабилизации РНК в образце цельной крови перед обработкой на РНК.Набор также доступен в пользовательских форматах (например, для больших объемов образцов).


    Рис. 4. Анализ ОТ-ПЦР в реальном времени РНК, выделенной с помощью набора RiboPure ™ -Blood Kit. Суммарную РНК, выделенную из цельной крови с помощью набора RiboPure-Blood Kit, подвергали обратной транскрипции и использовали в качестве матрицы для ПЦР в реальном времени. Типичные результаты показаны выше для амплификации GAPDH, p53 и BTK. Примечание. Геномная ДНК не обнаруживалась в контрольных анализах «без ОТ».

    Большие объемы образцов (3–10 + мл; включая истощение глобина): Система выделения общей РНК LeukoLOCK ™ - это инновационный метод фракционирования цельной крови, а также стабилизации и извлечения общей РНК из популяции лейкоцитов цельной крови.Система включает технологию фильтрации лейкоцитов для выделения лейкоцитов из цельной крови и RNAlater Tissue Collection: Stabilization Solution для стабилизации РНК в клетках, захваченных фильтром. После процедуры улавливания и стабилизации менее 5 минут лейкоциты можно хранить непосредственно на фильтрах в течение нескольких месяцев при -20 ° C или отправлять при температуре окружающей среды от точки сбора до второго места для экстракции РНК. Компоненты для фракционирования крови и стабилизации внутриклеточной РНК могут быть получены отдельно от реагентов для выделения РНК, чтобы облегчить многоточечную обработку образцов.

    РНК

    очищают путем разрушения захваченных клеток в растворе на основе тиоцианата гуанидиния, который высвобождает РНК, одновременно инактивируя нуклеазы. Этот клеточный лизат собирают и ненадолго обрабатывают протеиназой К. Затем РНК выделяют из лизата с использованием технологии магнитных шариков Ambion MagMAX ™ с последующей обработкой ДНКазой (с помощью TURBO ™ ДНКазы) и окончательной очисткой.

    Исследования количественной ОТ-ПЦР и экспрессии на микрочипах подтвердили пригодность РНК, очищенной с помощью лейкоцитарных фильтров LeukoLOCK, для надежного профилирования транскриптома.Образцы, обработанные немедленно или фракционированные, а затем хранящиеся в замороженном виде в течение 32 дней на фильтрах LeukoLOCK, имели одинаковые значения Ct в экспериментах qRT-PCR (были измерены четыре различных генных мишени, включая транскрипты, которые, как известно, являются чрезвычайно лабильными в крови ex vivo; Рисунок 5) . Обратите внимание, что из-за удаления красных кровяных телец РНК, очищенная из захваченных лейкоцитов, лишается мРНК глобина, что улучшает ее полезность для профилирования экспрессии и других приложений.


    Рисунок 5.Биотинилированная аРНК, амплифицированная из цельной крови, обработанной с помощью системы выделения общей РНК LeukoLOCK ™ и системы РНК крови PAXgene ™. РНК была выделена из цельной крови сразу после сбора (день 0) или из лейкоцитов, обработанных раствором RNAlater®, или из стабилизированной крови, хранившейся замороженной в течение 32 дней (день 32) до выделения с использованием системы выделения общей РНК Ambion LeukoLOCK или крови PAXgene. Система РНК. Затем образцы из каждого препарата (1 мкг) амплифицировали с использованием набора для амплификации аРНК MessageAmp ™ II для получения биотинилированной аРНК.Выше показаны следы биоанализатора Agilent® 2100 от 1 мкл полученной аРНК в разведении 1:10.

    Высокопроизводительная вирусная и общая РНК из крови: Набор для выделения РНК крови MagMAX ™ -96 разработан для быстрого (<1 часа) высокопроизводительного выделения общей и вирусной РНК из цельной крови млекопитающих в формате 96-луночного планшета (рис. 6). Клетки лизируются, и РНК очищается от лизата с использованием технологии магнитных шариков Ambion MagMAX ™. Магнитные шарики обладают множеством преимуществ для выделения РНК из крови.Магнитные шарики связывают РНК более эффективно, чем методы фильтрации из стекловолокна, что приводит к более высокому выходу РНК. Кроме того, выходы РНК более согласованы от эксперимента к эксперименту, что обеспечивает более надежные результаты последующих анализов. Вирусная и общая РНК, полученные с помощью набора MagMAX-96 Blood Kit, могут быть использованы непосредственно в qRT-PCR для идентификации вирусной РНК или определения профиля экспрессии генов.


