Генотипирование выделение днк

генотипирование это — 25 рекомендаций на Babyblog.ru

История моей сестры, в общем нам нужна помощь. Моя сестра болеет гепатитом уже давно, но основная головная боль ее сын. Мальчику 9 лет спортивный и здоровый в целом парень, слава Богу! Только худой сильно - 35 кг, но диагнозов нет никаких на этот предмет, только лямблии когда - то находили. У ребенка нашли антиВГС и HBS антиген - положительные. igMHBcor . Возможно, мои, но у меня HBS антиген находили всего пру раз, а потом все время ( раз 25- отрицательные). Грудью кормила до полугода. При родах порезали сыночку немного головку, почему я и стала паниковать. Все это время сдавали анализы, обследовались, в итоге то минус, то плюс...

В 1 год ПЦР - положительный,

В 2 года - ПЦР в сыворотке отрицательный, в мононуклеарах положительный.

Генотипирования не было. Вирусной нагрузки тоже.

После чего, Терапию не рекомендовали и не назначали , лечились у гомеопатов и прочими ерундами, а родился вот такой диагноз:

Цитирую доцента кафедры инф. Болезней :

Хронический гепатит с ( РНК ВГС плюс)с перинатальном инфицированием минимальной активности: рекомендовано диета 5 стол, курсы гепатопротекторов 2-3 в год, гомеопатия

Понимаю, что лечение ни о чем, но тогда информации было мало, лечили именно так.

после ее диагноза в карте узисты инфекционки ставили ему - нарушение обменных процессов в печени и перегиб в желчном, причем Узи с других центрах - без патологий в тот же период.

Но стала я сомневаться впоследствии в диагнозе - из 30 ( или больше !) обследований различными методами - ИФА, ПЦР в сыворотке и мононуклеарах в разных лабах, в том числе трижды сами возили за тридевять земель в Вектор с спид центр - отрицательно!

Познакомилась с сотрудниками многих лабораторий в городе и спидцентре ( сейчас работают в крупных центрах в Америке, с компетенции сомневаться не приходится). Лично беседовала после проведенных анализов. Они твердили, что вируса нет точно. Возвращались деньги за генотипирование и количественный ПЦР - нечего определять, мол. Последние исследования двухгодичной и полуторагодичной давности:

ИФА ( весь спектр в Векторе - отрицательно!, ПЦР в Ивитро - отрицательно, ИФА в другой лабе в районной поликлинике - отрицательно).

Я лично беседовала с завед. Лабораторией ИФА диагностики в Векторе - она в недоумении : откуда диагноз, если нет никаких антител! Костерит неграмотных врачей. Отчасти объясняет возможностью ошибки из- за несовершенства тест- систем десять. Говорит, что в лабах той поры чашки для исследований мыли проточной водой. Мол, чего вы хотите?

У инфекциониста в детской инфекционной не были года 4. У нее позиция не менялась - если хоть раз выявляли - значит есть. Но противовирусную терапию не назначала.

Как думаете - что с нами было - ложноположительные анализы, такое течение гепатита?

Или просто автоматически примерили диагноз матери ребенку?

У меня целая альтернативная история болезни. В пол- ке по настоящему месту жительства про наши мытарства ничего не знают.

Логика инфекциониста - доцента - хоть раз выявляли , значит был или есть.

Плюс находила пару сосудистых звездочек, плюс один раз повышались ферменты после перенесенной кишечной инфекции - псевдотуберкулеза.

Плюс один раз из 15 на УЗИ в той же инфекционке была повышена незначительно эхогенность паренхимы.

Фсе!

Настоящее и будущее персонального генотипирования

Медицина, являясь одним из наиболее значимых социально-ориентированных направлений многогранной человеческой активности, находится в состоянии постоянной эволюции, с тем, чтобы всё более эффективно справляться с недугами людской популяции.

Вместе с тем, принимая во внимание революционные успехи прикладной биотехнологической науки за последнее время, можно констатировать, что медицинская отрасль, на сегодняшний день, обрела уникальный могущественный инструментарий в лице генетической инженерии, которая, по всей видимости, сыграет судьбоносную роль в кардинальном изменении направления вектора развития человечества.

В частности, фокусируя взгляд на частной биотехнологии, нельзя не обратить внимание на вновь зарождающееся, благодаря инновационным тенденциям в геномной области, ответвление в индивидуализированной медицинской практике, связанное с генотипированием, чему и посвящена данная статья.

Итак, если коротко, то генотипирование — это метод, позволяющий, на основе изучения ДНК, комплексно проанализировать уникальный для каждого человека генотип (представляющий собой характерную для конкретного индивида совокупность генов, отличающую одних людей от других).

Суть данного метода состоит в исследовании вариаций генетического кода (его алфавит состоит из четырёх букв-нуклеотидов: А — аденин, G — гуанин, С — цитозин, T — тимин), которые имеют место, поскольку гены, являющиеся структурной и функциональной единицей наследственности и контролирующие развитие тех или иных признаков или свойств, подвержены изменениям за счёт ротации последовательности вышеназванных нуклеотидов в цепи ДНК.

Довольно любопытно, что количество подобных изменений (характеризующихся однонуклеотидными полиморфизмами (Single Nucleotide Polymorphism, SNP) и вариациями числа копий (Copy Number Variations, CNV), такими как делеция и дупликация) в геноме человека, придающих генотипу неповторимые свойства, составляет всего лишь около 1 % от всей нуклеотидной последовательности человека.

В настоящее время, персональное генотипирование, заключающееся в нахождении в геноме человека специфических изменений (для удобства, они систематизированы в универсальные базы данных) и их интерпретации, даёт исключительно востребованную возможность выявлять у обследуемого предрасположенность к различным заболеваниям (в том числе, сердечно-сосудистым, эндокринным, онкологическим, психическим и т. д.), определять врождённые сильные черты и нераскрытый генетический потенциал в той или иной сфере, узнавать, по желанию, информацию о его происхождении, спортивных способностях, степени лояльности к медицинским препаратам и иных физических аспектах.

В будущем, планируется объяснить ещё и взаимосвязь генов личности с биоритмами, половыми предпочтениями, а также такими одухотворёнными параметрами, как: агрессивность, альтруизм, особенности характера и многими другими.

Остаётся добавить, что в качестве необходимого для проведения описываемой процедуры биоматериала, учитывая идентичность молекул ДНК во всех клетках организма, достаточно использовать немного слюны (при условии чистоты полости рта), что, объективно, намного комфортнее, чем сдача, например, крови. При этом результаты, в большинстве случаев, становятся известны через несколько недель после обращения в соответствующую лабораторию.

В заключение, видится целесообразным отметить, что, хотя человек формируется под воздействием не только своего генотипа, но и внешней среды, его знание, всё же, внесёт весомый вклад в повышение вероятности предотвращения коренных проблем со здоровьем, станет отличным подспорьем для генодиагностики и генотерапии (идентифицирующие и устраняющие генетические дефекты и наследственные патологии), поспособствует выбору наиболее физиологически и ментально приемлемого рода профессиональной деятельности, принципиально повысит продолжительность жизни и в целом существенно улучшит её уровень.

Автор: к. т. н. Пайлеванян Б. С.

----------

При приеме на работу, на многих должностях требуется предъявить медкнижку. Если вам необходимо купить медкнижку мы поможем вам в этом вопросе. Поможем вам быстро пройти все обследования без простаивания в очереди. 

Генотипирование, секвенирование — Студопедия

Введение

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) была изобретена в 1983 году американским биохимиком КэриМуллисом. Его целью была амплификация (увеличение количества копий) участка ДНК. Первая публикация, описывающая применение ПЦР для амплификации гена бета-глобина и пренатальной диагностики серповидно-клеточной анемии была опубликована в 1985 году в журнале Science. И уже через 8 лет после этого за изобретение метода ПЦР К. Муллис получил Нобелевскую премию.

В начале использования метода после каждого цикла нагревания и последующего охлаждения в реакционную смесь добавлялиаликвотуфермента ДНК-полимеразы, так как она инактивировалась при высокой температуре, необходимой для плавления цепей ДНК. В связи с этим процедура проведения реакции была сравнительно неэффективной, требовала много времени и фермента.

В 1986 году метод полимеразной цепной реакции был существенно улучшен: было предложено использовать ДНК-полимеразу из термофильных бактерий– организмов, живущих при относительно высоких температурах свыше 45 °C. Такие термостабильные ферменты способны выдерживать множество циклов нагревания в процессе полимеразной реакции.Их использование позволило упростить и автоматизировать проведение ПЦР. Одна из первых термостабильных ДНК-полимераз была выделена из бактерий Thermusaquaticus и названа Taq-полимеразой.Недостаток этого фермента заключается в том, что вероятность внесения ошибочного нуклеотида в цепь ДНК у неё достаточно высока, так как у этого фермента отсутствуют механизмы исправления ошибок (3'→5' экзонуклеазная активность). Полимеразы Pfu и Pwo, позднее были выделены из Архей и обладают таким механизмом исправления ошибок. Использование этих полимераз значительно уменьшает число мутаций в ДНК, однако их скорость амплификации ниже, чем у полимеразы Taq.

Репликация ДНК

Репликация ДНК– процесс синтеза дочерней молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты на матрице родительской молекулы ДНК. В ходе последующего деления материнской клетки каждая дочерняя клетка получает по одной копии молекулы ДНК, которая является идентичной ДНК исходной материнской клетки. Этот процесс обеспечивает точную передачу генетической информации из поколения в поколение. Репликацию ДНК осуществляет сложный ферментный комплекс, состоящий из более 20 различных белков.

Репликация начинается с расплетания двойной спирали ДНК, при этом формируется репликационная вилка — место непосредственной репликации ДНК. В репликационной вилке ДНК копирует крупный белковый комплекс, ключевым ферментом которого является ДНК-полимераза. Репликационная вилка движется со скоростью порядка 100 000 пар нуклеотидов в минуту у прокариот и 500–5000 у эукариот.

Ферменты (хеликаза, топоизомераза) и ДНК-связывающие белки расплетают ДНК, удерживают матрицу в разведённом состоянии и вращают молекулу ДНК. Правильность репликации обеспечивается точным соответствием комплементарных пар оснований и активностью ДНК-полимеразы, способной распознать и исправить ошибку.

Цепи молекулы ДНК расходятся, образуют репликационную вилку, и каждая из них становится матрицей, на которой синтезируется новая комплементарная цепь. В результате образуются две новые двуспиральные молекулы ДНК, идентичные родительской молекуле.

Принципы репликации

· матричный — последовательность синтезируемой цепи ДНК однозначно определяется последовательностью материнской цепи в соответствии с принципом комплементарности;

· полуконсервативный — одна цепь молекулы ДНК, образовавшейся в результате репликации, является вновь синтезированной, а вторая — материнской;

· идёт в направлении от 5’-конца новой молекулы к 3’-концу;

· необходимость в затравке (праймере).

ДНК-полимераза

ДНК-полимераза – основной фермент репликации ДНК. В обычной ПЦР применяют ДНК-зависимую ДНК-полимеразу (КФ 2.7.7.7), которая использует в качестве матрицы одну из цепей ДНК. Для анализа РНК в ПЦР с обратной транскрипцией используют РНК-зависимую ДНК-полимеразу (обратную транскриптазу, КФ 2.7.7.49).

