Питательная среда для выделения энтерококков сухая

Проведение анализа:

Исследования образцов проводятся по соответствующим Методическим указаниям и ГОСТам.

Культуры высевают на чашки Петри, равномерно распределяют посевной материал по поверхности среды стерильным шпателем. Инкубируют при температуре (37±1) °С в течение 24-48 ч.

Контроль качества:

Срок годности:  2 года.

Скачать Инструкцию

Скачать РУ

Скачать прайс-лист

Энтерококкагар Оболенск

Frontiers | Пробиотический потенциал и оценка безопасности Enterococcus faecalis OB14 и OB15, выделенных из традиционного тунисского сыра Testouri и Rigouta, с использованием физиологического и геномного анализа

Введение

Энтерококки - нормальные обитатели желудочно-кишечного тракта человека и животных. Эти бактерии распространены в природе повсеместно и используются в пищевой промышленности в качестве пробиотиков (Franz et al., 2003) или в качестве закваски при производстве сыра с высоким содержанием соли и низким pH (Wessels et al., 1991). Они придают характерный вкус традиционным средиземноморским сырам и могут присутствовать в других ферментированных продуктах, таких как колбасы, оливки и овощи. Некоторые штаммы были предложены для консервирования пищевых продуктов, поскольку они продуцируют бактериоцины (энтероцины), антимикробные пептиды, способные подавлять рост пищевых патогенных и вызывающих порчу бактерий (Khan et al., 2010; Franz et al., 2011). Недавно бактериоцины были предложены в качестве нового пробиотического признака при отборе полезных микробов.Большинство энтероцинов принадлежит к бактериоцинам класса II, включая семейство энтероцинов педиоцинов, высокоактивных против Listeria spp (Ness et al., 2014). Некоторые штаммы энтерококков продуцируют одновременно несколько бактериоцинов, что дает им конкурентное преимущество перед другими микробами в плане колонизации и контроля ниши (Hanchi et al., 2018).

В то время как род Enterococcus включает множество видов, лишь немногие из них были изучены для использования в качестве пробиотиков, например E.faecalis , E. faecium , E. lactis и совсем недавно E. hirae (Adnan et al., 2017) и E. durans (Li et al., 2018). Например, около штаммов Enterococcus в настоящее время используются в качестве терапевтических средств и продаются как Cylactins (Hoffmann-La Roche, Базель, Швейцария), Fargo 688s (Quest International, Naarden, Нидерланды), ECOFLOR (Walthers Health Care, DenHaag, Нидерланды). ) или Симбиофлор ​​1 (SymbioPharm, Herborn, Germany) для облегчения симптомов синдрома раздраженного кишечника и рецидивирующего хронического синусита или бронхита (Franz et al., 2003; Foulquié Moreno et al., 2006). Пробиотик E. faecalis Symbioflor 1, клон DSM 16431, первоначально выделенный в 1950-х годах из образца кала здорового взрослого человека, использовался в качестве пробиотика более 50 лет без каких-либо сообщений или документации о каких-либо инфекциях или побочных эффектах. . Полная последовательность генома этого штамма была определена, и несколько токсикологических исследований показали, что этот штамм можно безопасно вводить людям (Domann et al., 2007; Christoffersen et al., 2012; Fritzenwanker et al., 2013). Однако, согласно FDA, пробиотики должны использоваться осторожно группами риска, например, с иммунодефицитом, недоношенными детьми, пациентами, страдающими различными патологиями…

С другой стороны, известно, что некоторые энтерококки являются условно-патогенными микроорганизмами и являются частой причиной внутрибольничных инфекций. Эти бактерии вызывают бактериемию, эндокардит, инфекции мочевыводящих путей или другие инфекции. Недавно роль Е.faecalis при раке поджелудочной железы и колоректального рака также было предложено, но это остается спорным (De Almeida et al., 2018; Maekawa et al., 2018). Одним из факторов, влияющих на патогенность E. faecalis , является устойчивость многих штаммов к широкому спектру антибиотиков (Franz et al., 2003). Эта устойчивость к антибиотикам обусловлена ​​внутренними и / или приобретенными генами, расположенными на хромосоме или на мобильных элементах, включая плазмиды и транспозоны. Устойчивые к ванкомицину энтерококки представляют собой серьезные проблемы при лечении клинических инфекций человека, поскольку этот препарат используется в качестве последнего средства лечения энтерококков с множественной устойчивостью к антибиотикам (Ogier and Serror, 2008).Более того, в последнее десятилетие сообщалось о передаче устойчивости к ванкомицину от E. faecalis к другим патогенам, таким как устойчивый к метициллину Staphylococcus aureus (Palmer et al., 2010). Детерминанты вирулентности также влияют на пригодность и устойчивость энтерококков при внутрибольничных инфекциях. Среди факторов вирулентности, которые можно найти в E. faecalis , некоторые из них спорадически обнаруживаются в изолятах молочных продуктов (Popović et al., 2018), например, вещество агрегации ( asa1 ), желатиназа ( gelE ), адгезин коллагена. ( ace ), энтерококковый поверхностный белок ( esp ) и цитолизин ( cylA ).По этим причинам видов Enterococcus не имеют статуса GRAS или рекомендаций для списка QPS (EFSA Panel on Biological Hazards, Ricci et al., 2017), и необходимо исследовать отсутствие передаваемых генов устойчивости к антибиотикам и / или потенциальных детерминант вирулентности. для каждого нового потенциального пробиотического штамма, предназначенного для использования в пищевой или фармацевтической промышленности.