    Рис. 6. Постоянный выход, чистота и целостность РНК, выделенной из цельной крови человека с помощью набора для выделения РНК крови MagMAX ™ -96. Суммарную РНК выделяли из 50 мкл свежей крови человека (единственный донор) в 8 повторах с использованием набора для выделения РНК крови MagMAX-96. Показания спектрофотометра были получены путем считывания 2 мкл очищенной РНК на NanoDrop® ND-1000. Отношение 28S к 18S рРНК было получено путем анализа 3 мкл РНК (~ 50 нг) на RNA LabChip® Kit с биоанализатором Agilent® 2100.

    Удаление мРНК глобина из образцов крови

    Было показано, что матричный анализ с использованием общей РНК цельной крови, содержащей высокий процент мРНК глобина, снижает текущие вызовы, снижает согласованность вызовов и увеличивает вариабельность сигналов [4].Таким образом, мРНК глобина мешает обнаружению других, менее распространенных генов, и данные можно улучшить, если удалить транскрипты глобина.

    В наборах GLOBINclear ™ -Human и GLOBINclear-Mouse / Rat используется технология субтрактивной гибридизации для удаления> 95% мРНК глобина из общей РНК цельной крови. Процедура на основе магнитных шариков усиливает силу связывания биотина / стрептавидина, специфичность гибридизации нуклеиновых кислот и удобство разделения магнитных шариков для удаления мРНК глобина из общей РНК крови.Поскольку обработка РНКазой H отсутствует, полученная РНК является превосходной матрицей для амплификации РНК или для синтеза кДНК для анализа массива и количественной ОТ-ПЦР. При использовании для маркировки / амплификации РНК для матричного анализа РНК от GLOBINclear Systems компании Ambion обеспечивает значительное повышение чувствительности и сопутствующее снижение вариабельности по сравнению с необработанной РНК цельной крови. В качестве примера, результаты анализа массива на Рисунке 7 показывают, что в образцах крови, обработанных GLOBINclear, на 50% больше генных характеристик, называемых «присутствует», что эквивалентно тысячам генов, по сравнению с необработанными образцами крови.Рисунок 7 также демонстрирует, что РНК, обработанная GLOBINclear, идеально подходит для использования с наборами для амплификации аРНК Ambion MessageAmp ™ II.


    Рис. 7. Обработка человека GLOBINclear ™ РНК цельной крови увеличивает количество генов, обнаруживаемых при матричном анализе. Двойных массивов (Affymetrix® GeneChip® U133 Plus 2.0) гибридизовали с двумя образцами общей РНК цельной крови, обработанной GLOBINclear, для каждого показанного донора. Двойные массивы также гибридизовали с образцами необработанной общей РНК от каждого донора.Образцы, обработанные GLOBINclear, продемонстрировали четкое и последовательное увеличение характеристик, называемых «присутствием» (среднее увеличение на 50%). Набор для амплификации аРНК MessageAmp ™ II-96 компании Ambion использовали для подготовки биотинилированной аРНК для гибридизации с использованием 1 мкг входящей РНК.

    Резюме

    Кровь - это наиболее часто используемая ткань для клинических исследований.К сожалению, образцы крови представляют препятствия для анализа экспрессии генов, которые не встречаются в большинстве других тканей. Сложная клеточная природа крови затрудняет обнаружение дифференциальной экспрессии генов, которая встречается только в подмножестве типов клеток. Более того, мРНК глобина составляет большую часть мРНК в образцах общей РНК цельной крови, что снижает чувствительность профилей экспрессии для других, менее распространенных видов РНК. Ambion предоставляет специальные инструменты для анализа крови. Эти инструменты не только предназначены для стабилизации РНК в образцах крови, что упрощает сбор образцов в полевых условиях, но и оптимизированы для удаления уникальных загрязняющих веществ, обнаруженных в крови, включая эритроциты (с помощью системы LeukoLOCK ™) или большого количества глобина. транскриптов (с использованием наборов GLOBINclear ™), что делает профилирование экспрессии лейкоцитов более значимым.