Для нормального функционирования ДНК-полимеразе требуется присутствиеионов магния в качестве кофактора. В отсутствие ионов магния ДНК-полимераза неактивна. ДНК-полимераза начинает репликацию ДНК, связываясь с двуцепочечным участком ДНК (затравкой, праймером) и присоединяет нуклеотиды в направлении 5’→3’. В качестве субстрата ДНК-полимераза использует нуклеозидтрифосфаты (дАТР, дАТР, дЦТР, дГТФ).

Амплификатор

Амплификатор (термоциклер, ПЦР-машина) – прибор, обеспечивающий периодическое охлаждение и нагревание пробирок, обычно с точностью не менее 0,1° C. Современные амплификаторы позволяют задавать нужное количество циклов и выбирать оптимальные временные и температурные параметры для каждой процедуры цикла.

Прибор производит определенное количество попеременных нагревов и охлаждений (термоциклов) в зависимости от используемого метода и повторяет их множество раз. Для получения лучшего результата изменения температурных уровней должны совершаться в течение минимального промежутка времени. С помощью амплификатора температура цикла может быть достигнута

за считанные секунды, даже начиная с удаленных значений последней установленной точки. Данные изменения происходят с поддержанием идеальной однородности между различными точками блока. Систему также можно запрограммировать так, чтобы создать условия линейно и градиентно изменяющейся температуры по ширине блока. Таким образом достигается определение и оптимизация точек с наивысшим уровнем производительности.

Амплификатор ДНК состоит из внутренней системы крышки с нагревательным элементом и регулировкой высоты для того, чтобы адаптировать прибор к размерам пробирок с образцом. Таким образом, предотвращается конденсация в верхней части образцов. Прибор работает на основе системы нагревания, получающей непрерывное питание от источника электрического тока и состоящей из нескольких термоэлектрических модулей с эффектом Пельтье, радиатором с низкими теплопотерями и системой вентиляторного конвектора. Все элементы амплификатора составляют один блок. Благодаря этому система позволяет увеличивать производительность процесса, а также быстро определять и изменять температуру блока, переходя от высшего предела температуры к низшему в течение минимального времени.

Стадии ПЦР

Метод ПЦР основан на многократном избирательном копировании определённого участка при помощи ферментов invitro(в пробирке). При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце. В отличие от репликации ДНК в живых организмах, с помощью ПЦР амплифицируются относительно короткие участки ДНК, в обычной реакции длина копируемых ДНК-участков составляет не более 3000 пар оснований. Однако, использование смесей различных полимераз, а также специальных ДНК-полимераз, позволяет при определённых условиях копировать участки длиной до 40 тысяч пар нуклеотидов. Обычно при проведении ПЦР выполняют 20-35 циклов, каждый из которых состоит из трёх стадий: денатурации матрицы, отжига праймеров и элонгации.

Реакционная смесь для проведения ПЦР состоит из матрицы – ДНК, участок которой необходимо амплифицировать, пары праймеров – олигонуклеотидов длиной около 20 оснований, комплементарных целевой последовательности ДНК, фермента ДНК-полимеразы, дезоксинуклеозидтрифосфатов и хлорида магния, буферного раствора (поддерживает рН реакционной смеси на постоянном уровне). Чтобы избежать испарения реакционной смеси, в пробирку добавляют минеральное масло, если используется амплификатор с подогревающейся крышкой, этоне требуется.

Денатурация

Реакционную смесь нагревают до 94–96 °C на 0,5-2 минуты, чтобы цепи ДНК денатурировали. При этом происходит разрушение водородных связей между азотистыми основаниями цепей ДНК. Обычно, перед первым циклом проводят длительный прогрев реакционной смеси в течение 2–5 мин для полной денатурации геномной ДНК.

Отжиг

После плавления матрицы ДНК температуру понижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей. Температура отжига зависит от состава праймеров и обычно выбирается на 5 градусов меньше, чем температура плавления (диссоциации) праймеров. Неправильный выбор температуры отжига приводит либо к плохому связыванию праймеров с матрицей (при завышенной температуре), либо к связыванию в неверном месте и появлению неспецифических продуктов (при заниженной температуре). Время стадии отжига порядка 30 сек, за это время полимераза способна синтезировать несколько сотен нуклеотидов, поэтому рекомендуют подбирать праймеры с температурой плавления выше 60 °C и проводить отжиг и элонгацию одновременно, при 60–72 °C.

Элонгация

ДНК-полимераза присоединяет нуклеотиды только к существующим молекулам ДНК, поэтому для репликации матричной цепи ДНК требуется праймер (затравка) – короткий одноцепочечный фрагмент ДНК, комплементарный заданному участку.

На стадии элонгации ДНК-полимераза начинает синтез второй цепи от 3'-конца праймера, который связался с матрицей. Температура, оптимальная для элонгации, зависит от полимеразы: часто используемые полимеразы Taq и Pfu наиболее активны при 72 ° C. Время элонгации зависит как от типа ДНК-полимеразы, так и от длины амплифицируемого фрагмента. Обычно время элонгации принимают равным одной минуте на каждую тысячу пар оснований. После окончания всех циклов часто проводят дополнительную стадию финальной элонгации, чтобы достроить все одноцепочечные фрагменты. Эта стадия длится 7–10 минут.

Количество специфического продукта реакции, ограниченного праймерами, возрастает пропорционально 2ⁿ, где n – число циклов реакции. На самом деле эффективность каждого цикла как правило меньше 100 %, поэтому в действительности количество продукта пропорционально (1+E)ⁿ,где Е – средняя эффективность цикла. Число протяженных копий ДНК, ограниченных одним праймером, растет линейно, поэтому в продуктах реакции доминирует специфический фрагмент. Амплификация целевого продукта в геометрической прогрессии ограничена количеством реагентов, присутствием ингибиторов (веществ, которые подавляют или тормозят реакцию), образованием побочных продуктов. На последних циклах реакции рост замедляется, это называют «эффектом плато».

Применение ПЦР

ПЦР используют в медицине для диагностики, в научно-исследовательских лабораториях.

Диагностика

ПЦР дает возможность существенно ускорить и облегчить диагностику инфекционных (вирусных, бактериальных) и наследственных заболеваний. Из крови пациента выделяют препарат ДНК, заданный ген амплифицируют с помощью ПЦР с использованием соответствующих специфических праймеров, а затем проводят секвенирование (определение их или нуклеотидной последовательности)амплифицированного участка и анализируют его. Вирусные и другие инфекционные заболевания при помощи ПЦР можно диагностировать практически сразу после заражения, за недели или месяцы до того, как проявятся симптомы заболевания, по появлению продуктов реакции амплификации (присутствия ДНК инфекционного агента).

Важную роль играет ПЦР и в персонализованной медицине: иногда лекарства оказываются токсичными или аллергенными для некоторых пациентов, причиной этого является различие в восприимчивости и метаболизме лекарств. Эти различия определены на генетическом уровне, например, цитохромыпечени разных пациентов могут отличатьсяактивностью в отношении определенных субстратов. Для того, чтобы определить, какой разновидностью цитохрома обладает данный пациент, перед применением лекарства может быть проведено предварительное генотипирование и разработана индивидуальная схема лечения.

Генотипирование, секвенирование

Клонирование генов – это процесс выделения гена и получения большого количества продукта данного гена. ПЦР используют в клонировании для амплификации участка ДНК, который в дальнейшем встраивают вдругой фрагмент ДНК (вектор), переносящий чужеродный ген в другой организм. В качестве векторов используют, например, плазмиды (кольцевые молекулы ДНК) или вирусы. При помощи клонирования генов в биотехнологии получают многие белки, например, инсулин, интерфероны.

В методе секвенирования поСэнгеру с использованием меченых флуоресцентной меткой или радиоактивным изотопом дидезоксинуклеотидтрифосфатов,ПЦР является неотъемлемой частью, так как именно в ходе полимеризации в цепь ДНК встраиваются производные нуклеотидов, меченные флуоресцентной или радиоактивной меткой. Присоединение дидезоксинуклеотида к синтезируемой цепи приводит к обрыву синтеза, позволяя определить положение специфических нуклеотидов после разделения в полиакриламидном геле или при помощи капиллярного электрофореза.

Криминалистика

ПЦР используют для сравнения так называемых «генетических отпечатков пальцев». Для этого необходим образец генетического материала с места преступления – кровь, слюна, сперма, волосы: из образца выделяют ДНК и сравнивают с генетическим материалом подозреваемого. Достоинством метода является то, что для анализа требуется совсем малое количество ДНК. Продукты амплификации расщепляют на фрагменты, и разделяют с помощью агарозного электрофореза. Полученную картину расположения полос ДНК и называют «генетическим отпечатком».

Установление отцовства. Хотя «генетические отпечатки» уникальны, за исключением однояйцевых близнецов, родственные связи все же можно установить, сделав несколько таких отпечатков. Комбинации отпечатков позволяют судить о том, являются доноры ДНК родственниками, или нет.

Кофеин

Кофеин – алкалоид пуринового ряда. Он содержится в листьях и плодах растений: кофейное дерево, чай, какао, мате, гуарана, кола и другие. Кофеин синтезируется растениями для защиты от насекомых, поедающих листья, стебли и зёрна, а также для поощрения опылителей. Он является психостимулятором, содержится в кофе, чае.

Кофеин стимулирует центральную нервную систему человека, усиливает сердечную деятельность, ускоряет пульс, вызывает расширение кровеносных сосудов, обладает мочегонным эффектом, снижает агрегацию тромбоцитов.

Биологическая активность кофеина связана с тем, что кофеин блокирует фермент фосфодиэстеразу, разрушающий цАМФ, что приводит к его накоплению в клетках. цАМФ–вторичный посредник, через который осуществляются эффекты различных физиологически активных веществ, прежде всего, адреналина. Таким образом, накопление цАМФ приводит к адреналино-подобным эффектам.

В медицине кофеин применяют в составе средств от головной боли, при мигрени, как стимулятор дыхания и сердечной деятельности при простудных заболеваниях, для повышения умственной и физической работоспособности, для устранения сонливости.

История изучения

Кофеин был открыт в 1819 году немецким химиком Фердинандом Рунге. В 1827 году Удри выделил из чайных листьев новый алкалоид и назвал его теином.

В чистом виде кофеин впервые получен в 1828 году Пьером Ж Пеллетье и Жозефом Б. Кавантом. В 1838 году Иобст и Мульдер доказали, что теин и кофеин – одно и то же вещество.

Структура кофеина была установлена в конце XIX века Фишером. Он впервые искусственно синтезировал кофеин.

Физические свойства

Химически чистый кофеин — это белые игольчатые кристаллы горьковатого вкуса, без запаха. Кофеин плохо растворим в холодной воде (1 г на 46 мл воды), легко — в горячей (1 г на 5,5 мл воды при 80 С; 1 г на 1,5 мл кипящей воды). Также 1 г кофеина растворим в 66 мл этанола; в 22 мл этанола при 60 С; в 50 мл ацетона; в 5,5 мл хлороформа; в 530 мл эфира; в 100 мл бензола; в 22 мл кипящего бензола.