страны Северной Африки имеют древние традиции в области пищевых технологий. Традиционные молочные продукты и сыр остаются очень популярными в Тунисе, их употребляют на завтрак, после обеда и на ужин.Эти традиционные продукты по-прежнему готовятся на уровне домашних хозяйств и продаются неофициально. Состав этих продуктов часто недостаточно хорошо охарактеризован, различается в зависимости от региона и местных рынков, иногда используется сырье плохого микробиологического качества или при отсутствии гигиенических условий (Benkerroum, 2013). В целях повышения безопасности и качества этих пищевых продуктов, содействия торговле такими традиционными продуктами питания на международном уровне и обеспечения конкурентоспособности на местных рынках странам Северной Африки крайне необходимо разработать и стандартизировать новые закваски или штаммы пробиотиков в соответствии с требованиями. со стандартами Codex Alimentarius, законодательством ВТО, ФАО и EFSA.

В этом контексте целью данной работы была оценка пробиотического потенциала и безопасности E. faecalis OB14 и OB15, двух штаммов, выделенных из традиционных ферментированных тунисских молочных продуктов (сыр Тестури и Ригута), в сравнении с известным пробиотиком. E. faecalis Симбиофлор ​​1 DSM 16431.

Материалы и методы

Отбор проб и выделение молочнокислых бактерий (LAB)

В общей сложности пять образцов тунисских традиционных ферментированных молочных продуктов (сыр Тестури, Ригута, йогурт, Лебен, Райеб) были собраны на местных рынках в разных городах.10 г или 10 мл каждого образца молочных продуктов асептически суспендировали в 90 мл раствора цитрата натрия (pH 7,0) и гомогенизировали путем встряхивания. Каждую суспензию затем серийно разбавляли 0,9% NaCl, высевали на среду Ман-Рогоза-Шарпа (MRS) и инкубировали в течение 48 ч при 37 ° C в анаэробных условиях для выделения молочнокислых бактерий (LAB). Отдельные изолированные колонии собирали и очищали повторным нанесением штрихов, затем выращивали в течение ночи в бульоне MRS при 37 ° C и хранили при -20 ° C в 20% (мас. / Об.) Глицерине.

Обозначение OB14 и OB15

Изоляты LAB были предположительно идентифицированы фенотипическим анализом (морфология колоний, окрашивание по Граму и анализ каталазы), а затем одновременной комбинацией системы MALDI-TOF MS Biotyper и видоспецифического ПЦР.

MALDI-TOF MS Биотипер

Бактерии были идентифицированы путем анализа общего протеома с использованием масс-спектрометра Autoflex III Matrix-Assisted Laser Desorption / Ionization-Time-Of-Flight (MALDI-TOF MS; Bruker, Marcy-l'Etoile, France), соединенного с MALDI- Система Biotyper 3.1, как описано ранее (Hillion et al., 2013; Zommiti et al., 2018). Муравьиная кислота использовалась для удаления пятен бактерий в качестве процедуры быстрой экстракции (Haigh et al., 2011), затем пластина-мишень MALDI была введена в масс-спектрометр для измерения и сбора данных.Для каждого образца были объединены 600 спектров, и полученные спектры сравнивались с базой данных MALDI-Biotyper 3.1. Оценка была рассчитана на основе соответствия между эталонным спектром и неизвестным спектром. Оценка ≥1,7 позволяет идентифицировать род, а оценка ≥2,0 является установленным порогом для идентификации на уровне вида (Sogawa et al., 2011). Дендрограммы были созданы из набора данных минимального остовного дерева (Elbehiry et al., 2017). Для этого основные спектры таксономии биотипов Мальди сравнивались со спектрами, в результате чего была получена матрица баллов перекрестной идентификации.Эта матрица применялась для оценки уровня удаленности бактерий для каждой пары основных спектров.

Видоспецифический ПЦР-анализ

Геномную ДНК экстрагировали согласно Delley et al. (1990). E. faecalis OB14 и OB15 были идентифицированы с использованием видоспецифичных праймеров E. faecalis EflF1 (5'-ACCAATGTTGGCACAAGAAA-3 ') и EflR1 (5'-TTTCGTTCAAG CGGTCTTTT-3'), как описано Park. (2017) с небольшими изменениями. Реакции ПЦР выполняли с помощью Thermo Scientific PCR Master Mix в общем объеме 50 мкл, используя приблизительно 1 мкМ прямого и обратного праймеров и 10 мкг – 1 мкг ДНК-матрицы.Условия амплификации были следующими: первая стадия денатурации при 94 ° C в течение 5 минут, 30 циклов денатурации при 94 ° C в течение 1 минуты, отжиг при 56 ° C в течение 1 минуты, удлинение при 72 ° C в течение 1 минуты, затем заключительный этап удлинения при 72 ° C в течение 10 мин. Продукты ПЦР анализировали с помощью электрофореза в 1% агарозном геле, окрашивали гелем SYBR Safe DNA и исследовали в УФ-свете.

Изоляты E. faecalis OB14 и OB15, оба правильно идентифицированные с помощью MALDI-TOF MS Biotyper и видоспецифической ПЦР, были отобраны для дальнейших экспериментов.Если не указано иное, бактерии обычно предварительно культивировали и культивировали в бульоне MRS при 37 ° C.