    Научные участники
    Мангки Боунпхенг, Анджела Баррелл, Курт Эванс, Синван Фанг, Марианна Голдрик, Хуанита С. Гонсалес, Натан Харрис, Дженнифер Хо, Куок Хоанг, Джон Кемппаниен, Гэри Лэтэм, Ивонн Мун, Шармили Мотури, Боб Сеттерквист, Уиллис Уитли , Вэй Вэй Сюй • Ambion, Inc.

    AM1819, AM1836, AM1837, AM1923, AM1933, AM1934, AM1980, AM7020

    .

    Выделение тотальной РНК из сложных тканей | Thermo Fisher Scientific

    Часто сложный процесс выделения интактной тотальной РНК из ткани становится еще более трудным при обработке некоторых проблемных тканей. Волокнистые ткани и ткани, богатые белком, ДНК и нуклеазами, представляют особые проблемы для выделения тотальной РНК. Некоторые из сложных тканей, требующих дополнительных манипуляций и тонкой настройки во время процедуры выделения РНК, - это сердце, мозг, тимус и селезенка.Здесь мы решаем проблемы, с которыми мы столкнулись, и предлагаем методы устранения неполадок, чтобы помочь преодолеть проблемы, связанные с выделением общей РНК из сложных тканей. Приведенные советы основаны на выделении РНК методом экстракции тиоцианатом гуанидиния / кислым фенолом: хлороформом (например, Total RNA Kit от Invitrogen Ambion). Обратите внимание, что многие из этих методов можно использовать и с другими протоколами выделения РНК.

    15596026, AM1910, AM1911, AM1912, AM1914, AM1920, AM7020, AM7021, AM9690

    Сердце и скелетные мышцы: волокнистые ткани

    Для фиброзных тканей, таких как сердце и скелетные мышцы крысы и мыши, самым сложным этапом процесса выделения может быть полное разрушение всех клеток при приготовлении гомогенатов тканей.Из-за низкой плотности клеток и полинуклеарной природы мышечной ткани выход общей РНК обычно невелик; поэтому очень важно максимально использовать имеющиеся ткани. Подготовку к гомогенизации следует проводить на сухом льду в жидком азоте. Измельчение ткани в порошок при сохранении ее полностью замороженной является ключом к выделению интактной общей РНК. Большие куски фиброзной ткани трудно полностью гомогенизировать, и это может привести к деградации РНК и очень низкому выходу. К сожалению, признаки осложнения появляются только в конце процесса выделения, во время расчета выхода и визуализации общей РНК на геле.Таким образом, во время первоначальной подготовки гомогената следует соблюдать осторожность, чтобы гарантировать целостность общей РНК.

    Упрощение трудной изоляции

    Характеристики ткани Симптомы Типичные ткани Изменения в методике
    Фиброзные ткани Трудно усреднить
    • Сердечная мышца
    • Скелетная мышца
    Тщательное разрушение: заморозить ткань и измельчить
    Nucliec add-rich Вязкостный, неполное разделение фаз, осаждение при добавлении изопропанола Разбавить лизат
    Сделать дополнительную экстракцию
    Богатые белками и липидами Белый хлопьевидный материал в водной фазе экстракции Разбавить лизат
    Изменить экстракцию (подробнее CHCI 3 )
    Богатые нуклеазами Деградированная РНК Эффективное разрушение
    Заморозить и измельчить ткани

    Мозг и ткани растений: ткани, богатые белками и липидами

    Выделение тотальной РНК из мозга крысы или мыши может быть очень полезным из-за больших результатов, получаемых после применения методов устранения неполадок.Ткани мозга и растений богаты липидами, что может усложнить процесс извлечения РНК, что затрудняет чистое разделение РНК. Очевидный признак проблемы возникает после того, как гомогенат мозга или растения был экстрагирован фенолом: хлороформом: ИУК. Белый хлопьевидный материал будет составлять большую часть объема водной фазы после центрифугирования. Этот белый материал, вероятно, содержит липиды и не образует плотной поверхности раздела. Чтобы исправить ситуацию, добавьте одну десятую часть хлороформа: IAA (т.e, 0,1 x сумма водного и органического объемов), хорошо перемешайте и повторно центрифугируйте. Для увеличения выхода органическую фазу повторно экстрагируют, а водную фазу повторно экстрагируют фенолом: хлороформом. В качестве альтернативы, повторно смешайте водную и органическую фазы, добавьте еще раствор для лизиса, эффективно разбавив белок и липиды, и повторно экстрагируйте смесью фенол: хлороформ: ИУК. Было также высказано предположение, что сначала экстракция лизата растительной ткани хлороформом, прежде чем приступить к выделению РНК, предотвращает образование белого хлопьевидного материала.