Растворы кофеина имеют нейтральную реакцию.

SNP-генотипирование - SNP genotyping - qaz.wiki

Генотипирование SNP - это измерение генетических вариаций однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) между членами вида. Это форма генотипирования , которая является измерением более общей генетической изменчивости. SNP - один из наиболее распространенных типов генетической изменчивости. SNP - это мутация одной пары оснований в определенном локусе , обычно состоящая из двух аллелей (где частота редких аллелей составляет> 1%). Было обнаружено, что SNP вовлечены в этиологию многих заболеваний человека и вызывают особый интерес в фармакогенетике . Поскольку SNP сохраняются в процессе эволюции, они были предложены в качестве маркеров для использования в анализе локусов количественных признаков ( QTL ) и в исследованиях ассоциаций вместо микросателлитов . Использование SNP расширяется в проекте HapMap , целью которого является предоставление минимального набора SNP, необходимого для генотипирования генома человека. SNP также могут предоставить генетический отпечаток пальца для использования при проверке личности. Повышение интереса к SNP отразилось в бурной разработке разнообразных методов генотипирования SNP.

Методы на основе гибридизации

Было разработано несколько приложений, которые опрашивают SNP путем гибридизации дополнительных ДНК-зондов с сайтом SNP. Задача этого подхода - снизить перекрестную гибридизацию между аллель-специфическими зондами. Эта проблема обычно решается путем изменения условий жесткости гибридизации.

Динамическая аллель-специфическая гибридизация

Генотипирование с динамической аллель-специфической гибридизацией (DASH) использует преимущества различий в температуре плавления ДНК, которые возникают в результате нестабильности несовпадающих пар оснований. Этот процесс можно значительно автоматизировать, и он включает несколько простых принципов.

На первом этапе геномный сегмент амплифицируется и прикрепляется к шарику посредством реакции ПЦР с биотинилированным праймером. На втором этапе амплифицированный продукт присоединяют к колонке со стрептавидином и промывают NaOH для удаления небиотинилированной цепи. Аллель-специфический олигонуклеотид затем добавляют в присутствии молекулы , который флуоресцирует при связывании с двухцепочечной ДНК. Затем интенсивность измеряется по мере увеличения температуры до тех пор, пока не может быть определена температура плавления (Tm) . SNP приведет к более низкой, чем ожидалось, Tm.

Поскольку генотипирование DASH измеряет количественно измеримое изменение Tm, оно способно измерять все типы мутаций, а не только SNP. Другие преимущества DASH включают возможность работы с датчиками без этикеток, а также простую конструкцию и рабочие условия.

Молекулярные маяки

Для обнаружения SNP с помощью молекулярных маяков используется специально созданный одноцепочечный олигонуклеотидный зонд. Олигонуклеотид сконструирован таким образом, что есть комплементарные области на каждом конце и последовательность зонда, расположенная между ними. Такая конструкция позволяет зонду принимать структуру шпильки или стержня-петли в естественном изолированном состоянии. К одному концу зонда прикреплен флуорофор, а к другому - гаситель флуоресценции. Из-за структуры зонда «стержень-петля» флуорофор находится в непосредственной близости от гасителя, что предотвращает излучение флуоресценции молекулой. Молекула также сконструирована таким образом, что только последовательность зонда комплементарна геномной ДНК, которая будет использоваться в анализе (Abravaya et al. 2003).

Если последовательность зонда молекулярного маяка встречает свою геномную ДНК-мишень во время анализа, она отжигается и гибридизируется. Из-за длины последовательности зонда шпилька зонда будет денатурирована в пользу образования более длинного и более стабильного гибрида зонд-мишень. Это конформационное изменение позволяет флуорофору и тушителю быть свободными от их тесной близости из-за ассоциации шпильки, позволяя молекуле флуоресцировать.

Если, с другой стороны, последовательность зонда встречает целевую последовательность всего с одним некомплементарным нуклеотидом, молекулярный маяк будет предпочтительно оставаться в своем естественном состоянии шпильки, и флуоресценция не будет наблюдаться, поскольку флуорофор остается погашенным.

Уникальный дизайн этих молекулярных маяков позволяет с помощью простого диагностического анализа идентифицировать SNP в заданном месте. Если молекулярный маяк предназначен для сопоставления аллеля дикого типа, а другой - для сопоставления мутантного аллеля, эти два могут использоваться для идентификации генотипа человека. Если во время анализа определяется только длина волны флуорофора первого зонда, то индивид гомозиготен к дикому типу. Если определяется только длина волны второго зонда, то человек гомозиготен по мутантному аллелю. Наконец, если обе длины волны обнаружены, то оба молекулярных маяка должны гибридизоваться со своими комплементами, и, следовательно, индивидуум должен содержать оба аллеля и быть гетерозиготным.

Микроматрицы SNP

В массивах SNP олигонуклеотидов высокой плотности сотни тысяч зондов размещаются на небольшом чипе, что позволяет одновременно опрашивать множество SNP. Поскольку аллели SNP отличаются только одним нуклеотидом и поскольку трудно достичь оптимальных условий гибридизации для всех зондов в массиве, целевая ДНК может гибридизоваться с несовпадающими зондами. В некоторой степени это решается путем использования нескольких избыточных зондов для опроса каждого SNP. Зонды предназначены для того, чтобы иметь сайт SNP в нескольких разных местах, а также содержать несоответствия аллелю SNP. Сравнивая разную степень гибридизации целевой ДНК с каждым из этих избыточных зондов, можно определить конкретные гомозиготные и гетерозиготные аллели. Хотя микроматрицы олигонуклеотидов имеют сравнительно более низкую специфичность и чувствительность, масштаб SNP, которые можно исследовать, является большим преимуществом. В Affymetrix человеческого SNP 5.0 GeneChip выполны ют геный анализ , который может генотип более 500000 SNPs человека (Affymetrix 2007) ..

Ферментные методы

Широкий спектр ферментов, включая ДНК-лигазу , ДНК-полимеразу и нуклеазы , был использован для создания методов высокоточного генотипирования SNP.

Полиморфизма длин рестрикционных фрагментов

Полиморфизм длины рестрикционного фрагмента (RFLP) считается самым простым и самым ранним методом обнаружения SNP. SNP-RFLP использует множество различных эндонуклеаз рестрикции и их высокое сродство к уникальным и специфическим сайтам рестрикции. Выполняя расщепление геномного образца и определяя длину фрагментов с помощью гель-анализа, можно установить, разрезают ли ферменты ожидаемые сайты рестрикции. Неспособность разрезать геномный образец приводит к получению идентифицируемого более крупного, чем ожидалось, фрагмента, что означает наличие мутации в точке сайта рестрикции, обеспечивающей защиту от нуклеазной активности.

К сожалению, сочетание факторов высокой сложности большинства эукариотических геномов, потребности в определенных эндонуклеазах, того факта, что точная мутация не может быть обязательно разрешена в одном эксперименте, и медленный характер гель-анализов делают ПДРФ плохим выбором для высокой производительности. анализ.

Методы на основе ПЦР

Система ПЦР с устойчивой к амплификации мутацией тетра-праймеров, или ARMS-PCR, использует две пары праймеров для амплификации двух аллелей в одной реакции ПЦР. Праймеры сконструированы таким образом, что две пары праймеров перекрываются в месте расположения SNP, но каждая идеально соответствует только одному из возможных SNP. Основа изобретения заключается в том, что неожиданно олигонуклеотиды с несовпадающим 3'-остатком не будут функционировать в качестве праймеров в ПЦР в соответствующих условиях. В результате, если данный аллель присутствует в реакции ПЦР, пара праймеров, специфичная для этого аллеля, будет производить продукт, но не для альтернативного аллеля с другим SNP. Две пары праймеров также сконструированы таким образом, что их продукты ПЦР имеют существенно разную длину, что позволяет легко различать полосы с помощью гель-электрофореза или анализа температуры плавления. При исследовании результатов, если геномный образец является гомозиготным, то продукты ПЦР, которые будут получены в результате, будут от праймера, который соответствует положению SNP, и внешнего праймера противоположной цепи, а также от двух внешних праймеров. Если геномный образец является гетерозиготным, то продукты будут происходить из праймера каждого аллеля и их соответствующих аналогов внешних праймеров, а также внешних праймеров.

Альтернативная стратегия заключается в проведении нескольких реакций кПЦР с разными наборами праймеров, нацеленных на каждый аллель отдельно. Хорошо сконструированные праймеры будут амплифицировать их целевой SNP на гораздо более раннем цикле, чем другие SNP. Это позволяет различать более двух аллелей, хотя для каждого SNP требуется индивидуальная реакция qPCR. Для достижения достаточно высокой специфичности последовательность праймера может потребовать размещения искусственного несоответствия рядом с его 3'-концом, что является подходом, широко известным как Taq-MAMA.

Эндонуклеаза лоскута

Эндонуклеаза лоскута (FEN) - это эндонуклеаза, которая катализирует структурно-специфическое расщепление. Это расщепление очень чувствительно к несовпадениям и может использоваться для опроса SNP с высокой степенью специфичности.

В базовом анализе Invader FEN, называемая расщеплением, объединяется с двумя специфическими олигонуклеотидными зондами, которые вместе с целевой ДНК могут образовывать трехчастную структуру, распознаваемую расщеплением. Первый зонд, называемый олигонуклеотидом Invader, комплементарен 3'-концу целевой ДНК. Последнее основание олигонуклеотида- захватчика является несовпадающим основанием, которое перекрывает нуклеотид SNP в целевой ДНК. Второй зонд представляет собой аллель-специфичный зонд, который комплементарен 5'-концу целевой ДНК, но также простирается за 3'-сторону нуклеотида SNP. Аллель-специфический зонд будет содержать основание, комплементарное нуклеотиду SNP. Если целевая ДНК содержит желаемый аллель, зонды Invader и аллель-специфичные пробы будут связываться с целевой ДНК, образуя трехчастную структуру. Эта структура распознается расщеплением, которое расщепляет и высвобождает 3'-конец аллель-специфичного зонда. Если нуклеотид SNP в целевой ДНК не комплементарен аллель-специфичному зонду, правильная трехчастная структура не образуется и расщепление не происходит. Анализ Invader обычно сочетается с системой резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET) для обнаружения события расщепления. В этой установке молекула гасителя присоединяется к 3 'концу, а флуорофор присоединяется к 5' концу аллель-специфического зонда. Если происходит расщепление, флуорофор отделяется от молекулы гасителя, генерируя обнаруживаемый сигнал.