Толерантность к кислотам и желчным солям

Для испытания на устойчивость к кислоте метод, описанный Ramos et al. (2013) использовался с некоторыми модификациями. Для имитации кислых условий

Выделение и скрининг полигидроксиалканоатов, продуцирующих бактерии, из отходов целлюлозно-бумажной и картонной промышленности

Предпосылки . Полигидроксиалканоаты (ПГА) представляют собой запасные материалы, которые накапливаются различными бактериями в качестве запасных материалов для энергии и углерода. Это биоразлагаемые, экологически чистые, а также биосовместимые биопластики. В отличие от пластмасс на нефтехимической основе, для полного разложения которых требуется несколько десятилетий, PHA могут быть полностью разложены в течение года под действием различных микроорганизмов до CO ₂ и воды.В настоящем исследовании мы стремимся использовать осадок и сточные воды целлюлозно-бумажной и картонной промышленности для изоляции и анализа полигидроксиалканоатов (ПГА), аккумулирующих бактерии, и производства экономически эффективных ПОБ с использованием сточных вод картонной промышленности. Результаты . В общей сложности 42 изолята показали черно-синюю окраску при окрашивании суданом черным B, агентом предварительного скрининга липофильных соединений, и в общей сложности 15 изолятов показали положительный результат с окрашиванием нильским синим A, более специфическим красителем для гранул PHA.Изоляты NAP11 и NAC1 показали максимальное производство ФГА 79,27% и 77,63% при концентрации полимера 5,236 г / л и 4,042 г / л со сточными водами картонной промышленности. Оба выбранных изолята, NAP11 и NAC1, были классифицированы до уровня рода путем изучения их морфологических и биохимических характеристик и оказались Enterococcus sp., Brevundimonas sp. и, соответственно. Заключение . Изоляты Enterococcus sp . NAP11 и Brevundimonas sp .НАК1 можно рассматривать как хорошие кандидаты для промышленного производства ПОБ из сточных вод картонной промышленности. Мы впервые сообщаем об использовании сточных вод картонной промышленности в качестве среды для выращивания при производстве ПОБ.

1. Введение

Пластиковые материалы, которые повсеместно использовались в нашей повседневной жизни, теперь вызывают серьезные экологические проблемы. Ежегодно в окружающей среде накапливаются миллионы тонн этого неразлагаемого пластика. Одним из решений является переработка использованных пластиковых материалов.Другим решением для уменьшения остатков пластика является использование биоразлагаемых пластиков [1, 2], среди которых много внимания привлекают полигидроксиалкановые кислоты (ПГА). Полигидроксиалкановые кислоты (ПГА) являются общими внутриклеточными соединениями, обнаруженными у бактерий, архей и некоторых эукариот, таких как дрожжи и грибы. ПГА - это углеродные и энергетические резервные полимеры, образующиеся в некоторых микроорганизмах, когда источник углерода в изобилии, а другие питательные вещества, такие как азот, фосфор, кислород или сера, ограничены. Установлено, что ПГА накапливаются в различных микроорганизмах в качестве резервного пищевого материала, например, в Alcaligenes latus, Ralstonia eutropha, Azotobacter beijerinckii, Bacillus megaterium и Pseudomonas oleovorans , включая некоторые грибы и археи.Среди представителей семейства PHA полигидроксибутират (PHB) является наиболее распространенным биоразлагаемым полимером и многообещающей альтернативой синтетическим неразлагаемым пластмассам. Эти полимеры представляют собой накапливаемые внутриклеточные мембраны, содержащие до 90% сухого веса клетки в условиях стресса питательными веществами, и действуют как запас энергии. Он имеет механические свойства, аналогичные свойствам обычных пластиков, полученных из нефти, таких как полипропилен или полиэтилен, которые можно формовать, изготавливать в пленки, прядать в моноволокна и использовать для изготовления гетерополимеров с другими синтетическими полимерами и для многих других применений в сельском хозяйстве, упаковке и область медицины является биоразлагаемой, а также иммунологически совместимой с тканями человека [3].Недавно сообщалось о другом применении PHA в качестве биотоплива [4].

Несмотря на эти интересные свойства, промышленное производство PHA еще не налажено. В 1950-х годах североамериканская компания W.R. Grace Co. сделала первую попытку производить ПОБ на коммерческом уровне. Однако этот процесс не увенчался успехом из-за низкой эффективности производства и отсутствия подходящего метода очистки. Затем, в 1970-х годах, Imperial Chemical Industries (ICI, Великобритания) начала производить PHA с использованием мутантного красителя Cupriavidus necator , NCIB 11599 из различных источников углерода, таких как 1,4-бутандиол, 1,6-гександиол и бутиролактон.Коммерческий продукт получил название «Биопол». Позднее патенты были проданы Zeneca, затем Monsanto и в настоящее время являются собственностью Metabolix, Inc. (США). На коммерческой основе также производятся некоторые другие продукты из биополиэфиров с другим мономерным составом под торговыми названиями, например поли (3HB-co-3HV) Nodax, поли (3-гидроксибутират-со-3-гидроксиалканоат) поли (3HB-co-3HA) как Biogreen. и поли (3HB) в качестве биомера [5]. Но крупномасштабное производство было остановлено на коммерческом уровне из-за высокой стоимости производства по сравнению с пластиками, полученными из нефти [1, 6].С целью коммерциализации PHA были предприняты большие усилия для снижения стоимости производства за счет разработки бактериальных штаммов и более эффективного процесса ферментации / восстановления [7, 8]. Из литературных источников было обнаружено, что основными затратами при производстве этого биополимера является стоимость субстрата [9, 10], которая составляет более 50% стоимости производства [5, 11] и определяет разницу в цене полимера. -3-гидроксибутират (P3HB) от Biomer примерно в 12 раз дороже полипропилена [12].Чтобы решить эту проблему, недорогой субстрат, возобновляемые субстраты, отходы и сточные воды используются в качестве источника питательных веществ для микроорганизмов для производства PHA. Для производства ПОБ использовались различные типы отходов, поскольку он обеспечивает двойную выгоду - утилизацию отходов и рентабельное производство биоразлагаемого микробного биопласта.