    Вариант для растительной ткани включает использование поливинилпирролидона (ПВП) на стадии лизиса перед органическими экстракциями. Комплексы ПВП с полисахаридами и полифенольными соединениями, обычно встречающимися в растениях. Комплексный материал центрифугируется из лизата, и лизат затем обрабатывается в соответствии с протоколом. Этот шаг предотвращает перенос загрязняющих веществ, которые могут препятствовать последующим применениям. Средство для выделения РНК растений Ambion - это раствор ПВП, который можно добавлять в лизаты тканей растений для удаления таких загрязнителей.

    Селезенка и тимус крысы: ткани, богатые нуклеиновыми кислотами и нуклеазами

    Селезенка и тимус крысы богаты нуклеазами и нуклеиновыми кислотами. Эффективная гомогенизация имеет решающее значение для снижения воздействия нуклеаз, обнаруженных в тканях.Измельчение селезенки и тимуса на мелкие кусочки на сухом льду в жидком азоте позволяет быстро гомогенизировать в лизирующем растворе, который инактивирует нуклеазы. Стадия фенольной экстракции лизатов тканей также может представлять проблемы. Высокое содержание ДНК и РНК в этих тканях делает гомогенаты необычно вязкими. Экстракция таких вязких гомогенатов иногда приводит к неполному разделению фаз. Добавление большего количества раствора для лизиса и / или повторной экстракции фенолом: хлороформом: ИУК поможет решить эту проблему.Кроме того, можно проводить множественные экстракции фенол: хлороформ: ИУК, чтобы гарантировать разделение ДНК на органическую фазу во время экстракции кислым фенолом в процедуре выделения РНК. Если сразу после добавления изопропанола после кислотной фенольной экстракции образуется белый осадок, это признак того, что загрязнение ДНК все еще присутствует. Центрифугируйте осадок, ресуспендируйте осадок в воде, свободной от нуклеаз, и экстрагируйте смесью фенол: хлороформ: ИУК до тех пор, пока этот быстро образующийся белый осадок не перестанет появляться.Высокие выходы интактной РНК могут быть достигнуты, если взять под контроль большое количество ДНК и нуклеаз.

    РНК , позже : Упрощение выделения РНК из сложных тканей

    Для любой из перечисленных выше тканей одной из проблем является остановка активности РНКазы после сбора ткани.Это часто достигается путем быстрого разрезания ткани на небольшие кусочки и помещения их в жидкий азот. «Быстрое замораживание» останавливает всю активность РНКазы в ткани. В замороженном состоянии кусочки ткани измельчают в порошок с помощью ступки и пестика. Затем порошок обрабатывают в соответствии с протоколом выделения РНК. Однако РНК все еще может разрушаться, если рассечение занимает слишком много времени или замороженная ткань оттаивает.

    Invitrogen RNA позже , водный, нетоксичный реагент для хранения тканей и клеток, стабилизирует и защищает клеточную РНК в неповрежденных, незамороженных тканях и образцах клеток.Ткань просто помещается в 5 объемов РНК позже . Реагент немедленно проникает в ткань и инактивирует РНКазы. Таким образом, РНК позже избавляет от необходимости использовать жидкий азот, что часто неудобно и в определенных условиях (например, в полевых условиях) не является реалистичным вариантом для быстрого сохранения тканей. Образцы ткани, обработанные РНК , позже , можно хранить в течение дня при 37 ° C, недели при 25 ° C, месяца при 4 ° C и неопределенно долго при -20 ° C. РНК можно выделить стандартными методами одностадийной фенольной экстракции или методами связывания со стеклом, а также методами, которые используют олиго d (T) отбор мРНК.Ткань просто удаляется из РНК , позже и обрабатывается, как свежая ткань, в растворе для лизиса выделения РНК. Нет необходимости замораживать и измельчать ткань с помощью ступки и пестика, хотя замораживание и измельчение можно выполнить при желании. (Примечание: РНК позже может не подходить для некоторых образцов растений и бактерий.)

    .