Только минимальное расщепление происходит с несовпадающими зондами, что делает анализ Invader очень специфичным. Однако в исходном формате можно было опросить только один аллель SNP на образец реакции, и для генерации детектируемого сигнала в разумные сроки требовалось большое количество целевой ДНК. Несколько разработок расширили исходный анализ Invader . Посредством проведения вторичных реакций расщепления FEN реакция последовательного инвазивного усиления сигнала (SISAR) позволяет опрашивать оба аллеля SNP в одной реакции. Анализ SISAR Invader также требует меньше целевой ДНК, что повышает чувствительность исходного анализа Invader . Анализ также был адаптирован несколькими способами для использования в формате с высокой пропускной способностью. В одной платформе аллель-специфические зонды прикреплены к микросферам. Когда расщепление FEN генерирует детектируемый флуоресцентный сигнал, сигнал измеряется с помощью проточной цитометрии. Чувствительность проточной цитометрии устраняет необходимость в ПЦР-амплификации целевой ДНК (Rao et al. 2003). Эти высокопроизводительные платформы не продвинулись дальше стадии подтверждения принципа, и до сих пор система Invader не использовалась ни в каких крупномасштабных проектах генотипирования SNP.

Удлинение грунтовки

Удлинение праймера - это двухэтапный процесс, который сначала включает гибридизацию зонда с основаниями непосредственно перед нуклеотидом SNP с последующей реакцией «мини-секвенирования», в которой ДНК-полимераза удлиняет гибридизованный праймер, добавляя основание, которое комплементарно нуклеотид SNP. Это встроенное основание обнаруживается и определяет аллель SNP (Goelet et al. 1999; Syvanen 2001). Поскольку удлинение праймера основано на использовании высокоточного фермента ДНК-полимеразы, этот метод в целом очень надежен. Удлинение праймера способно генотипировать большинство SNP в очень похожих условиях реакции, что делает его также очень гибким. Метод удлинения праймера используется в нескольких форматах анализа. В этих форматах используется широкий спектр методов обнаружения, включая масс-спектрометрию MALDI-TOF (см. Sequenom ) и методы, подобные ELISA .

Как правило, существует два основных подхода, в которых используется включение либо флуоресцентно меченных дидезоксинуклеотидов (ddNTP), либо флуоресцентно меченных дезоксинуклеотидов (dNTP). С ddNTP зонды гибридизуются с ДНК-мишенью непосредственно перед нуклеотидом SNP, и один ddNTP, комплементарный аллелю SNP, добавляется к 3 'концу зонда (отсутствующий 3'-гидроксил в дидиоксинуклеотиде предотвращает добавление дополнительных нуклеотидов ). Каждый ddNTP помечен разными флуоресцентными сигналами, что позволяет обнаруживать все четыре аллеля в одной реакции. В случае dNTP аллель-специфические зонды имеют 3 'основания, комплементарные каждому из опрашиваемых аллелей SNP. Если целевая ДНК содержит аллель, комплементарный 3 'основанию зонда, целевая ДНК будет полностью гибридизоваться с зондом, позволяя ДНК-полимеразе распространяться от 3' конца зонда. Это обнаруживается по включению флуоресцентно меченных дНТФ на конец зонда. Если целевая ДНК не содержит аллеля, комплементарного 3'-основанию зонда, целевая ДНК будет давать несоответствие на 3'-конце зонда, и ДНК-полимераза не сможет распространяться от 3'-конца зонда. Преимущество второго подхода состоит в том, что несколько меченых дНТФ могут включаться в растущую цепь, обеспечивая усиление сигнала. Однако в некоторых редких случаях ДНК-полимераза может происходить от несовпадающих 3 'зондов, давая ложноположительный результат.

Другой подход используется Sequenom ' Iplex SNP генотипирования методом с, который использует масс - спектрометр MassARRAY. Зонды расширения разработаны таким образом, что 40 различных анализов SNP могут быть амплифицированы и проанализированы в коктейле ПЦР. В реакции удлинения используются ddNTP, как указано выше, но обнаружение аллеля SNP зависит от фактической массы продукта удлинения, а не от флуоресцентной молекулы. Этот метод предназначен для низкой или средней производительности и не предназначен для сканирования всего генома.

Гибкость и специфичность удлинения праймера делают его пригодным для высокопроизводительного анализа. Зонды удлинения праймеров могут быть размещены на предметных стеклах, что позволяет генотипировать сразу несколько SNP. Эта технология, широко известная как матричное удлинение праймеров (APEX), имеет несколько преимуществ по сравнению с методами, основанными на дифференциальной гибридизации зондов. Для сравнения, методы APEX обладают большей различающей способностью, чем методы, использующие эту дифференциальную гибридизацию, поскольку часто невозможно получить оптимальные условия гибридизации для тысяч зондов на ДНК-микрочипах (обычно это решается за счет наличия зондов с высокой избыточностью). Однако такая же плотность зондов не может быть достигнута в методах APEX, что приводит к снижению производительности за цикл.

Анализ Infinium компании Illumina Incorporated является примером конвейера полногеномного генотипирования, основанного на методе удлинения праймера. В анализе Infinium можно генотипировать более 100 000 SNP. В этом анализе используются нуклеотиды, меченные гаптеном, в реакции удлинения праймера. Метка гаптена распознается антителами, которые, в свою очередь, связаны с обнаруживаемым сигналом (Gunderson et al. 2006).

APEX-2 - это метод генотипирования с использованием матричного удлинения праймеров, который позволяет идентифицировать сотни SNP или мутаций параллельно с использованием эффективной гомогенной мультиплексной ПЦР (до 640 сплетений) и четырехцветного одноосновного удлинения на микрочипе. Мультиплексная ПЦР требует двух олигонуклеотидов на каждый SNP / мутацию, генерирующую ампликоны, содержащие тестируемую пару оснований. Те же олигонуклеотиды используются на следующем этапе в качестве иммобилизованных одноосновных праймеров для удлинения на микроматрице (Krjutskov et al. 2008).

5'-нуклеаза

5'-нуклеазная активность ДНК-полимеразы Taq используется в анализе TaqMan для генотипирования SNP. Анализ TaqMan проводится одновременно с реакцией ПЦР, и результаты можно считывать в режиме реального времени по мере протекания реакции ПЦР (McGuigan & Ralston 2002). Для анализа требуются прямые и обратные праймеры ПЦР, которые будут амплифицировать область, включающую полиморфный сайт SNP. Дискриминация аллелей достигается с помощью FRET в сочетании с одним или двумя аллель-специфическими зондами, которые гибридизуются с полиморфным сайтом SNP. Зонды будут иметь флуорофор, связанный с их 5 'концом, и молекулу гасителя, связанную с их 3' концом. Пока зонд не поврежден, гаситель будет оставаться в непосредственной близости от флуорофора, устраняя сигнал флуорофора. На этапе амплификации ПЦР, если аллель-специфический зонд полностью комплементарен аллелю SNP, он будет связываться с цепью ДНК-мишени и затем разрушаться 5'-нуклеазной активностью полимеразы Taq, поскольку она расширяет ДНК из ПЦР. грунтовки. Разложение зонда приводит к отделению флуорофора от молекулы гасителя, генерируя обнаруживаемый сигнал. Если аллель-специфический зонд не является полностью комплементарным, он будет иметь более низкую температуру плавления и связываться не так эффективно. Это предотвращает действие нуклеазы на зонд (McGuigan & Ralston 2002).

Поскольку анализ TaqMan основан на ПЦР, его относительно просто реализовать. Анализ TaqMan можно объединить, объединив обнаружение до семи SNP в одной реакции. Однако, поскольку каждый SNP требует отдельного зонда, анализ TaqMan ограничен тем, насколько близко могут быть расположены SNP. Масштаб анализа можно резко увеличить, выполняя множество одновременных реакций в микротитровальных планшетах. Как правило, TaqMan ограничен приложениями, которые включают опрос небольшого количества SNP, поскольку для каждого SNP должны быть разработаны оптимальные зонды и условия реакции (Syvanen 2001).

Анализ лигирования олигонуклеотидов

ДНК-лигаза катализирует лигирование 3'-конца фрагмента ДНК с 5'-концом непосредственно прилегающего фрагмента ДНК. Этот механизм можно использовать для опроса SNP путем гибридизации двух зондов непосредственно над полиморфным сайтом SNP, в результате чего может происходить лигирование, если зонды идентичны целевой ДНК. В анализе олигонуклеотид-лигазы сконструированы два зонда; аллель-специфический зонд, который гибридизуется с целевой ДНК, так что его 3'-основание расположено непосредственно над нуклеотидом SNP, и второй зонд, который гибридизирует матрицу выше (ниже в комплементарной цепи) полиморфного сайта SNP, обеспечивая 5'-конец для реакции лигирования. Если аллель-специфический зонд совпадает с целевой ДНК, он полностью гибридизуется с целевой ДНК, и может произойти лигирование. Лигирование обычно не происходит в присутствии несоответствующего 3'-основания. Лигированные или нелигированные продукты могут быть обнаружены гель-электрофорезом, масс-спектрометрией MALDI-TOF или капиллярным электрофорезом для крупномасштабных приложений. С соответствующими последовательностями и тегами на олигонуклеотидах можно получить высокопроизводительные данные о последовательностях из лигированных продуктов и определенных генотипов (Curry et al., 2012). Использование большого количества индексов выборки позволяет сгенерировать данные последовательности с высокой пропускной способностью для сотен SNP в тысячах выборок за небольшую часть цикла высокопроизводительного секвенирования. Это массовое генотипирование с помощью технологии секвенирования (MGST).

Другие методы постамплификации, основанные на физических свойствах ДНК

Характерные свойства ДНК температуры плавления и однонитевой конформации использовались в нескольких приложениях для различения аллелей SNP. Эти методы очень часто достигают высокой специфичности, но требуют высоко оптимизированных условий для получения наилучших возможных результатов.

Однонитевой конформационный полиморфизм

Одноцепочечная ДНК (оцДНК) складывается в третичную структуру. Конформация зависит от последовательности, и большинство мутаций одной пары оснований изменяют форму структуры. При нанесении на гель третичная форма будет определять подвижность оцДНК, обеспечивая механизм различения аллелей SNP. Этот метод сначала включает ПЦР-амплификацию целевой ДНК. Двухцепочечные продукты ПЦР денатурируют с использованием тепла и формальдегида для получения оцДНК. ОцДНК наносят на неденатурирующий гель для электрофореза и дают возможность свернуться в третичную структуру. Различия в последовательности ДНК изменяют третичную конформацию и обнаруживаются как разница в подвижности цепи оцДНК (Costabile et al. 2006). Этот метод широко используется, поскольку он технически прост, относительно недорог и требует использования общедоступного оборудования. Однако по сравнению с другими методами генотипирования SNP чувствительность этого анализа ниже. Было обнаружено, что конформация оцДНК сильно зависит от температуры, и, как правило, не очевидно, какова идеальная температура. Очень часто анализ будет проводиться с использованием нескольких различных температур. Также существует ограничение на длину фрагмента, потому что чувствительность падает, когда используются последовательности длиннее 400 п.н. (Costabile et al. 2006).