Картонная промышленность - одна из составляющих целлюлозно-бумажной и упаковочной промышленности. Картонная промышленность включает две основные отрасли: производство гофрокартона и производство гофрокартона или картона.Сточные воды химической и механической варки целлюлозы содержат 12-25 кг БПК / т АДФ, но сбросы БПК в 3-10 раз выше при химико-механической варке целлюлозы по сравнению с механической варкой. Азот и фосфор также присутствуют в сточных водах и выделяются в процессе варки сырья, такого как древесина, сельскохозяйственные отходы и бумажные отходы. Сточные воды целлюлозно-картонных заводов обычно богаты углеводами, но бедны фиксированным азотом. Если мы рассмотрим сценарий Индии, целлюлозно-картонная промышленность около 905 г.Ежегодно потребляется 8 млн. М 3 ³ воды и около 695,7 млн. М 3 ³ сточных вод. Наибольшая часть пресной воды используется для формирования листа на картоноделательной машине (200 м ³ h ⁻¹ ), а наименьшее количество используется для подготовки массы (90 м ³ h ⁻¹ для сгущения). ). Более того, переработка потока отходов в очищенные сточные воды требует больших усилий и очень трудна, поскольку поток отходов часто содержит различные органические соединения.Таким образом, вместо дорогостоящей очистки мы можем использовать сточные воды непосредственно для культивирования микроорганизмов, накапливающих ПОБ. В этом исследовании бактериальные штаммы, накапливающие полигидроксиалкановые кислоты (ПГА), были выделены и проверены с использованием сточных вод картонной промышленности в качестве единственного источника углерода с двойным преимуществом утилизации отходов и рентабельного производства биоразлагаемых микробных биопластов.

2. Материал и методы

2.1. Выделение бактерий, продуцирующих полигидроксиалкановую кислоту (PHA)

Для выделения бактерий, продуцирующих PHA, активный ил и сточные воды были собраны из целлюлозно-бумажной и картонной промышленности целлюлозно-бумажных комбинатов Ханна в Амритсаре и Топара Курдхе, Ямуна Нагар, Индия соответственно.До анализа образцы хранили при комнатной температуре. В 99 мл стерилизованной воды растворяли 1 г образца осадка. Затем образец был серийно разбавлен стерильной дистиллированной водой с последующим посевом на питательную агаровую среду с 1% глюкозой. Для выделения из пробы сточной воды 1 мл пробы воды добавляли в 99 мл стерилизованной воды. После серийного разведения (от 10 ^-3 до 10 ^-7 ) 1 мл каждого разведения наносили на чашку с обогащенным углеродом питательным агаром. Для быстрого обнаружения и выделения бактерий, продуцирующих ПОБ, 0.02% спиртовой раствор суданского черного B применяли для окрашивания колоний бактерий и планшеты оставляли в покое в течение 30 минут. Затем сливали избыток красителя и осторожно ополаскивали планшеты, добавляя 100% этанол. Колонии, неспособные вместить суданский черный B, выглядели белыми, а производители PHB - голубовато-черными [13].

2.2. Скрининг бактерий-продуцентов PHA

Суданский черный B-положительные изоляты проверяли на продуцирование PHA с помощью окрашивания Нильским синим A, более специфичного красителя для полигидроксиалкановой кислоты (PHA) с помощью более быстрого и чувствительного метода жизнеспособных колоний [14].Этот краситель при концентрациях всего 0,5 мкг г / мл был непосредственно включен в богатую углеродом питательную агаровую среду (глюкоза 1%, экстракт говядины 0,3%, пептон 0,5%, хлорид натрия 0,8% и агар 1,5%) и рост клетки происходили в присутствии красителя. Это позволило оценить присутствие PHA в жизнеспособных колониях в любое время во время эксперимента по выращиванию и четко различить PHA-отрицательные и PHA-положительные штаммы. Колонии, накапливающие ФГА, после окрашивания Нильским синим А проявляли ярко-оранжевую флуоресценцию при облучении УФ-светом, и их интенсивность флуоресценции возрастала с увеличением содержания ФГА в бактериальных клетках.Изоляты, которые показали ярко-оранжевую флуоресценцию при облучении УФ-светом после окрашивания А Нильским синим, были выбраны в качестве аккумуляторов ФГА.

2.3. Предварительная обработка сточных вод картонной промышленности

Неочищенные сточные воды картонной промышленности собирали из картонной промышленности, Топара Курд, Ямуна Нагар, Харьяна, Индия, и хранили при 4 ° C до использования для анализа. Стоки сначала фильтровались через муслиновую ткань, а затем через грубую фильтровальную бумагу для удаления нежелательных взвешенных твердых материалов из сточных вод.После этой стадии предварительной обработки сточные воды картонной промышленности использовали в качестве среды для количественного определения и производства для производства PHA отобранными бактериями.