    Надежное высокопроизводительное выделение РНК из образцов крови | Thermo Fisher Scientific

    Цельная кровь млекопитающих - широко используемая ткань для молекулярных анализов из-за большого количества генетической информации, а также легкости и простоты сбора образцов. Выделение РНК из цельной крови является сложной задачей, но в наборе для выделения РНК крови MagMAX ™ -96 от Ambion используются сильные денатурирующие условия лизиса и протеазы для эффективной инактивации рибонуклеаз и удаления белков крови.

    Технология крови MagMAX-96

    Для очистки РНК технология MagMAX на основе магнитных шариков Ambion обеспечивает быстрый и простой протокол, исключающий использование органических растворителей, а также проблемы, связанные с методами на основе стекловолоконных фильтров (например,g., засорение фильтра и непоследовательный выход РНК). Образцы цельной крови (и молока) можно обрабатывать вручную с помощью многоканальных пипеток или адаптировать для автоматизации для получения общей и вирусной РНК с высоким выходом, качеством и чистотой. Извлеченная РНК идеальна для последующей молекулярной диагностики и профилирования экспрессии генов с использованием количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (qRT-PCR).

    Получение высококачественной общей РНК из крови

    Общая РНК высокого качества из цельной крови человека (свежей или хранящейся при 4 ° C) может быть легко и эффективно восстановлена ​​с помощью MagMAX-96 Blood.Например, общая РНК (8 реплик от нескольких доноров) была выделена с использованием стандартного протокола крови MagMAX-96, который включает лизис ткани / клеток и захват образца магнитными шариками с последующей обработкой ДНКазой TURBO. Была получена высококачественная интактная РНК с соотношением 28S / 18S рРНК> 0,9 (биоанализатор Agilent® 2100) (рис. 1). Выход РНК определяли с помощью A260 в среднем диапазоне 0,31–0,52 мкг общей РНК из всех образцов (по 50 мкл каждого).
    Рис. 1. MagMAX ™ -96 Кровь последовательно восстанавливает интактную общую РНК из свежей крови и крови, хранящейся при 4ºC. Цельная кровь человека от четырех разных доноров была собрана в пробирки с EDTA – Vacutainer®; аликвоты хранили при 4ºC в течение 24 часов. На следующий день у тех же доноров собирали свежую цельную кровь для одновременного выделения РНК с образцами, хранящимися при 4ºC. Суммарную РНК выделяли из 50 мкл крови от нескольких доноров в 8 повторах с использованием набора MagMAX-96 Blood Kit, а общую РНК (~ 50 нг) из репрезентативных образцов анализировали на биоанализаторе Agilent® 2100 (A). Выход РНК определяли путем измерения A260 с использованием спектрофотометра NanoDrop® ND-1000A (B).Загрязнение геномной ДНК

    определяли с помощью одностадийной кОТ-ПЦР, нацеленной на мРНК hTBP (человеческий ТАТА-связывающий белок) и RPII (РНК-полимераза II) [(+) реакции RT] и гены [(-) реакции RT]. Общая РНК, очищенная из всех образцов, содержала минимальную контаминацию геномной ДНК, что было оценено по значениям дельта-Ct из qRT-PCR (рисунок 2). Были получены аналогичные (+) значения RT Ct для qRT-PCR (hTBP и RPII) с использованием РНК, выделенной из свежей крови и крови, хранящейся при 4 ° C.


    Рисунок 2.Сравнение общей РНК, выделенной из свежей крови и крови, хранящейся при 4 ° C, в анализах qRT-PCR. Общая РНК (~ 25 нг) была выделена с помощью набора MagMAX ™ -96 Blood Kit и использовалась в qRT-PCR, нацеленной на мРНК TATA-связывающего белка (TBP, панель A) и РНК-полимеразы II (RPII, панель B) [(+ ) Реакции RT] и гены [(-) реакции RT]. Минимальная контаминация геномной ДНК выявлялась по значениям Ct реакций (+) RT и (-) RT. Сходный общий выход и качество РНК были получены из свежей и крови, хранящейся при 4 ° C (в течение 24 часов), что продемонстрировано аналогичными (+) значениями RT Ct.РНК

    , выделенная из крови, хранившейся при -80 ° C, имела аналогичный выход, но более низкую целостность, чем образцы из свежей крови или крови, хранящейся при 4 ° C (данные не показаны). Распад РНК может быть результатом гемолиза при оттаивании; однако РНК все еще можно использовать для успешной кОТ-ПЦР, дающей ценный профиль экспрессии генов.