Гель-электрофорез в градиенте температуры

Метод гель-электрофореза в градиенте температуры (TGGE) или капиллярного электрофореза в градиенте температуры (TGCE) основан на том принципе, что частично денатурированная ДНК более ограничена и медленнее перемещается в пористом материале, таком как гель. Это свойство позволяет разделять ДНК по температуре плавления. Чтобы адаптировать эти методы для обнаружения SNP, используются два фрагмента; целевая ДНК, которая содержит исследуемый полиморфный сайт SNP и аллель-специфичную последовательность ДНК, называемую нормальным фрагментом ДНК. Нормальный фрагмент идентичен целевой ДНК, за исключением потенциально полиморфного сайта SNP, который неизвестен в целевой ДНК. Фрагменты денатурируют, а затем повторно отжигают. Если целевая ДНК имеет тот же аллель, что и нормальный фрагмент, образуются гомодуплексы, которые будут иметь такую ​​же температуру плавления. При работе на геле с градиентом температуры появится только одна полоса. Если целевая ДНК имеет отдельный аллель, после стадии повторного отжига образуются четыре продукта; гомодуплексы, состоящие из целевой ДНК, гомодуплексы, состоящие из нормальной ДНК, и два гетеродуплекса каждой цепи целевой ДНК, гибридизованные с нормальной цепью ДНК. Эти четыре продукта будут иметь разные температуры плавления и появятся в денатурирующем геле в виде четырех полос.

Денатурирующая высокоэффективная жидкостная хроматография

В денатурирующей высокоэффективной жидкостной хроматографии (DHPLC) используется обращенно-фазовая HPLC для исследования SNP. Ключ к DHPLC - это твердая фаза, которая имеет дифференциальное сродство к одноцепочечной и двухцепочечной ДНК. В DHPLC фрагменты ДНК денатурируют нагреванием, а затем дают возможность повторно отожиться. Температура плавления повторно отожженных фрагментов ДНК определяет продолжительность времени, в течение которого они остаются в колонке. Используя ПЦР, генерируют два фрагмента; ДНК-мишень, содержащая полиморфный сайт SNP и аллель-специфичную последовательность ДНК, называемую нормальным фрагментом ДНК. Этот нормальный фрагмент идентичен целевой ДНК, за исключением потенциально полиморфного сайта SNP, который неизвестен в целевой ДНК. Фрагменты денатурируют, а затем дают возможность постепенно реанимировать. Реантированные продукты добавляют в колонку DHPLC. Если аллель SNP в целевой ДНК совпадает с нормальным фрагментом ДНК, только идентичные гомодуплексы будут формироваться во время стадии повторного отжига. Если целевая ДНК содержит аллель SNP, отличный от нормального фрагмента ДНК, гетеродуплексы целевой ДНК и нормальной ДНК, содержащие несовпадающий полиморфный сайт, будут образовываться в дополнение к гомодуплексам. Несоответствующие гетеродуплексы будут иметь другую температуру плавления, чем гомодуплексы, и не будут удерживаться в колонке так долго. Это генерирует хроматографический образец, который отличается от образца, который был бы сгенерирован, если бы целевой фрагмент ДНК и нормальные фрагменты ДНК были идентичны. Элюированную ДНК обнаруживают по УФ-поглощению.

DHPLC легко автоматизировать, так как не требуется мечение или очистка фрагментов ДНК. Этот метод также относительно быстр и отличается высокой специфичностью. Одним из основных недостатков DHPLC является то, что температура колонки должна быть оптимизирована для каждой мишени, чтобы достичь нужной степени денатурации.

Плавление всего ампликона с высоким разрешением

Анализ плавления с высоким разрешением - это самый простой для понимания метод, основанный на ПЦР. По сути, здесь и в реальном времени применяются те же термодинамические свойства, которые позволили гелевым методам работать. Флуориметр отслеживает денатурацию всего ампликона дцДНК после ПЦР. Вы делаете праймеры, специфичные для сайта, который хотите амплифицировать. Вы «окрашиваете» ампликон двухцепочечным специфическим красителем, включенным в смесь для ПЦР. Краситель, специфичный для ds, интегрируется в продукт ПЦР. По сути, весь ампликон становится зондом. Это открывает новые возможности для открытий. Либо вы размещаете праймеры очень близко по обе стороны от рассматриваемого SNP (генотипирование малых ампликонов, Liew, 2004), либо амплифицируете более крупную область (длиной 100-400 п.н.) для целей сканирования. Для простого генотипирования SNP проще сделать ампликон маленьким, чтобы свести к минимуму вероятность того, что вы перепутаете один SNP с другим. Определяют температуру плавления (Tm) всего ампликона, и большинство гомозигот достаточно отличаются (в лучших инструментах) по Tm от генотипа. Гетерозиготы еще легче дифференцировать, потому что они генерируют гетеродуплексы (см. Объяснения на основе геля), которые расширяют переход расплава и обычно дают два различимых пика. Было описано плавление ампликона с использованием флуоресцентно меченого праймера (Gundry et al., 2003), но оно менее практично, чем использование ds-специфичных красителей из-за стоимости флуорогенного праймера.

Сканирование больших ампликонов основано на тех же принципах, что описаны выше. Однако информативными становятся температура плавления и общая форма кривой плавления. Для ампликонов размером> 150 п.н. часто имеется> 2 пика плавления, каждый из которых может варьироваться в зависимости от состава матрицы ДНК. Многочисленные исследователи смогли успешно устранить большую часть своего секвенирования с помощью сканирования на основе расплава, что позволило точно определить генотипирование на основе локусов большого числа людей. Многие исследователи обнаружили, что сканирование мутаций с использованием плавления с высоким разрешением является жизнеспособным и практичным способом изучения целых генов.

Использование белков, связывающих несовпадение ДНК

Белки, связывающие несовпадения ДНК, могут различать единичные несоответствия нуклеотидов и, таким образом, облегчать дифференциальный анализ SNP. Например, белок MutS из Thermus aquaticus связывает разные однонуклеотидные несовпадения с разным сродством и может использоваться в капиллярном электрофорезе для дифференциации всех шести наборов несовпадений (Drabovich & Krylov 2006).

SNPlex

SNPlex - это запатентованная платформа для генотипирования, продаваемая Applied Biosystems .

Сюрвейерский анализ нуклеазы

Нуклеаза Surveyor представляет собой фермент эндонуклеазы несовпадения, который распознает все замены оснований и небольшие вставки / делеции (инделки) и расщепляет 3'-сторону несовпадающих сайтов в обеих цепях ДНК.

Последовательность действий

Технологии секвенирования следующего поколения, такие как пиросеквенирование последовательности менее 250 оснований в считывании, что ограничивает их способность секвенировать целые геномы. Тем не менее, их способность генерировать результаты в режиме реального времени и их потенциал для массового масштабирования делает их жизнеспособным вариантом для секвенирования небольших областей для выполнения генотипирования SNP. По сравнению с другими методами генотипирования SNP, секвенирование, в частности, подходит для идентификации нескольких SNP в небольшой области, такой как высокополиморфная область генома главного комплекса гистосовместимости .

Ссылки

дальнейшее чтение

внешние ссылки

Методы выделения ДНК и РНК из биологического материала

Методы выделения ДНК из биологического материала

Выделение ДНК и РНК — важный шаг подготовки проб перед биохимическими и диагностическими процессами. Амплификация, проведение обратной транскрипции, детектирование накопления продуктов амплификации методом ПЦР в реальном времени, клонирование, секвенс, гибридизация, синтез ДНК и т. д., не могут быть выполнены непосредственно на биологических образцах без предварительного выделения (экстракции) нуклеиновых кислот (НК) и их последующей очистки.

Почему так важно получить высококачественную ДНК?

Так как в ветеринарной клинической практике наиболее используемым методом является ПЦР в реальном времени (или, в некоторых случаях, классическая ПЦР), рассмотрим методы выделения НК и их особенности будут рассмотрены именно с точки зрения данного вида анализа.

Механизм ПЦР.

Как известно, ПЦР (полимеразная цепная реакция) представляет собой реакцию синтеза комплементарной цепочки ДНК на ДНК матрице, катализируемую ферментом ДНК-зависимой ДНК-полимеразой. Фермент термостабильный – он может выдерживать высокие температуры, необходимые на этапе денатурации. Оптимум работы полимеразы составляет около 72°C. Для создания оптимальных условий синтеза образец ДНК помещается в так называемую реакционную смесь (РС).

Реакционная смесь состоит:

1. Буфер для ПЦР. Это буферный раствор с определенным значением pH и концентрацией различных солей и кофакторов, необходимых для работы полимеразы. В наше время компании-производители реактивов для ПЦР предлагают к своим полимеразам фирменные буферы.
2. ДНК-зависимая ДНК-полимераза. Катализатор реакции, чаще всего выделяется из термофильной бактерии Thermus aquaticus (Taq-полимераза).
3. Нуклеотидтрифосфаты (dNTPs). Раствор мононуклеотидтрифосфатов (dATP, dCTP, dTTP, dGTP) в свободном виде, которые служат «строительным материалом» для синтеза ампликонов.
4. Праймеры. Короткие синтезированные последовательности ДНК (олигонуклеотиды), фланкирующие исследуемые участки ДНК – от них полимераза начинает свою работу.
5. MQ вода. Дистиллированная и деионизированная вода, пригодная для молекулярно-генетических исследований. Используется для доведения реакционной смеси до рабочей концентрации.
6. ДНК. Собственно, сам образец ДНК, который необходимо исследовать.

При должном качестве всех компонентов реакционной смеси реакция может ингибироваться только из-за плохой очистки ДНК. Ингибиторы ПЦР представляют собой вещества, способные повлиять на конформацию фермента и уменьшить его активность, вплоть до полной деактивации. Эти примеси могут оказаться в растворе ДНК по двум причинам:

1.  Плохая очистка образца от остатков веществ, которые содержались в материале, из которого производилось выделение. Ингибировать ПЦР могут остатки жиров, белков, углеводов, пигментов (для растительных клеток – хлорофиллы, каратиноиды, антоцианы, для животных – гемоглобин и др.). Сюда же относятся и вещества, которые были использованы в качестве транспортной или консервационной среды для образца (ЭДТА, гепарин, формальдегид).
2. Плохая очистка образца от реагентов, которые были использованы в процессе выделения. Сильно ингибируют ПЦР детергенты (ПАВ) и денатуранты, такие как SDS (додецилсульфат натрия) и мочевина; спирты и другие неполярные растворители, которые содержатся в экстрагентах и отмывочных буферах (этанол, изопропанол, фенол и др.).

Список некоторых веществ, которые могут негативно повлиять на эффективность ПЦР, показан в таблице 1.

Таблица 1. Некоторые ингибиторы процесса ПЦР

Из этого можно сделать вывод, что ключевыми факторами успешного выделения НК является грамотная подготовка материала, правильный выбор метода экстракции и точное соблюдение требований протокола выделения.

Какие требования предъявляются к материалу для выделения нуклеиновых кислот?

Прежде всего, биологические образцы должны быть взяты в достаточном количестве для проведения анализа, кроме того, образца должно хватить для проведения повторного анализа. При этом необходимо учитывать вариации содержания НК в различных органах и тканях, а также уменьшение содержания НК из-за деградации, если образец был взят через большой промежуток времени после смерти животного.