2.4. Экстракция и количественный анализ PHA

. Образование ПОБ наблюдали в 250 мл колбе Эрленмейера, содержащей 50 мл очищенных сточных вод картонной промышленности, в качестве производственной среды при стационарных условиях роста. После 72 ч инкубации при 37 ° C культуральный бульон центрифугировали при 8000 об / мин в течение 15 мин. Осадок вместе с 10 мл гипохлорита натрия инкубировали при 50 ° C в течение 1 ч для лизиса клеток.Полученный клеточный экстракт центрифугировали при 12000 об / мин в течение 30 мин, а затем последовательно промывали дистиллированной водой, ацетоном и абсолютным этанолом. После отмывки осадок растворяли в 10 мл хлороформа (сорта AR) и инкубировали в течение ночи при 50 ° C и упаривали при комнатной температуре [15]. После упаривания к нему добавляли 10 мл серной кислоты и помещали на водяную баню на 10 мин при 100 ° C. Это превращает полигидроксиалкановые кислоты (ПГА) в кротоновую кислоту, которая дает максимальное поглощение при 235 нм [16, 17].PHB (Sigma Aldrich) использовали в качестве стандарта для построения стандартной кривой. Для количественного анализа PHA культуру клеток выращивали, как описано ранее, а осадок клеток сушили для оценки сухой массы клеток (DCW) в единицах г / л [18]. Остаточную биомассу оценивали как разницу между сухой массой клеток и сухой массой экстрагированного ФГА [19]. Это было рассчитано для определения клеточного веса и накопления, отличного от PHA. Процент внутриклеточного накопления PHA оценивается как процентный состав PHA, присутствующий в сухой массе клеток:

2.5. Морфологическая характеристика и биохимическая идентификация бактерий, продуцирующих PHA.

Микроскоп Stereo Olympus использовали для наблюдения за морфологией бактериальных колоний, выращенных на питательном агаре. Характеристики роста, такие как структура, форма, цвет, край, характеристики поверхности, поверхность вверх, запах, высота, непрозрачность, конец клеток, расположение клеток и окрашивание по Граму бактериальных колоний наблюдались для характеристики бактериальных колоний.

Различные биохимические тесты были выполнены на отобранных бактериях-продуцентах ПОБ, а именно: тест продукции индола, метиловый красный и Фогес-Проскауэр, тест утилизации цитрата и продукция H ₂ S для их биохимической характеристики.Ферментативное использование различных углеводов также отслеживалось в течение 48 часов при 37 ° C путем инокуляции изолятов отдельно в определенной среде, в которую были добавлены различные сахара, такие как ксилоза, манноза, мальтоза, сахароза, рафиноза, декстроза, трегалоза, фруктоза, глюкоза, рибоза, были добавлены лактоза, рамноза, эскулин, инулин, маннит, арабиноза, сорбит и мелибиоза.

2.6. Полимерный анализ

2.6.1. ¹ H-ЯМР-спектроскопия и термогравиметрический анализ (TGA)

Идентичность индивидуального мономерного звена подтверждали спектроскопией протонного ядерного магнитного резонанса ( ¹ H-ЯМР). ¹ H-ЯМР-спектры получали растворением полимера в дейтерохлороформе (CDCl ₃ ) при концентрации 10 мг / мл и анализировали на спектрометре Bruker Avance II 500 при 22 ° C с шириной импульса 7,4 мс (30 ° C). угол импульса), повторение импульсов 1 с, ширина спектра 10330 Гц и 65 536 точек данных. Тетраметилсилан использовали в качестве стандарта внутреннего сдвига. Термогравиметрический анализ (ТГА) проводили с использованием прибора ТГА (Mettler-Toledo, TGA / SDTA 851, США), калиброванного по индию.Температуру увеличивали со скоростью нагрева 10 ° C / мин в атмосфере азота до температуры (700 ° C), значительно превышающей температуру разложения полимеров.

2.7. FT-IR анализ

FT-IR анализ образца полимера проводили на спектрофотометре MB-3000, ABB FTIR в диапазоне 4000–600 см ^–1 .

2,8. Анализ ГХ-МС

Очищенный полимер, приготовленный, как описано ранее, растворяли в 2 мл хлороформа, затем добавляли 2 мл метанола, подкисляли 3% (об. / Об.) H ₂ SO ₄ и нагревали при 100 ° C для 3.5 ч для деполимеризации и метанолиза полиэфиров и 3 мкл л вводили в модель GCMS-QP 2010 Plus. Образцы вводили в режиме без разделения, при температуре ввода 260 ° C и температуре термостата колонки 100 ° C.