    Высокопроизводительное выделение РНК крови для ветеринарной молекулярной диагностики

    Возможность прямого использования цельной крови для выделения общей и вирусной РНК снижает перекрестное загрязнение и экономит время и ресурсы.Этот новый набор разработан для высокопроизводительного выделения 50 мкл образцов вирусов и общей РНК в 96-луночном планшете. Набор для выделения РНК крови MagMAX-96 успешно использовался для анализа общей и вирусной РНК из цельной крови крупного рогатого скота (рис. 3), свиньи и овцы, а также образцов коровьего молока, что позволяет проводить высокопроизводительную вирусную и ветеринарную молекулярную диагностику.

    Рис. 3. MagMAX ™ -96 Blood легко адаптируется для автоматизации. Инфекция, вызванная вирусом вирусной диареи крупного рогатого скота (BVDV), представляет собой серьезную проблему мирового распространения, которая приводит к экономическим потерям для мясной и молочной промышленности.Кровь и молоко являются идеальными источниками образцов для выделения РНК BVDV благодаря простоте и легкости сбора образцов. BVDV-положительные и отрицательные образцы крови крупного рогатого скота помещали аликвотами (50 мкл) в отдельные лунки 96-луночного планшета и обрабатывали, используя протокол крови MagMAX-96 на Biomek® 2000 (Beckman Coulter). Контрольную РНК вносили в каждую лунку с образцом с равным количеством копий, чтобы контролировать последовательность обработки образца 96-луночного планшета. Очищенную РНК впоследствии использовали для qRT-PCR, нацеленного на РНК BVDV и контрольную РНК.Амплификация мишени BVDV была очень последовательной: средний Ct = 21,4 ± 0,5. Амплификация контрольной РНК была эквивалентной (средний Ct = 28,3 ± 0,4) для 96 образцов. Перекрестного загрязнения не наблюдалось. Для обработки полной пластины образцов требуется ~ 1 час.

    Протокол MagMAX-96 Blood позволяет быстро (<1 час) выделить общую и вирусную РНК из образцов крови (до 50 мкл), а также применим для выделения вирусной РНК из образцов молока. РНК элюируется малосолевым буфером (20–50 мкл) и может быть непосредственно использована для qRT-PCR.

    Научные участники

    Анжела Баррелл, Куок Хоанг, Рой Крис Уиллис, Вэй Вэй Сюй, Мангки Боунпхенг, Синван Фанг • Ambion, Inc.

    .

    Автоматизация выделения РНК | Thermo Fisher Scientific

    Для крупномасштабных проектов по скринингу экспрессии генов требуются надежные высокопроизводительные методы выделения высококачественной РНК из большого количества образцов. Чтобы удовлетворить эту растущую потребность, Ambion разработал Набор RNA Water ™ -96. Этот набор, в котором используется РНК-связывающий фильтр из стекловолокна, обеспечивает высокие выходы интактной РНК в формате 96-луночного планшета. Дополнительная обработка ДНКазой на фильтре может быть выполнена, чтобы гарантировать удаление геномной ДНК для приложений RT-PCR.Поскольку набор совместим с обычно используемыми вакуумными коллекторами 96-луночных планшетов, процедура легко автоматизируется для использования с высокопроизводительными системами обработки жидкости. Недавно компания Ambion в сотрудничестве с PerkinElmer Life Sciences разработала протокол автоматизации для набора RNA Water-96 Kit с использованием системы обработки жидкостей Packard MultiPROBE® II HT. Этот метод воспроизводимо дает высококачественную тотальную РНК как из прикрепленных, так и из суспендированных культивированных клеток млекопитающих. Чтобы продемонстрировать высокое качество РНК, которое можно получить с помощью набора RNA Water-96 Kit на роботизированной платформе, РНК из нескольких образцов клеток HeLa S3 и K562 была выделена с использованием метода, описанного в «Протоколе автоматизации RNA Water-96».Вкратце, клетки HeLa S3 (прикрепленные) и K562 (суспендированные) переносили в 96-луночный планшет с глубокими лунками в количестве 3,75 × 105 клеток / лунку. Клетки HeLa инкубировали в течение 2 дней перед выделением РНК, тогда как клетки K562 обрабатывали немедленно. Полученную РНК оценивали как по выходу, так и по качеству на биоанализаторе Agilent 2100. Урожайность была стабильно высокой (~ 5 пг на клетку для клеток HeLa S3 и ~ 8 пг на клетку для клеток K562), а образцы РНК были однородно неповрежденными. Кроме того, была эффективно удалена геномная ДНК.Электрофореграмма, демонстрирующая высокое качество восстановленной РНК, показана на рисунке 1.
    Рис. 1. РНК, выделенная с использованием автоматизированного протокола RNA Water-96. Культивируемые клетки K562 (лейкоз человека, выращенные в суспензии) осаждали и ресуспендировали в 1Х фосфатно-солевом буфере (PBS), подсчитывали и переносили в 48 лунок глубокого 96-луночного планшета при 3,75 × 105 клеток / лунку. Тотальную РНК выделяли с использованием автоматизированного метода, описанного в «Протоколе автоматизации RNA Water-96», с использованием RNA Water-96 и система для обработки жидкостей MultiPROBE II HT с платформой для захвата.Этот образец РНК, который был репрезентативным для 48 выделенных и проанализированных образцов, имел соотношение 28S рРНК к 18S рРНК, равное 1,92, что указывает на высокий уровень целостности. Это выделение дало 24 мкг РНК (344 нг / мкл в 70 мкл).