Экстракцию нуклеиновых кислот следует начинать как можно скорее после отбора свежих тканей. Ткань может храниться в условиях низкой температуры в холодильнике в течение нескольких дней без риска деградации НК. Однако, если выделение невозможно в ближайшее время, образец должен быть заморожен до температуры от -20°C до -80°C. При этом целесообразно использовать для хранения и перевозки образцов одноразовую пластиковую пробирку или другие плотно закрывающиеся емкости.

После экстракции целесообразно проверить качество выделенной НК, например, измерить концентрацию с помощью флюориметра/спектрофотометра, провести гель-электрофорез или ПЦР со специальными праймерами – факторами элонгации.

Обзор методов выделения НК

Выделение нуклеиновых кислот – один из базовых методов молекулярной биологии. В прошлом процесс выделения и очистки НК был сложным, времязатратным, трудоемким и имел ограничения с точки зрения скорости обработки образцов. На сегодняшний день имеется множество специализированных методик, которые могут использоваться для выделения нуклеиновых кислот с высокой степенью очистки. Их можно условно разделить на две группы: осаждение НК на суспензионный носитель и выделение на колонках. Безусловно, традиционные методы выделения являются надежными и прошли испытание временем, но сейчас на рынке имеется широкий ассортимент товаров, включая полные наборы, содержащие большинство реагентов, необходимых для выделения нуклеиновых кислот. Однако, большинство из них все же требует многократных этапов центрифугирования, которые сопровождаются удалением супернатанта (прим. фаза дисперсионной системы, которая располагается сверху от границы раздела фаз).
В последний годы повысился спрос на автоматические системы. Разработанные для средних и крупных лабораторий, они являются альтернативой трудоемкому ручному методу. Данная технология значительно повышает производительность лаборатории. При этом выход НК и чистота материала, воспроизводимость и прогностичность эксперимента будут максимальными (так же как скорость, точность и надежность анализа в целом), а риск кросс-контаминации (перекрестного заражения) минимизируется.

Фенол-хлороформная экстракция (Guanidinium Thiocyanate-Phenol-Chloroform Extraction).

Обычно протокол выделения нуклеиновых кислот включает следующие этапы: 1.) клеточный лизис, в результате которого разрушаются клеточные структуры и образуется лизат, 2.) инактивацию нуклеаз клетки, таких как ДНКаза и РНКаза, 3.) выделение искомой нуклеиновой кислоты из клеточного дербиса. Экстракция с помощью смеси фенол-хлороформ – один из наиболее старых, но, тем не менее, широко используемых методов выделения нуклеиновых кислот.
Несмотря на то, что фенол – легковоспламеняющееся, коррозионное и токсичное для человека вещество, он способен очень активно денатурировать белки, но не полностью инактивирует РНКазы. Эту проблему можно решить, используя смесь фенол : хлороформ : изоамиловый спирт (в пропорции 25:24:1).
При смешивании фенола и хлороформа образуется двухфазная эмульсия. После центрифугирования гидрофобный слой эмульсии, в котором собираются белки, липиды и углеводы, оседает на дно, а гидрофильный остается сверху. Отбирается верхняя фаза, содержащая ДНК, после чего ДНК осаждают из супернатанта путем добавления этанола или изопропанола в соотношении 2:1 или 1:1 на фоне высокой концентрации солей в лизате. Соли – обычные примеси в образцах нуклеиновых кислот, поэтому их всегда необходимо удалять из образца перед любыми последующими процессами и планируемыми анализами. Следовательно, для обессоливания образца, содержащего нуклеиновую кислоту, требуется одна или несколько стадий отмывки.
Осажденную ДНК выделяют путем повторного центрифугирования, причем избыток солей вымывается с помощью 70%-го этилового спирта, а центрифугирование необходимо для удаления супернатанта – этанола. Затем осажденную ДНК растворяют с помощью ТЕ-буфера или MQ-воды.

FTA-карты.

В данной методике нуклеиновые кислоты выделяются прямо на специальной бумаге, пропитанной смесью реагентов, связывающих ДНК. Для выделения достаточно нанести каплю образца на карту, после чего нанести на нее буфер для выделения и высушить. В дальнейшем, карту можно разрезать на фрагменты и загружать прямо в пробирку для ПЦР. Данный метод подходит только для жидких образцов и не пригоден для ПЦР в реальном времени, однако по времени анализа ему нет равных.

С помощью коммерческих наборов (KITs)

Для выделения НК возможно подготовить высококачественные образцы для анализа прямо «из коробки». По сравнению с традиционными методами они обеспечивают более быстрое и менее трудоемкое выделение. Многие затруднения, свойственные фенол-хлороформной экстракции, например, неполное разделение фаз, в данном случае исключены. В процессе выделения твердая фаза системы (сорбент) адсорбирует на себя нуклеиновые кислоты в зависимости от pH и ионной силы буфера. Процесс адсорбции основывается на следующих принципах: образование водородных связей с гидрофильной матрицей в хаотропных условиях, с последующим ионным обменом в жидкой среде с помощью анионообменника посредством отбора молекул по их афинности и размеру. В большинстве случаев твердофазная экстракция осуществляется с использованием колонки для очистки ДНК (spin column), через которую проходит лизат под воздействием центробежной силы. По сравнению с традиционными способами очистки данный метод имеет преимущество в скорости работы. В качестве носителя используются силикатные носители (силика), стеклянные частицы, диатомит и анионообменные носители.

Протокол твердофазной экстракции включает четыре ключевых шага: клеточный лизис; адсорбцию нуклеиновых кислот, отмывку и десорбцию (элюцию). Исходным этапом является установка колонки для адсорбции образца. Подготовка колонки производится с использованием буфера с определенным pH – для того, чтобы придать поверхностным структурам (или функциональным группам) сорбента необходимые свойства – только в таком случае ДНК или РНК будут «налипать» на носитель. Следующий шаг – образец, расщепленный с помощью лизирующего буфера, помещают на колонку. Искомая нуклеиновая кислота адсорбируется на колонке за счет высокого pH и концентрации солей в связывающем растворе (binding solution). Прочие составляющие, такие как белки, также могут образовывать прочные специфические соединения с поверхностью колонки. Эти нежелательные примеси можно удалить на стадии промывания, используя промывочный буфер (wash buffer), который содержит вещества, не дающие им адсорбироваться. Для того, чтобы высвободить нуклеиновую кислоту с колонки на стадии десорбции, используется ТЕ-буфер или MQ-вода.
Так называемые селективные носители (mixed-bed solid phases) представляют собой смесь по крайней мере двух различных сорбентов, которые могут быть твердыми или полутвердыми, пористыми или непористыми. Каждый из них способен связываться с целевой нуклеиновой кислотой при определенных условиях.

Силикатные носители (Силика, Silica Matrices).

Основой для большинства наборов для выделения и очистки нуклеиновых кислот, являются уникальные свойства силиконовых носителей для селективного связывания НК. К таким относятся стеклянные шарики и микроволокна, силикатные частицы, а также диатомовая земля (диатомит).
Сюда же можно отнести носители из гидроокиси кремния (hydrated silica matrix), которые изготовливают путем нагревания смеси из диоксида кремния и гидроксида натрия (либо гидроксида калия) в молярном соотношении от 2:1 до 10:1 в течение 48 часов. ДНК связывается с неорганическим носителем и высвобождается при элюции. Принцип очистки нуклеиновых кислот с помощью силикатных носителей базируется на высокой афинности отрицательно заряженного остова ДНК к положительно заряженным силикатным частицам. Натрий играет роль катионного мостика, который притягивает отрицательно заряженный кислород в фосфатном «скелете» нуклеиновой кислоты. В условиях высокой ионной силы (pH ≤ 7) катионы натрия разрушают водородные связи между водородом воды и отрицательно заряженными ионами кислорода в силикатном материале. В этих условиях ДНК тесно связывается с носителем, а интенсивное промывание позволяет удалить все нежелательные примеси. Очищенные молекулы ДНК могут быть десорбированы позже, уже при низкой ионной силе раствора (pH ≥ 7), с использованием ТЕ-буфера или MQ-воды.
Кроме силикатных носителей, связывать нуклеиновые кислоты способны также нитроцеллюлоза и полиамидные мембраны (polyamide membranes) (например, нейлоновые матрицы), однако они имеют меньшую специфичность.
Вышеперечисленные материалы используются в качестве транспортировочных и гибридизационных носителей для твердофазной экстракции НК. Полиамидные носители более долговечны, чем целлюлозные, и способны необратимо связывать нуклеиновые кислоты. Нуклеиновые кислоты могут быть иммобилизованы на полиамидных сорбентах при низкой ионной силе буферного раствора.

Стеклянные носители (Glass Particle).

Для очистки нуклеиновых кислот используются частицы стекла, стеклянный порошок и стеклянные шарики. Адсорбция нуклеиновых кислот на стеклянный субстрат базируется на тех же принципах, что адсорбционная хроматография.
Очистка нуклеиновых кислот также может осуществляться на силикагеле и стеклянной суспензии в присутствии раствора хаотропных солей.

Диатомит.

Диатомовая земля, известная также как кизельгур или диатомит, содержит до 94% кремния. Применяемая для фильтрации и в хроматографии, она подходит и для очистки плазмидной и ядерной ДНК. Впоследствии ДНК, связанная с диатомитом, вымывается с помощью спиртосодержащего буфера. Потом буфер сливается, а ДНК элюируется.

Очистка нуклеиновых кислот с использованием магнитных микроносителей (Magnetic Bead Based Nucleic Acid Purification).

Магнитная сепарация – современный, простой и эффективный способ очистки нуклеиновых кислот. Удобство данного метода заключается в том, что, намагниченные частицы могут быть удалены с помощью постоянного магнита. К стенке пробирки прикладывают магнит, благодаря чему происходит агрегация частиц вблизи него, после чего оставшуюся часть образца выливают. То есть не требуется ни органических растворителей, ни многократного центрифугирования, вакуумной фильтрации или осаждения на колонках. Часто для процесса выделения используют магнитные носители с иммобилизованными аффинными лигандами или носители, полученные из биополимера с аффинностью к целевой нуклеиновой кислоте. К таким относятся магнитные частицы, полученные из различных синтетических полимеров, биополимеров, пористого стекла или на основе неорганических магнитных материалов (например, поверхностно-модифицированный оксид железа).
Для более эффективного связывания нуклеиновых кислот предпочтительно использовать материалы с большой суммарной площадью поверхности. Магнитные материалы в виде шариков (beads) более предпочтительны из-за их большей связывающей способности, так как НК буквально «оборачиваются» вокруг круглых частиц.
Существует метод выделения НК с помощью инкапсулированных в полимер магнитных частиц. Чаще всего для этих целей используют целлюлозу, а в качестве магнитного компонента – оксиды железа или никеля. Особенность данного метода заключается в том, что нуклеиновые кислоты малого размера требуют более высоких концентраций солей для прочного связывания с модифицированными магнитными частицами. Следовательно, концентрацию соли можно избирательно изменять, чтобы высвободить связанную нуклеиновую кислоту нужного размера.

Анионообменные смолы.