3. Результат и обсуждение

3.1. Выделение и отбор бактерий, продуцирующих PHA

Известно, что многие бактерии накапливают PHA. Сегодня известно, что около 150 различных гидроксиалкановых кислот включены в полигидроксиалканоаты [20], причем, как сообщается, эти полиэфиры накапливаются микроорганизмами из более чем 90 родов [21].Об этих бактериях сообщалось из различных сред, но лишь некоторые из них - из экосистем сточных вод и ила. Для быстрого обнаружения и выделения бактерий, продуцирующих ПОБ, использовали метод окраски жизнеспособных колоний 0,02% -ным спиртовым раствором суданского черного B и нильского синего A [14]. Выделение бактерий, продуцирующих ПГА, производилось из сточных вод производства картона, целлюлозного картона и шлама крафт-бумаги. Большая часть - около 35% изолированных бактерий - продуцирует PHA в качестве запасного материала.В общей сложности 42 изолята показали черно-синюю окраску при окрашивании суданом черным B, агентом предварительного скрининга липофильных соединений, и в общей сложности 15 изолятов показали положительный результат с окрашиванием нильским синим A (рис. 1), специфическим красителем для Гранулы PHA. И грамположительные, и грамотрицательные бактерии показали продукцию PHA, но грамположительные бактерии доминировали в микрофлоре отходов целлюлозно-бумажной промышленности и производства картона. Teeka et al. [22] использовали этот метод для скрининга бактерий, потенциально продуцирующих PHA, из почвы, а Рамачандран и Абдулла [23] также наблюдали колонии, образовавшиеся на богатой питательными веществами среде, в ультрафиолетовом свете (УФ) для выявления розовой флуоресценции, указывающей на присутствие PHA. производители.Китамура и Дои [24] впервые продемонстрировали метод создания жизнеспособных колоний на чашках с агаром; они вынуждали изоляты накапливать ФГА путем культивирования в среде Е ₂ , содержащей 2% (мас. / об.) глюкозы, перед окрашиванием А нильским синим. Колонии, накапливающие ФГА, после окрашивания А нильским синим проявляли ярко-оранжевую флуоресценцию при облучении УФ-светом, и их интенсивность флуоресценции увеличивалась с увеличением содержания ФГА в бактериальных клетках.

3.2. Производство, экстракция и оценка PHA со сточными водами картонной промышленности в качестве единственного источника углерода

PHA-положительные изоляты, отобранные после окрашивания Нильским синим A, выращивали в 50 мл сточных водах картонной промышленности в колбах Эрленмейера и использовали для экстракции PHA после окрашивания. 2 дня инкубации в стационарных условиях роста.ПГА из изолятов экстрагировали методом гипохлорита и хлороформа [15], как описано ранее. Изоляты NAP11 и NAC1 показали максимальное продуцирование ФГА 79,27% и 77,63% (таблица 1) со сточными водами картонной промышленности и были отобраны для дальнейшей биохимической идентификации и химической характеристики.

% PDF-1.6 % 193 0 объект> endobj xref 193 37 0000000016 00000 н. 0000002896 00000 н. 0000003008 00000 п. 0000003136 00000 п. 0000003550 00000 н. 0000004287 00000 н. 0000004699 00000 н. 0000005436 00000 н. 0000006076 00000 н. 0000006617 00000 н. 0000006941 00000 п. 0000007490 00000 н. 0000007857 00000 н. 0000007911 00000 п. 0000007963 00000 н. 0000008708 00000 н. 0000009364 00000 н. 0000010044 00000 п. 0000010641 00000 п. 0000011201 00000 п. 0000012214 00000 п. 0000013071 00000 п. 0000013343 00000 п. 0000013680 00000 п. 0000013832 00000 п. 0000014404 00000 п. 0000014999 00000 н. 0000015553 00000 п. 0000022153 00000 п. 0000025114 00000 п. 0000031941 00000 п. 0000035318 00000 п. 0000035762 00000 п. 0000035870 00000 п. 0000035937 00000 п. 0000035982 00000 п. 0000001036 00000 н. трейлер ] >> startxref 0 %% EOF 229 0 obj> поток x ڼ VoSU ?.[urºGuRj0: fqhM% s ޶ + ƤcʻU; F08G 0`T`2 / 4j1sn $ 7 |

Выделение, молекулярная характеристика и пробиотический потенциал молочнокислых бактерий в сыром и ферментированном молоке Саудовской Аравии

Пробиотические бактерии могут принести пользу здоровью желудочно-кишечного тракта человека. Молочнокислые бактерии (LAB) являются кандидатами в пробиотические бактерии, которые широко распространены в природе и могут использоваться в пищевой промышленности. Цель этого исследования - выделить и охарактеризовать LAB, присутствующие в сыром и ферментированном молоке в Саудовской Аравии. Девяносто три подозреваемых LAB были выделены из тринадцати различных типов сырого и ферментированного молока местных животных Саудовской Аравии.Идентификация сорока шести отобранных штаммов LAB и их генетическое родство было выполнено на основе сравнения последовательностей гена 16S рДНК. Ни один из штаммов не проявил устойчивости к клинически значимым антибиотикам или какой-либо нежелательной гемолитической активности, но они различались по другим своим пробиотическим характеристикам, то есть толерантностью к кислому pH, устойчивостью к желчи и антибактериальной активностью. В заключение, изоляты Lactobacillus casei MSJ1, Lactobacillus casei Dwan5, Lactobacillus plantarum EyLan2 и Enterococcus faecium Gail-BawZir8, скорее всего, являются лучшими с пробиотическим потенциалом.Мы предполагаем, что изучение синергетических эффектов комбинаций бактерий может привести к более эффективному пробиотическому потенциалу. Мы подозреваем, что сырые и кисломолочные продукты животного происхождения в Саудовской Аравии, особенно лабан из верблюжьего молока, богаты LAB и обладают многообещающим пробиотическим потенциалом.