    Отсутствие воспроизводимости может быть проблемой при использовании некоторых методов выделения РНК. ОТ-ПЦР в реальном времени использовалась для оценки воспроизводимости автоматизированной процедуры RNA Water-96. Поскольку ОТ-ПЦР в реальном времени является количественной, воспроизводимой и может использоваться для одновременного анализа нескольких образцов, это хороший выбор для такого анализа.Как избыточная (GAPDH), так и редкая мишень (hTERT: каталитическая субъединица теломеразы человека) были индивидуально проанализированы в ранее описанных образцах РНК HeLa S3 и K562 с использованием анализа TaqMan®. Результаты анализа 9 образцов из клеток K562 показаны на рисунке 2. Были рассчитаны значения порога цикла (Ct), которые отражают количество целевой РНК, присутствующей в образце (рисунок 3). Хотя наблюдались некоторые различия в урожайности между лунками-репликаторами, это, скорее всего, связано с несколькими факторами, не связанными с методом выделения, включая изменение количества клеток, вручную распределенных в каждую лунку, а также изменение роста и обновления клеток во время инкубации.Важно отметить, что постоянное соотношение hTERT и GAPDH в реплицируемых образцах указывает на то, что мРНК как с высоким, так и с низким содержанием воспроизводимо выделяются с помощью автоматизированного протокола RNA Water-96.


    Рис. 2. Обнаружение GAPDH и hTERT в режиме реального времени с помощью ОТ-ПЦР в реплицируемых образцах, выделенных с использованием протокола автоматизации RNA Water-96. РНК выделяли, как описано на рисунке 1. Образцы анализировали с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени с использованием праймеров и зонда TaqMan® для GAPDH (A.) или hTERT (B.) в детекторе последовательности ABI 7700. Здесь показаны данные из 9 образцов, каждая из которых обозначена отдельной цветной линией. Значения среднего порога цикла (Ct) для всех образцов показаны на рисунке 3.
    Клеточная линия Цель Среднее значение Ct Стандартное отклонение
    K562 GAPDH 15,86 0,45
    hTERT 23.63 0,54
    hTERT / GAPDH 1,49 0,03 (CV = 1,79%)
    HeLA S3 GAPDH 16,18 0,8
    hTERT 26 1.01
    hTERT / GAPDH 1,61 0.30 (CV = 2,1%)

    Рис. 3. Средние значения Ct по результатам анализа 48 образцов с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени.

    Несмотря на то, что в этом примере использовалась система обработки жидкостей Packard MultiPROBE II HT, набор RNA Water-96 легко адаптируется к другим автоматизированным платформам. В набор RNA Water-96 входят реагенты и расходные материалы для проведения 192 выделений, от 100 до 2 x 106 клеток или от 0,1 до 1,5 мг ткани на образец. Включены реагенты для дополнительной обработки ДНКазой на фильтре.

    MultiPROBE® является зарегистрированным товарным знаком Packard BioScience Company. TaqMan® является зарегистрированным товарным знаком Roche Molecular Systems, Inc.

    .

    Смотрите также