Анионообменные смолы – класс носителей, в которых используется принцип анионного обмена. Он основан на взаимодействии между положительно заряженными группами диэтиламиноэтилцеллюлозы (DEAE) на поверхности смолы и отрицательно заряженными фосфатными группами ДНК-скелета. Анионообменная смола состоит из силикатных гранул с большим размером пор и гидрофильного поверхностного слоя. Большая суммарная площадь поверхности смолы обеспечивает плотное соединение DEAE-групп с НК. Смола работает в широком диапазоне рН (рН=6-9) и/или концентрации солей (0,1-1,6 М). Благодаря этому такие примеси, как белок и РНК вымываются из смолы с при использованием буферов со средней ионной силой, в то время как ДНК остается связанной с ней до этапа элюирования буфером с высокой ионной силой.

Подводя итог, можно заключить, что современный рынок материалов для выделения нуклеиновых кислот характеризуется большим разнообразием. Все методики позволяют получать высококачественные образцы, пригодные для клинических исследований, однако следует учитывать условия работы лаборатории (вид анализов, количество образцов, цены на услуги лаборатории и т.д.), и тогда практический и экономический эффект выбранного метода будет максимальным.

Этапы полимеразной цепной реакции. Выделение ДНК. Лаборатория ПЦР-анализа

Анализ ПЦР (полимеразная цепная реакция) – метод диагностики высокой точности, который позволяет выявлять разные виды инфекции. Для этого в лабораторных условиях проводится исследование генетического материала (слюны, мокроты, крови, выделений из половых органов и других биологических материалов).

На первоначальном этапе проведения ПЦР-анализа производится забор материала для исследования. При этом должны быть соблюдены правила: обеспечение полной стерильности, использование исключительно одноразовых материалов.

После забора биоматериал при помощи щеточки помещается в контейнер с физраствором. Лабораторное исследование взятых проб должно быть выполнено как можно быстрее после забора.

ПЦР-анализ ДНК в лаборатории включает три этапа:

• выделение;
• ампликация фрагментов;
• детекция продуктов ампликации.

Когда врач выполнил забор биоматериала у пациента и провел его специальную обработку, двойная спираль ДНК расщепляется на отдельные нити. При добавлении специальной жидкости в биоматериал, растворяются органические вещества, которые мешают «чистоте» реакции. Как следствие, после устранения липидов, аминокислот, пептидов, углеводов, белков, полисахаридов, образуются ДНК либо РНК.

Время, которое требуется на выделение ДНК, зависит от вида возбудителя инфекции, а также биоматериала, который используется для проведения анализа. Так, к примеру, если будет исследоваться кровь, подготовительный этап занимает до двух часов.

Для ампликации ДНК применяются специальные матрицы. Чтобы провести данный этап, вполне достаточно небольшого кусочка ДНК, который характерный только для конкретной инфекции.

Ампликация ДНК – это многократное увеличение количества копий ДНК, которые характерны только для определенного организма. Всю цепь не обязательно достраивать, чтобы увидеть, что является возбудителем инфекции. Требуется только участок, который является характерным для конкретной бактерии.

Чтобы провести ПЦР-диагностику, используется специальное программируемое оборудование, которое автоматически меняет температуру. При проведении амплификации задается программа, которая соответствует определенной инфекции. Занимает данный этап приблизительно 2-3 часа.

Детекция продуктов асплификации подразумевает разделение смеси продуктов амплификации, которая была получена. Для этого добавляются специальные растворы, чтобы фрагменты ДНК отражались светящимися полосами оранжево-красного цвета. Это свечение показывает наличие ДНК вирусов, бактерий и микроорганизмом в биоматериале пациента, точно определяя их конкретный вид.

ДНК - Протоколы изоляции

Этот протокол дает высокоочищенный препарат ДНК из биопсии хвоста мыши.

1. Удалите 0,5 мм хвоста из полипропиленовой микроцентрифужной пробирки (не измельчая). (Пробирки должны иметь плотно закрывающиеся колпачки, чтобы не было утечек на шагах 3 и 7 ниже.)

2. Добавьте 0,5 мл буфера для расщепления ДНК с протеиназой К до конечной концентрации 0,5 мг / мл. (0,5 мг / мл - высокая концентрация и, вероятно, ее можно уменьшить.)

Буфер для расщепления ДНК:

• 50 мМ Трис-HCl pH 8.0
• 100 мМ ЭДТА pH 8,0
• 100 мМ NaCl
• 1% SDS

3. Инкубируйте в течение ночи при 50-55 ° C при легком встряхивании. (На этом этапе механическое перемешивание в значительной степени способствует полному разрушению хвоста.)

4. Пробирки быстрого вращения для удаления раствора внутри крышки.

5. Заполните внутреннюю часть крышки пробирки для микроцентрифугирования вакуумной смазкой. (Для дозирования мы используем смазку для высокого вакуума Dow Corning и шприц объемом 10 куб. См.)

6. Добавьте 0,7 мл нейтрализованного фенола / хлороформа / изоамилового спирта (25: 24: 1).

7. Достаточно энергично перемешайте. (НЕ вортексировать; мы используем клинический ротатор в течение 1 часа.)

8. Прокрутите в микроцентрифуге на максимальной скорости 5 минут и перенесите 0,5 мл верхней фазы в новую микроцентрифужную пробирку. (Используйте P1000 для переноса и осторожно протяните водную фазу через наконечник несколько раз после переноса, если ДНК все еще находится в большой студенистой массе.)

9. Добавьте 1 мл 100% этанола при комнатной температуре и переверните (используя клинический ротатор, если хотите) до образования осадка ДНК. (примерно 1 минута).

10. Прокрутите в микроцентрифуге 5 минут и осторожно удалите супернатант.

11. Добавьте 0,5–1 мл 70% этанола (-20 ° C) и несколько раз переверните.

12. Прокрутите в микроцентрифуге 5 минут и осторожно удалите супернатант.

13. Пробирки быстрого вращения и удалить последнюю каплю раствора этанола с помощью капиллярной пробирки на 25 мкл.

14. Высушите на воздухе при комнатной температуре или в эксикаторе (по желанию, на ночь).

15. Добавьте 100-200 мкл буфера ТЕ и инкубируйте при 65 ° C в течение 15 минут для ресуспендирования ДНК.Проведите ДНК через наконечник P1000 после инкубации при 65 ° C, чтобы помочь суспендировать, если хотите.

16. Используйте 10-20 мкл для расщепления рестриктазами.

17. Общий выход составляет примерно 20-50 мкг ДНК, 0,1-0,25 мкг / мкл.

Очистка ДНК | Методы экстракции ДНК

Основная процедура изоляции

Существует пять основных этапов экстракции ДНК, которые соответствуют всем возможным химическим процессам очистки ДНК: 1) разрушение клеточной структуры с целью создания лизата, 2) отделение растворимой ДНК от клеточного мусора и другого нерастворимого материала, 3) связывание ДНК, представляющая интерес для очищающей матрицы, 4) отмывание белков и других загрязняющих веществ от матрицы и 5) элюирование ДНК.

1. Создание лизата

Первым шагом в любой реакции очистки нуклеиновой кислоты является перевод ДНК / РНК в раствор. Целью лизиса является быстрое и полное разрушение клеток в образце для высвобождения нуклеиновой кислоты в лизат. Существует четыре основных метода лизиса материалов: физические методы, ферментативные методы, химические методы и их комбинации.

Физические методы

Физические методы обычно включают измельчение или дробление образцов для разрушения клеточных стенок или жестких тканей.Распространенным методом физического разрушения является замораживание и измельчение образцов ступкой и пестиком в жидком азоте для получения порошкообразного материала, который затем подвергается химическому или ферментативному лизису. Измельчители могут быть простыми ручными устройствами или автоматизированными, способными разрушать несколько 96-луночных планшетов. Физические методы часто используются с более структурированными исходными материалами, такими как ткани или растения. В других устройствах используется взбивание или встряхивание шариков в присутствии металлических или керамических шариков для разрушения клеток или тканей или обработка ультразвуком для разрушения тканей и лизиса клеток.

Химические методы

Химические методы можно использовать отдельно с материалами, легко поддающимися лизису, такими как клетки культур ткани, или в сочетании с другими методами. Разрушение клеток осуществляется с помощью множества агентов, которые разрушают клеточные мембраны и денатурируют белки. Обычно используемые химические вещества включают детергенты (например, SDS) и хаотропы (например, соли гуанидина и щелочные растворы).

Ферментативные методы

Ферментативные методы часто используются с более структурированными исходными материалами в сочетании с другими методами с тканями, растительным материалом, бактериями и дрожжами.Используемые ферменты способствуют разрушению тканей и прочных клеточных стенок. В зависимости от исходного материала, типичные ферментативные обработки могут включать, среди прочего, лизоцим, зимолазу и литиказу, протеиназу К, коллагеназу и липазу. Ферментативная обработка может быть подвержена высокопроизводительной обработке, но может иметь более высокую стоимость образца по сравнению с другими методами разрушения.

Во многих протоколах часто используется комбинация химического разрушения и другого, поскольку химическое разрушение клеток быстро инактивирует белки, включая нуклеазы.

2. Очистка от лизата

В зависимости от исходного материала, клеточные лизаты могут нуждаться в удалении клеточного дебриса перед очисткой нуклеиновых кислот, чтобы уменьшить перенос нежелательных материалов (белков, липидов и сахаридов из клеточных структур) в реакцию очистки, которые могут закупоривать мембраны или мешать последующие приложения. Обычно очистку проводят центрифугированием, фильтрацией или методом гранул.

Центрифугирование может потребовать больше времени, но оно способно удалить большое количество мусора.Фильтрация может быть быстрым методом, но пробы с большим количеством мусора могут засорить фильтр. Очистка на основе гранул, как и метод, используемый с наборами для подготовки плазмид на основе частиц Promega, может использоваться в автоматизированных протоколах, но может быть перегружена биомассой. После получения очищенного лизата ДНК можно очистить с помощью множества различных химических методов, таких как диоксид кремния, ионный обмен, методы на основе целлюлозы или осаждения.

3. Привязка к матрице очистки

Независимо от метода, используемого для создания очищенного лизата, интересующая ДНК может быть выделена с использованием множества различных методов.Promega предлагает системы выделения геномной ДНК, основанные на лизисе образцов детергентами и очистке путем связывания с матрицами (диоксид кремния, целлюлоза и ионный обмен), к которым в последние годы в первую очередь обращают внимание.

Каждый из этих химических составов может влиять на эффективность и чистоту выделения, и каждый из них имеет характерную связывающую способность. Емкость связывания - это показатель того, сколько нуклеиновой кислоты может связывать химический состав выделения, прежде чем он достигнет емкости системы и больше не будет выделять больше этой нуклеиновой кислоты.Мы можем встроить конструктивные особенности в эти химические соединения, манипулируя условиями связывания для обогащения различных категорий нуклеиновых кислот (например, химические соединения, которые избирательно связывают РНК по сравнению с ДНК или большие по сравнению с маленькими фрагментами).

Химия на основе растворов

Этот тип химии основан не на связующей матрице, а на осаждении спиртом. После образования лизата клеточный мусор и белки осаждаются с использованием высококонцентрированного солевого раствора.Высокая концентрация соли вызывает выпадение белков из раствора, а затем центрифугирование отделяет растворимую нуклеиновую кислоту от клеточного мусора и осажденного белка (1).