1. Введение

Пробиотические бактерии могут принести пользу здоровью желудочно-кишечного тракта человека [1–3]. Молочнокислые бактерии (LAB) являются кандидатами в пробиотические бактерии [4], которые широко распространены в природе и могут использоваться в пищевой промышленности [5].LAB - это группа микроаэрофильных или анаэробных грамположительных бактерий, которые не могут образовывать споры или продуцировать каталазу и характеризуются отсутствием системы цитохрома [6, 7] и способностью продуцировать антимикробные препараты для биоконсервации [8, 9]. Некоторые продукты, в том числе молочные продукты, например йогурт, считаются хорошими источниками пробиотиков [10]. Большая часть микробиоты сырого молока и кисломолочных продуктов включает в себя роды Lactobacillus , Enterococcus , Lactococcus , Leuconostoc , Pediococcus , Oenococcus , 000, 000, Streptococcus 000, Carnobacter 000 и Carnobacter. [11–13].Наиболее очевидные преимущества LAB-ферментации включают улучшенный вкус пищи и увеличенный срок хранения [14]. LAB обычно считаются безопасными (GRAS), поскольку они способны продуцировать бактериоцины, и их потребление дает несколько преимуществ для здоровья, таких как контроль кишечных инфекций, улучшение утилизации лактозы, снижение уровня аммиака в крови, обеспечение эффективной устойчивости к желудочной кислоте и желчи [11, 15–19], влияя на иммунную систему и снижая уровень холестерина в сыворотке [20, 21].LAB также прилипают к желудочно-кишечному тракту и подавляют патогены [11, 22, 23]. Интересно, что присутствие LAB не приводило к изменениям или небольшим изменениям в численности других групп кишечных микробов [24].

Молекулярная идентификация гена 16S рРНК на основе ДНК позволяет различать близкородственные виды бактерий [25–29]. Рестрикционный анализ амплифицированной рибосомной ДНК (ARDRA) и случайно амплифицированная полиморфная ДНК (RAPD) были успешно использованы для распознавания LAB [30, 31].Подходы включают ПЦР-ПДРФ с последующим прямым секвенированием гена 16S рДНК и поиск BLAST против последовательностей других организмов, которые доступны в Национальном центре биотехнологической информации (NCBI) [32].

Выделение, идентификация и характеристика новых штаммов LAB имеют два преимущества. Первый - выявить характерную таксономию LAB, а второй - получить многообещающие полезные и функциональные пробиотические LAB [33, 34]. Существует мало исследований, касающихся выделения и характеристики LAB из молочных продуктов.Таким образом, цель настоящей работы состояла в том, чтобы изолировать и идентифицировать на молекулярном уровне молочнокислые бактерии, содержащиеся в сыром молоке и ферментированном молоке, которые были произведены в Саудовской Аравии. Эти LAB были оценены по их функциональным характеристикам, пробиотическим свойствам и способности подавлять рост патогенных бактерий и бактерий, вызывающих пищевые отравления.

2. Материалы и методы

2.1. Образцы и носители

В этом исследовании использовались тринадцать (0,5 кг) образцов сырого молока и традиционного ферментированного молока от местных животных, добытых в провинции Джидда, Саудовская Аравия.Эти образцы были собраны на местном рынке и хранились в холодильнике до использования. Агар MRS и бульонная среда MRS (Oxoid ^TM , Thermo Fisher Scientific, США) использовались для выделения и поддержки роста LAB, а также для подавления роста нежелательных бактерий [35]. Для подсчета LAB также использовали агар MRS и бульон. Для выделения стрептококков в молочных продуктах использовали агар M17 и бульон M17 (Oxoid, Thermo Fisher Scientific, США) [36, 37]. Кровяной агар (Oxoid, Thermo Fisher Scientific, США) и агаровые среды Мюллера-Хинтона (MHA) (HiMedia, Индия) использовали для оценки гемолитической активности и антимикробной активности LAB соответственно.

2.2. Выделение LAB и метод поддержания

50 г образцов помещали в стерильные пакеты для стомахера, а затем разбавляли (1:10) бульоном MRS, обрабатывали для обогащения LAB путем выщелачивания, герметизировали и инкубировали в течение ночи при 30 ° C [ 38]. Молочнокислые бактерии выделяли серийными 5-кратными разведениями. Вначале 1 мл образца желудка добавляли к 9 мл стерильной физиологической воды (0,85% NaCl) и затем последовательно разбавляли. Затем аликвоты по 0,1 мл подходящих разведений образцов высевали на агар MRS и агар M17.Планшеты инкубировали при 37 ° C в течение 24-48 ч в анаэробных сосудах с использованием анаэробной системы AnaeroGen ™ (Oxoid, Thermo Fisher Scientific, США) [25, 39, 40] и в микроаэробных условиях (5% CO ₂ ). [41]. Чашки с агаром MRS использовали для подсчета начального роста LAB в каждом образце [25]. Все эксперименты проводили в трех повторностях. Полученные изоляты случайным образом отбирали с поверхности среды и дважды наносили штрихами на свежий MRS для очистки [35]. Выделенные штаммы поддерживали путем их культивирования в среде бульона MRS при 30 ° C, а затем хранения при -80 ° C в бульоне MRS, содержащем 50% (об. / Об.) Глицерина.Во всех последующих экспериментах использовали бульон MRS и бульон M17 [42, 43]. Изоляты из запасов субкультивировали в бульоне MRS для дальнейших исследований.