Затем ДНК осаждают добавлением изопропанола к высококонцентрированному солевому раствору. Это вытесняет большие молекулы геномной ДНК из раствора, в то время как более мелкие фрагменты РНК остаются растворимыми. Затем нерастворимую ДНК осаждают и отделяют от фрагментов соли, изопропанола и РНК центрифугированием.

Дополнительная промывка осадка этанолом удаляет оставшуюся соль и усиливает испарение. Наконец, осадок ДНК ресуспендируют в водном буфере, таком как Трис-ЭДТА или в воде, свободной от нуклеаз, и после растворения готов к использованию в последующих приложениях.

Химия, связывающая кремнезем

Технология этих систем очистки геномной ДНК основана на связывании ДНК с диоксидом кремния в условиях высокого содержания соли (2–4). Ключом к выделению любой нуклеиновой кислоты с помощью диоксида кремния является присутствие хаотропной соли, такой как гидрохлорид гуанидина.Присутствующие в больших количествах хаотропные соли способны разрушать клетки, дезактивировать нуклеазы и позволять нуклеиновой кислоте связываться с кремнеземом.

После связывания геномной ДНК с мембраной из диоксида кремния нуклеиновую кислоту промывают раствором соли / этанола. Эти промывки удаляют загрязняющие белки, липополисахариды и малые РНК для повышения чистоты, при этом ДНК остается связанной с колонкой с диоксидом кремния. По окончании промывки геномную ДНК элюируют в условиях с низким содержанием соли, используя либо воду, не содержащую нуклеаз, либо ТЕ-буфер.

Связывание с диоксидом кремния не является ДНК-специфическим, поэтому, если требуется чистая ДНК, есть также возможность добавить рибонуклеазу (РНКазу A) в буфер для элюирования. РНК может быть очищена совместно с гДНК, и добавление РНКазы в буфер для элюции обеспечивает удаление подавляющего большинства загрязняющих РНК.

Этот химический состав может быть адаптирован к парамагнитным частицам (PMP), таким как PMP MagneSil® с диоксидом кремния Promega, покрытым диоксидом кремния, или форматам на основе колонок с диоксидом кремния. Хотя оба метода обычно обеспечивают хороший баланс выхода и чистоты, формат колонки с кремнеземной мембраной более удобен.Для автоматической очистки 96-луночные планшеты с диоксидом кремния или PMP MagneSil® легко адаптируются к различным роботизированным платформам.

Для обработки образцов ДНК PMP MagneSil® требует сильного магнита для захвата частиц, а не центрифугирования или вакуумной фильтрации. PMP MagneSil® считаются «подвижной твердой фазой» со связыванием нуклеиновых кислот, происходящим в растворе. Частицы также могут быть полностью ресуспендированы во время этапов промывки протокола очистки, тем самым улучшая удаление загрязняющих веществ.На Рисунке 1 представлены изображения колонки с кремнеземной мембраной и PMP Magnesil®.

Химия связывания целлюлозы

Совсем недавно Promega выпустила на рынок методы выделения ДНК, в которых используется матрица на основе целлюлозы. Нуклеиновая кислота связывается с целлюлозой в присутствии высоких солей и спиртов. Вообще говоря, связывающая способность методов на основе целлюлозы очень высока. Условия могут быть отрегулированы для предпочтительного связывания нуклеиновой кислоты разных видов и размеров. В результате комбинации связывающей способности и относительно небольшого объема элюирования мы можем получить элюаты с высокой концентрацией нуклеиновых кислот.

Химия ионного обмена

Ионообменная химия основана на взаимодействии, которое происходит между положительно заряженными частицами и отрицательно заряженными фосфатами, присутствующими в ДНК. ДНК связывается в условиях с низким содержанием соли, и загрязняющие белки и РНК затем могут быть смыты растворами с более высоким содержанием соли. ДНК элюируется в условиях с высоким содержанием соли, а затем выделяется осаждением этанолом.

4. Мойка

Промывочные буферы обычно содержат спирты и могут использоваться для удаления белков, солей и других загрязняющих веществ из образца или предшествующих связывающих буферов.Спирты дополнительно помогают связывать нуклеиновую кислоту с матрицей.

5. Элюирование

растворима в растворах с низкой ионной силой, таких как TE-буфер или вода, не содержащая нуклеаз. Когда такой водный буфер наносят на мембрану из диоксида кремния, ДНК высвобождается из диоксида кремния, и элюат собирается. Затем очищенная высококачественная ДНК готова к использованию в широком спектре ответственных приложений, таких как мультиплексная ПЦР, связанные системы транскрипции / трансляции in vitro, реакции трансфекции и секвенирования.

При выборе буфера для элюирования важно учитывать требования желаемых последующих процессов. Элюирование и хранение ДНК в буфере TE, например, полезно до тех пор, пока EDTA не влияет на выбранные вами последующие приложения. EDTA хелатирует или связывает магний, присутствующий в очищенной ДНК, и может помочь подавить возможную активность загрязняющих нуклеаз. Если EDTA вызывает беспокойство, мы рекомендуем хранить ДНК в забуференном растворе, так как кислотная природа ДНК может привести к автогидролизу.В качестве альтернативы вы можете использовать буфер TE ^-4 , который представляет собой 10 мм трис-HCl, 0,1 мм EDTA (pH 8,0).

Выделение высокомолекулярной ДНК (HMW-ДНК)

Поскольку протоколы долгочитаемого секвенирования (PacBio, Nanopore) анализируют отдельные молекулы ДНК, успех зависит от высококачественных образцов ДНК. При секвенировании методом связанного чтения 10X Genomics предъявляются такие же высокие требования к образцам в отношении чистоты и целостности, но требуются гораздо меньшие количества. Таким образом, теперь мы предлагаем выделения высокомолекулярной ДНК (HMW-ДНК) в качестве услуги.Применяемые протоколы выделения ДНК будут зависеть от типов образцов. Наши протоколы направлены на выделение образцов HMW-ДНК со средней длиной фрагментов 50 т.п.н. или выше, если образец позволяет. Более длинные фрагменты можно ожидать, например, для клеточных культур или образцов свежей крови. Однако мы не можем обещать никаких конкретных показателей эффективности. Для более крупных проектов мы сначала проверим изоляцию. Услуга выделения HMW-ДНК включает контроль качества образцов ДНК с помощью электрофореза в импульсном поле (PFGE), спектрометрии и флуорометрии.
Образцы ДНК высочайшего качества можно выделить из клеточных культур и образцов свежей крови. Если необходимо использовать образцы тканей, предпочтительны мягкие ткани. В любом случае предоставление стерильных образцов должно быть приоритетом; это означает, что перед быстрым замораживанием по возможности следует удалить кишки, жабры и кожные ткани. Меньшие организмы лучше не кормить в течение определенного периода времени перед сбором, чтобы избежать выделения пищевой ДНК и снизить содержание микробиотиков.

Обратите внимание, что наша лаборатория не предназначена для работы с образцами, потенциально заразными для человека.

Выделение HMW-ДНК из образцов животных:
Образцы клеточных культур : Пожалуйста, отправьте 10-50 миллионов клеток или более для экстракции HMW ДНК. Клетки следует осадить, промыть 1X PBS, удалить супернатант, быстро заморозить в жидком азоте и хранить при -80 ° C. Транспортируйте гранулы клеток на сухом льду. Для секвенирования 10X Genomics достаточно 2 миллионов клеток.
Образцы тканей:
Свежие ткани необходимо мгновенно заморозить в жидком азоте сразу после сбора и хранить при -80 ° C.Замороженный образец следует отправлять на сухом льду. Следует избегать любых циклов замораживания-оттаивания. Пожалуйста, отправьте не менее 500 мг мягких тканей; не считая кишок. Для секвенирования 10X Genomics достаточно 100 мг ткани.
Образцы крови:
Образцы следует собирать свежими с использованием ЭДТА в качестве антикоагулянта. Мы предпочитаем получать образцы свежей крови, отправленные на ночь в холодных упаковках; эти образцы следует временно хранить в холодильнике. Образцы крови также можно мгновенно заморозить в жидком азоте и хранить при -80 ° C.Замороженные образцы следует отправлять на сухом льду. Для выделения ДНК HWM потребуется около 5 мл образца крови млекопитающих (для секвенирования 10X Genomics будет достаточно 2 мл крови; потенциально меньше). Пожалуйста, свяжитесь с нами заранее, чтобы договориться о встрече, если вы планируете отправить образцы свежей крови в ночное время. Если образцы крови поступят в течение двух дней после забора крови, лучше не замораживать образцы; вместо этого всегда держите образцы холодными (холодильник; 4 ° C) и транспортируйте их между большим количеством холодных пакетов.
Образцы растений:
Пожалуйста, отправьте 2-5 г ткани молодых листьев. Быстро заморозьте ткань в жидком азоте и храните при -80. Транспортируйте салфетки на сухом льду.

Для секвенирования большего количества проточных или SMRT-ячеек может потребоваться дополнительный материал.

Наш эксперт по выделению HMW-ДНК - Рута Сахасрабудхе, доктор философии. Пожалуйста, свяжитесь с ней по адресу [email protected], чтобы задать вопросы об извлечении ДНК HMW, секвенировании нанопор и проектах Hi-C.

Мы работаем над внедрением протоколов выделения ДНК растений.

% PDF-1.5 % 365 0 объект > endobj xref 365 40 0000000016 00000 н. 0000002165 00000 н. 0000002322 00000 п. 0000002839 00000 н. 0000003260 00000 н. 0000003697 00000 н. 0000003734 00000 н. 0000003905 00000 н. 0000004019 00000 н. 0000004392 00000 п. 0000004875 00000 н. 0000005218 00000 н. 0000005668 00000 н. 0000006554 00000 н. 0000007362 00000 н. 0000008132 00000 н. 0000008733 00000 н. 0000009515 00000 н. 0000010108 00000 п. 0000010896 00000 п. 0000011611 00000 п. 0000014260 00000 п. 0000014335 00000 п. 0000014432 00000 п. 0000014581 00000 п. 0000016826 00000 п. 0000018760 00000 п. 0000018873 00000 п. 0000018948 00000 п. 0000019261 00000 п. 0000019316 00000 п. 0000019432 00000 п. 0000019556 00000 п. 0000019631 00000 п. 0000019944 00000 п. 0000020019 00000 п. 0000020332 00000 п. 0000028203 00000 п. 0000075467 00000 п. 0000001096 00000 н. трейлер ] / Назад 979697 >> startxref 0 %% EOF 404 0 объект > поток hb``b`yh Ā

Смотрите также

• 
  Выделения на 9 месяце беременности как сопли
• 
  Выделения темная слизь
• 
  Почему могут быть выделения коричневые
• 
  Белые очень густые выделения без запаха
• 
  За неделю до месячных кровяные выделения однократно
• 
  Выделения перед месячными если зачатие произошло
• 
  Красные выделения почему
• 
  Коричневые выделения после менопаузы причины
• 
  От чего бывают коричневые выделения
• 
  Выделения после ампутации матки
• 
  Выделения похожие на молочницу но не молочница