2.3. Фенотипическая и генотипическая идентификация

Для всех выделенных штаммов морфологию колоний на твердой среде MRS и агаре M17 определяли визуально, а их подвижность регистрировали с использованием метода висячей капли. Окрашивание по Граму проводили для определения морфологии клеток и реакции окрашивания по Граму изолятов.Также были проведены тесты на каталазу и цитохромоксидазу [39, 42]. Что касается генотипической идентификации, осадок клеток собирали из 2 мл ночных культур (до 2 × 10 ⁹ бактериальных клеток) LAB, выращенных в бульоне MRS, путем центрифугирования в течение 10 мин при 5000 × g, а супернатант отбрасывали. Затем экстракцию ДНК проводили с использованием набора для очистки геномной ДНК GeneJET (номер по каталогу K0721, Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США) в соответствии с инструкциями производителя. Была проведена ПЦР, и были сконструированы и синтезированы универсальные праймеры (Medicbiotrade, Германия) для амплификации почти всей области гена 16S рДНК; праймеры были 16S: F27 (прямой: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ') и 16S: R27 (обратный: 5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3').Праймеры были разработаны для амплификации гена 16S рДНК (~ 1,6 т.п.н., [44]) с содержанием GC 50-60% для более высокой температуры плавления (Tm), чтобы избежать неспецифической амплификации [39]. Условиями ПЦР были один цикл из 5 минут начальной денатурации при 95 ° C, за которым следовали 35 циклов амплификации. Каждый цикл состоял из денатурации при 95 ° C в течение 30 секунд, отжига при 58 ° C в течение 30 секунд и удлинения при 72 ° C в течение 1 минуты. Последний цикл был 10 мин при 72 ° C в качестве этапа после растяжения. Электрофорез в 0,5x буфере TBE проводили на 0.8% агарозный гель для ампликонов со стандартом ДНК 1 т.п.н. (TrackIt, Invitrogen, Waltham, MA, USA), и гели окрашивали бромидом этидия и фотографировали. Ампликоны были очищены, их секвенировали по гену 16S в Macrogen Inc. (Сеул, Корея) и провели поиск с использованием BLAST для обнаружения аналогичных последовательностей в базе данных NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov ) с помощью программы Discovery Studio Gene v1.5 (DSGene v1.5) [32, 42]. Далее использовали фрагмент ~ 1000 нуклеотидов, включающий пять вариабельных (V) участков.Метрики двоичных данных были введены в TFPGA (версия 1.3) и были проанализированы с использованием качественного метода для получения коэффициента сходства. Коэффициенты несходства использовались для построения дендрограмм с помощью метода последовательной иерархической и вложенной кластеризации (соединение соседей (NJ)) с NTSYSpc (версия 2.10, Exeter Software).

2.4. Чувствительность к антибиотикам, гемолитическая активность и толерантность к кислотной желчи

Чувствительность идентифицированных LAB к антибиотикам определяли с использованием метода диффузии на агаровых дисках [45].Пятнадцать антибиотиков (Oxoid, Thermo Fisher Scientific, США) были отобраны как представители различных классов клинически важных антибиотиков. Инокуляты (10 ⁶ КОЕ / мл ^-1 ) LAB наносили мазками на поверхность чашек с агаром Мюллера-Хинтона, а затем на диски антибиотиков (амоксициллин / 25 мкг г, пенициллин G / 10 единиц, цефтриаксон / 30 μ г, цефокситин / 30 μ г, тобрамицин / 10 μ г, оксациллин / 1 μ г, бацитрацин / 10 единиц, хлорамфеникол / 30 μ г, полимиксин B / 300 единиц , гентамицин / 10 μ г, неомицин / 30 μ г, клиндамицин / 2 μ г, ванкомицин / 256 μ г, нитрофурантоин / 300 μ г и налидиксовая кислота / 30 μ г ) наносили на поверхность планшетов и инкубировали при 37 ° C и 5% CO ₂ в течение 24 ч [17, 46].Планшеты проверяли на наличие зон ингибирования вокруг дисков с антибиотиками [43]. Ингибирующий эффект антибиотиков выражали диаметром (мм) зон ингибирования.

Бактериальные клетки выращивали на колумбийском кровяном агаре (Oxoid, Thermo Fisher Scientific, США) с добавлением 5% (об. / Об.) Человеческой крови (полученной из больницы Университета Короля Абдулазиза, Джидда, штат Калифорния) для определения их способности продуцировать различные виды гемолизинов. Планшеты инкубировали при 37 ° C в анаэробных сосудах (Oxoid, Thermo Fisher Scientific, США) с наборами для генерации газа.После 24-часового и 72-часового инкубационных периодов результаты были записаны. Чистая зона на пластинах с кровяным агаром считалась положительным результатом [42].

Толерантность LAB к кислоте и желчи определяли, как описано [47]. Все штаммы выращивали при 37 ° C в течение 24 часов в бульоне MRS и суспендировали до приблизительной концентрации клеток 10 ⁸ КОЕ / мл ^-1 (с использованием стандарта мутности McFarland 0,5) в бульоне MRS, доведенном до pH 3,0, в течение 2 часов. , а затем клетки инкубировали в 0.5% желчи (Sigma-Aldrich, Франция) в течение 4 ч. Эти условия были выбраны для представления времени, необходимого бактериям для прохождения через желудочно-кишечный тракт, а также значения pH и концентрации желчи в желудке и кишечнике, соответственно. Жизнеспособность бактерий оценивали путем подсчета на чашках с агаром MRS в нулевое время и в конце инкубации.

2,5. Оценка антибактериальной активности идентифицированных штаммов